Summary
En ny art af cellulær prionprotein (PrP
Abstract
Den centrale hændelse i patogenesen af prionsygdomme involverer en omdannelse af værten-kodede cellulære prionprotein PrP ° i dets patogene isoform PrP Sc 1. PrP C er detergent-opløselig og følsom over for proteinase K (PK)-fordøjelse, mens PrPsc danner detergent-uopløselige aggregater, og er delvis resistente over for PK 2-6. Omdannelsen af PrP ° til PrPsc er kendt for at involvere en konformationel forandring af α-helical til β-sheet struktur af proteinet. Imidlertid er in vivo-reaktionsvej stadig dårligt forstået. En foreløbig endogen PrP Sc, mellemliggende PrP * eller "silent prion", har endnu ikke identificeret i den uinficerede hjerne 7.
Ved hjælp af en kombination af biofysiske og biokemiske metoder, vi identificerede uopløselige PrP C aggregater (betegnet iPrP C) fra inficerede pattedyr hjerner og dyrkede neuronalceller 8, 9. Her beskriver vi detaljerede procedurer ved disse metoder, herunder ultracentrifugering i detergent buffer, sucrose trinvis gradient sedimentation, størrelseseksklusion kromatografi, iPrP berigelse af gen 5-protein (G5p) som specifikt binder til strukturelt ændrede PrP former 10 og PK-behandling. Kombinationen af disse fremgangsmåder isolerer ikke bare uopløselige PrPsc og PrP ° aggregater, men også opløselige PrP ° oligomerer fra den normale menneskelige hjerne. Eftersom protokollerne beskrevet her har været anvendt til at isolere både PrP Sc fra inficerede hjerner og iPrP C fra ikke-inficerede hjerner, de giver os mulighed for at sammenligne forskelle i fysisk-kemiske egenskaber, neurotoksicitet og infektivitet mellem de to isoformer. En sådan undersøgelse vil i høj grad forbedre vores forståelse af de infektiøse proteinholdige patogener. Fysiologi og patofysiologi iPrP C er uklart på nuværende tidspunkt. Især i en nyligt identified mennesker prionsygdom betegnes trinløst proteasefølsomme prionopathy, fandt vi en ny PrPsc, der deler den immunoreaktive adfærd og fragmentering med iPrP C 11, 12. Desuden har vi for nyligt vist, at iPrP C er det vigtigste arter, som vekselvirker med amyloid-β-protein i Alzheimers sygdom 13. I den samme undersøgelse blev disse fremgangsmåder anvendt til at isolere Abeta aggregater og oligomerer ved Alzheimers sygdom 13, tyder deres anvendelse til ikke-prion-proteinaggregater involveret i andre neurodegenerative lidelser.
Protocol
1. Fremstilling af hjernehomogenat og detergent-opløselige (S2) og-Uopløseligt (P2) Fraktioner
- Tag 100 mg frosset humant hjernevæv, og der tilsættes 100 pi lysisbuffer (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,5% Nonidet P-40 (NP-40), 0,5% EDTA, pH 7,4).
- Homogenisere den på is med pistil drevet af en batteridrevet motor, fryse den i tøris i 5 minutter og homogeniseres igen med pistil drevet af hænder først og derefter ved motoren, og der tilsættes 300 gl eller 800 pi lysisbuffer (dette er enten 20 % eller 10% total hjernehomogenat, henholdsvis).
- Centrifugeres 20% eller 10% total hjernehomogenat ved 1.000 x g i 10 minutter ved 4 ° C for at opsamle supernatant (S1) under anvendelse af en bordcentrifuge.
- Ultracentrifuge 10% S1 ved 35.000 rpm (100.000 x g) i en SW55 rotor (Beckman Coulter, Fullerton, CA) i 1 time ved 4 ° C. Overfør supernatanterne (S2), der indeholder detergent-opløselige fraktion til et rent glas. Resuspendere pellets, der indeholder detergent-uopløseligfraktion (P2) i 100 ul eller 200 ul af lysisbuffer at 10 - eller 5-dobbelt koncentreret præparat.
- For PK-fordøjelsen, inkuberes prøven med de samme mængder PK ved 50 ug / ml ved 37 ° C i 1 time for både S2 og P2 fraktioner. Tilføj phenylmethylsulfonylfluorid ved den endelige koncentration på 5 mM og lige mængder af SDS-prøvepuffer (3% SDS, 2 mM EDTA, 4% β-mercaptoethanol, 10% glycerol, 50 mM Tris, pH 6,8) til udtræden PK fordøjelse. Kog prøverne i 10 minutter og afkøle dem ved stuetemperatur i 5 min. De er klar til Western blotting.
2. Velocity sedimentation i Saccharose trinvise gradienter
- Inkuber 450 pi 20% S1 med et lige volumen af 2% sarkosyl i H2O i 30 minutter på is.
- Tilsæt 0,5 ml hver af 60%, 30%, 25%, 20%, 15% og 10% sucrose i en Beckman rør med en maksimal 5 ml kapacitet.
- Indlæse 0,4 ml S1 på toppen af 10-60% saccharose trinvise gradienter.
- Der centrifugeres ved 48000 rpm (200.000 x g, SW55 rotor) i 1 time ved 4 ° C.
- Opsaml 283 pi fraktion hver fra toppen af røret og opnå 12 fraktioner i alt.
- Tag 20 ul af hver fraktion til et nyt Eppendorf-rør, der tilsættes 20 pi prøvepuffer, og koges i 10 minutter.
- Cool prøver til 4 min i hætten, centrifugeres ved 1.000 x g i 1 min og vortex dem. Indlæse prøver på en forstøbt gel.
3. Gelpermeationskromatografi
- Anvende Superdex 200 HR-perler (Pharmacia, Uppsala, Sverige) i en 1 x 30 cm søjle for at bestemme den oligomere tilstand af PrP-molekyler.
- Syv molekylmasse-markører (Sigma, St. Louis, MI), herunder dextranblåt (2000 kDa), thyroglobulin (669 kDa), apoferritin (443 kDa), β-amylase (200 kDa), alkoholdehydrogenase (150 kDa), albumin ( 66 kDa) og carbonanhydrase (29 kDa) lastes uafhængigt ved de koncentrationer anbefalet af Sigma i 200 ul prøvevolumener.
- Elueringsvolumenet af blåt DEXTRAN anvendes til at bestemme det tomme volumen (V 0 = 8,45 ml), og det samlede volumen (V t = 24 ml) tilbydes af produktet instruktion. De maksimale elueringsvolumener (V e) er beregnet ud fra kromatogrammet og brøkdele tilbageholdelser. Kav, fordelingskoefficienten (definition prøve opførsel), beregnes ved hjælp af ligningen: K av = (V e - V 0) / (V t - V 0). Kalibreringskurven bestemmes ved afbildning af Kav af proteinstandarder mod log MW af standarder 8.
- The molekylvægt (MW) af de forskellige PrP arter inddrevet i forskellige FPLC-fraktioner bedømmes ifølge en kalibreringskurve genereret med gelfiltrering på forskellige standarder.
- Injicer 200 ul S1 i lysepuffer indeholdende 1% sarkosyl ind i kolonnen for hver kørsel.
- Kromatografi udføres i et FPLC-system (GE Healthcare) ved en strømningshastighed på 0,25 ml / min og fraktions af 0,25 ml hver opsamles under anvendelse af en fraktionsopsamler (Amersham Biosciences, RediFrac).
- Inkuber 0,125 ml hver fraktion med 0,5 ml forud afkølet methanol ved -20 ° C i 2 timer.
- Centrifugeres prøverne ved 13.000 x g i 30 minutter ved 4 ° C i en benchtop mikrocentrifuge. Supernatanten fjernes, og pellet resuspenderes i 20 pi SDS-prøvebuffer som nævnt ovenfor, kogning i 10 minutter, afkøles til stuetemperatur, indlæse dem til en pre-cast gel.
4. Opsamling af PrP ved G5p
- The G5p molekyle (100 ug) (venligst stillet til rådighed af Drs. Geoff Kneale og John McGeehan fra University of Portsmouth, UK) er konjugeret til 7 x 10 8 tosyl aktiverede magnetiske perler ved inkubering af 100 pg G5p og 350 gl G5p perler i 1 ml i phosphatpufret saltvand (PBS) ved 37 ° C i 20 timer. Tiltrække G5p-perler til sidevæggen i Eppendorf-rør ved hjælp af ydre magnetiske kraft og derefter fjerne al opløsning. Vaskes perlerne med 1 ml PBS indeholdende0,1% bovint serumalbumin (BSA) i tre gange.
- Inkubér G5p-konjugerede perler i 1 ml 0,2 M Tris-HCI, pH 7,4 indeholdende 0,1% BSA ved 37 ° C i 5 timer for at blokere ikke-specifik binding og derefter vaske perlerne med 1 ml PBS indeholdende 0,1% BSA for tre gange som nævnt ovenfor. Fjern opløsningen, og der tilsættes 1 ml PBS i perlerne. De fremstillede G5p perler er stabile i mindst 3 måneder ved 4 ° C.
- Indfangning af PrP ved G5p udføres ved inkubation 100 pi S1 fraktioner eller P2 med 60 ul G5p konjugerede perler (10 ug protein / 6 x 10 7 perler) i 1 ml bindingsbuffer (3% Tween-20, 3% NP- 40 i PBS, pH 7,5).
- Efter inkubering med konstant rotation i 3 timer ved stuetemperatur, er de PrP-holdige G5p perler tiltrukket til sidevæggen af Eppendorf-rør ved ekstern magnetisk kraft, hvilket tillader nem fjernelse af alle ubundne molekyler i opløsningen.
- Efter tre vaske i vaskebuffer (2% Tween-20 og 2% NP-40 i PBS, pH 70,5), er G5p perler opsamlet og opvarmet til 95 ° C i 5 minutter i SDS-prøvepuffer (3% SDS, 2 mM EDTA, 10% glycerol, 50 mM Tris-HCI, pH 6,8).
- Efter afkøling prøver i 5 minutter ved stuetemperatur, er prøverne centrifugeret ved 1000 x g i 5 minutter ved stuetemperatur. Supernatanterne er klar til Western blotting.
5. Western Blotting
- Belastning prøver koges i SDS-prøvebuffer på 15% Tris-HCl Criterion forstøbte geler (Bio-Rad) ved 150 V for ~ 80 min.
- Proteinerne på gelerne overført til PVDF i 2 timer ved 70V.
- Efter blokering membraner i 5% mælk i Tris-bufret saltvand indeholdende 0,01% Tween-20 (TBS-T), er membranerne inkuberet i 2 timer ved stuetemperatur med primære monoklonale eller polyklonale antistof 3F4 (1:40,000), 1E4 (1 : 1000), anti-N 8 (1:6,000), eller anti-C8 (1:6,000) til sondering PrP-molekylet.
- Efter inkubering med HRP-konjugeret fåre anti-mus IgG ved1:3000, eller æsel-anti-kanin-IgG ved 1:3000 PRP bånd er visualiseret på Kodak film ved anvendelse af ECL Plus, i overensstemmelse med producentens protokol.
6. Repræsentative resultater
Sammenlignet med sporadisk CJD prøver, blev en lille mængde iPrP C påvist i P2 fraktion i normale hjerner selv om de fleste af PrP C blev isoleret i S2 fraktion (figur 1). Som angivet tidligere 8, iPrP udgør ca 5-25% af den samlede PrP herunder fuld længde og N-terminalt trunkerede arter.
Analyser med sucrose trinvis gradient sedimentation viste, at mens de fleste af PrP ° fra ikke-CJD hjerner blev udvundet i de øverste fraktioner 1-3 blev små mængder af PrP også påvist i de nederste fraktioner 9-11, som normalt indeholder store aggregater 8 (fig. 2).
En række af PrP Sc arter ringedering fra monomerer blev små oligomerer til større aggregater isoleret ved gelfiltrering i hjernen med Creutzfeldt-Jakobs sygdom (figur 3A). Imidlertid blev en lille mængde større aggregater med molekylvægt større end 2.000 kDa også påvist i uopløselige fraktioner af normale hjerner (figur 3C). Desuden blev dimerer og tetramerer af PrP °, ikke blot påvises i uopløselige fraktioner, men også i opløselige fraktioner (figur 3B og 3C).
Efter PK og PNGase behandling blev PrP fanget af G5p detekteret med det 1E4 antistof mod PrP97-105 8. Tre PK-resistente kerne-fragmenter betegnes PrP * 20, PrP * 19, og PrP * 7 blev påvist, migrerer ved ~ 20 kDa, ~ 19 kDa og ~ 7 kDa (figur 4, højre panel). Der sås imidlertid ingen PrP detekteret, når den 1E4-antistoffet blev præinkuberet med et syntetisk peptid, der har en sekvens identical til 1E4 epitopen (figur 4, midterste panel), hvilket indikerer, at bånd detekteret af 1E4 er PrP-fragmenter. Desuden anti-C-antistof afslørede to forskellige PrP-fragmenter vandrer på ~ 18 kDa (PrP * 18) og ~ 12-13 kDa (PrP-CTF12/13), foruden PrP * 20 (figur 4, højre panel).
Fig. 1. Påvisning af iPrP C og iPrP Sc. Efter behandling med PNGase F til 1/10 af det samlede reaktionsvolumen ved 37 ° C i 1 time til fjernelse af glycaner fra proteinet i fuld længde eller N-terminalt trunkeret PrP arter i de opløselige og uopløselige fraktioner (S2 og P2) isolerede ved ultracentrifugering i hjerneprøver fra normal kontrol (CTL) og sporadisk CJD (sCJD) blev detekteret med 3F4 mod PrP106-112 (venstre panel), anti-N mod PrP23-40 (midterste panel), og anti-C mod PrP220-231 (højre panel). I CTL prøver, er en lille mængde PrP påvist i P2, mens en stor mængde er til stede i S2. I modsætning hertil er større PrP påvist i P2 end i S2 i sCJD prøver.
Figur 2. Sedimentering af PrP i saccharose tringradienter. PrP i individuelle fraktioner 1-11 ikke-CJD hjerne prøve S1 blev detekteret ved Western blotting med 3F4. Selvom de fleste af PrP C blev påvist i top fraktioner 1-3, blev små mængder af PrP også observeret i bunden fraktioner 9-11. Desuden båndmønster af PrP fra top og bund er anderledes: PrP inddrevet i de bedste fraktioner har en dominerende øvre bånd, mens PrP inddrevet i de nederste fraktioner har en dominerende lavere bånd. En PK-behandlede PrPsc blev påført som kontrol på højre side af blot.
Figur 3. Detektion af opløselige og uopløselige PrP ° oligomerer. Opløselige og uopløselige PrP C fra normale humane hjerner blev separeret ved ultracentrifugering og underkastes derefter gelfiltrering hhv. De molekylære størrelser af de individuelle fraktioner blev målt ved at køre en gruppe af molekylmasse-markører. (A) PrPsc arter fra sCJD hjerneprøver. To bestande af PrP arter blev påvist: gelfiltrering fraktionerne 49 til 65 indeholder monomerer og små oligomerer, hvorimod fraktionerne 27-33 indeholder store aggregater. PRP C arter fra opløselige fraktion (S2) (B) og uopløselig fraktion (P2) (C) for normale kontroller blev påvist. PRP blev probet med 3F4 antistoffet. Dimerer (fraktion 55) og tetramerer (fraktion 51) af PrP blev påvist ikke blot i P2 men også i S2 af den normale hjerne samples (B og C). Store aggregater blev kun fundet i P2 af normale prøver (C).
Fig. 4. Påvisning af forskellige PK-resistente iPrP fragmenter i G5p-berigede præparater fra normale humane hjerner. Prøver beriget med G5p blev behandlet med PK og PNGase F forud for Western blotting probing med 1E4 (venstre panel), 1E4 præ-inkuberet med et syntetisk peptid, der havde en sekvens identisk med 1E4 epitopen (midterste panel), og anti-C ( højre panel). 1E4 opdaget tre PK-resistente PrP-fragmenter betegnes PrP * 20, PrP * 19, og PrP * 7 (venstre panel). Efter blokering af 1E4 med peptidet, blev ingen PrP res detekteres (midterste panel), hvilket indikerer, at båndene påvist med 1E4 er PrP-fragmenter. Anti-C afslørede to tilføjelse PK-resistente PrP-fragmenter betegnes PrP * 18 og PrP-CTF12 /13, i tillæg til PrP * 20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kombinationen af fremgangsmåder rapporteret her isolerer konsekvent uopløselige PrP ° aggregater og opløselige PrP ° oligomerer fra den normale menneskelige hjerne. Ultracentrifugering ved 100.000 x g i en time er en klassisk metode, der har været meget anvendt til separation af det uopløselige PrP Sc fra den opløselige PrP C 14. Selv om det er effektivt, en af forholdsreglerne er at undgå forurening under trække supernatanten (S2) efter centrifugering. Da gelen profil iPrP C er forskellig fra PrP °, er det usandsynligt, at PrP detekteret i P2 fraktion skyldes forurening af S2. The sucrose gradient sedimentation assay er blevet anvendt til at separere forskellige PrP Sc arter baseret på deres densiteter, størrelser og former 15. Vi har bemærket, at fraktionen 12 ofte indeholder nogle partikel, der kan gøre denne fraktion uforklarligt. Fraktion 10 ofte er den, der indeholder greatest mængder af PrP aggregater blandt fraktioner opsamlet 8. De molekylvægte (MW) af forskellige PrP ° konformere blev yderligere karakteriseret ved hjælp af gelfiltrering (også kaldet gelpermeationskromatografi). Vi først genereret en kalibreringskurve med syv molekylmasse-markører (data ikke vist) og derefter undersøgt MW af PrP fra hjerner af normale kontroller og sCJD patienter. Vi bemærkede, at en lille mængde af PrP aggregater kan udfældes sammen med cellerester under fremstillingen af S1 fraktion. For at øge recovery rate, bør hjernevæv homogeniseres godt og inkubation af hjernehomogenat med den sarkosyl løsning bør udvides til en halv time eller en time ved 4 ° C. Selv om der ikke volumen begrænsning for G5p indfangning af iPrP C, anbefales det at bruge fra 60 til 80 pi perler og 100-200 pi prøver ved hvert forsøg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Den Forfatterne er taknemmelige for den menneskelige hjerne og Spinal Fluid Resource Center (Los Angeles, CA) til at tilvejebringe normale hjerne prøver. Denne undersøgelse blev støttet af National Institutes of Health (NIH) R01NS062787, CJD Foundation, Alliance biologisk sikre, samt University Center on Aging og sundhed med støtte fra McGregor Foundation og præsidentens Skønsmæssig Fund (Case Western Reserve University) .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P7626 | 72 mM in 2-propanol |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308 | 2 mg/ml in H2O |
| PNGase F | New England Biolabs | MWGF200 | |
| Ultracentrifuge LE-80K, SW55 rotor | Beckman Coulter | Part No. 365668, 356860 | |
| Superdex 200 HR beads | GE Healthcare | 17-1088-01 | |
| AKTA FPLC system | GE Healthcare | 18-1900-26 | |
| Molecular weight markers | Sigma-Aldrich | MWGF200 | Varied |
| Dynabeads M-280 magnetic beads | Invitrogen | 143-01 | |
| 3F4 antibody | Covance | SIG-39600 | |
| 1E4 antibody | Cell Sciences | M1840 | |
| Ready gel 15% Tris-HCl pre-cast gels | Bio-Rad | 345-0020 |
References
- Prusiner, S. B.
- Oesch, B., Westaway, D., Wälchli, M., McKinley, M. P., Kent, S. B. H., Aebersold, R., Barry, R. A., Tempst, P., Teplow, D. B., Hood, L. E., Prusiner, S. B., Weissmann, C. A cellular gene encodes scrapie PrP 27-30 protein. Cell. 40, 735-746 (1985).
- Bolton, D. C., McKinley, M. P., Prusiner, S. B. Identification of a protein that purifies with the scrapie prion. Science. 218, 1309-1311 (1982).
- Prusiner, S. B., McKinley, M. P., Bowman, K. A., Bolton, D. C., Bendheim, P. E., Groth, D. F., Glenner, G. G. Scrapie prions aggregate to form amyloid-like birefringent rods. Cell. 35, 349-358 (1983).
- Hope, J., Morton, L. J., Farquhar, C. F., Multhaup, G., Beyreuther, K., Kimberlin, R. H. The major polypeptide of scrapie-associated fibrils (SAF) has the same size, charge distribution and N-terminal protein sequence as predicted for the normal brain protein (PrP). EMBO J. 5, 2591-2597 (1986).
- Prusiner, S. B., Groth, D. F., Bolton, D. C., Kent, S. B., Hood, L. E. Purification and structural studies of a major scrapie prion protein. Cell. 38, 127-134 (1984).
- Hall, D., Edskes, H. Silent prions lying in wait: a two-hit model of prion/amyloid formation and infection. J. Mol. Biol. 336, 775-786 (2004).
- Yuan, J., Xiao, X., McGeehan, J., Dong, Z., Cali, I., Fujioka, H., Kong, Q., Kneale, G., Gambetti, P., Zou, W. Q. Insoluble aggregates and protease-resistant conformers of prion protein in uninfected human brains. J. Biol. Chem. 281, 34848-34858 (2006).
- Yuan, J., Dong, Z., Guo, J. P., McGeehan, J., Xiao, X., Wang, J., Cali, I., McGeer, P. L., Cashman, N. R., Bessen, R., Surewicz, W. K., Kneale, G., Petersen, R. B., Gambetti, P., Zou, W. Q. Accessibility of a critical prion protein region involved in strain recognition and its implications for the early detection of prions. Cell. Mol. Life Sci. 65, 631-643 (2008).
- Zou, W. Q., Zheng, J., Gray, D. M., Gambetti, P., Chen, S. G. Antibody to DNA detects scrapie but not normal prion protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1380-1385 (2004).
- Gambetti, P., Dong, Z., Yuan, J., Xiao, X., Zheng, M., Alshekhlee, A., Castellani, R., Cohen, M., Barria, M. A., Gonzalez-Romero, D., Belay, E. D., Schonberger, L. B., Marder, K., Harris, C. A novel human disease with abnormal prion protein sensitive to protease. Ann. Neurol. 63, 697-708 (2008).
- Zou, W. Q., Puoti, G., Xiao, X., Yuan, J., Qing, L., Cali, I., Shimoji, M., Langeveld, J. P., Castellani, R., Notari, S., Crain, B., Schmidt, R. E., Geschwind, M. Variably protease-sensitive prionopathy: A new sporadic disease of the prion protein. Ann. Neurol. 68, 162-172 (2010).
- Zou, W. Q., Xiao, X., Yuan, J., Puoti, G., Fujioka, H., Wang, X., Richardson, S., Zhou, X., Zou, R., Li, S., Zhu, X. Amyloid-beta42 interacts mainly with insoluble prion protein in the Alzheimer brain. J. Biol. Chem. 286, 15095-15105 (2011).
- Zou, W. Q., Colucci, M., Gambetti, P., Chen, S. G. Characterization of prion proteins. Methods in Molecular Biology-Neurogenetics: Methods and Protocols. Potter, N. T. , Humana Press Inc. Totowa. 305-314 (2002).
- Tzaban, S., Friedlander, G., Schonberger, O., Horonchik, L., Yedidia, Y., Shaked, G., Gabizon, R., Taraboulos, A. Protease-sensitive scrapie prion protein in aggregates of heterogeneous sizes. Biochemistry. 41, 12868-12875 (2002).
