Summary
Un método para el control espacio-temporal de la actividad GTPasa pequeña luz se describe. Este método se basa en la rapamicina inducida FKBP-FRB heterodimerización y sistemas de enjaulamiento foto-. Optimización de la luz de la irradiación permite la activación espacio-temporalmente controlada de las pequeñas GTPasas a nivel subcelular.
Abstract
Regulación dinámica de la familia Rho de pequeños triphosphatases guanosina (GTPasas) con una precisión espacial y temporal grande es esencial para varias funciones celulares y los eventos 1 y 2. Su naturaleza dinámica espaciotemporalmente ha sido revelado por la visualización de su actividad y localización en tiempo real 3. Con el fin de obtener un mayor conocimiento de sus funciones en diversas funciones celulares a nivel molecular, el siguiente paso debería ser la perturbación de las actividades de la proteína en un lugar concreto subcelular y el tiempo.
Para lograr este objetivo, hemos desarrollado un método para la inducida por la luz, espacio-temporalmente la activación controlada de pequeñas GTPasas mediante la combinación de dos técnicas: (1) inducida por la rapamicina FKBP-FRB heterodimerización y (2) un método foto-jaulas de la rapamicina. Con el uso de rapamicina mediada FKBP-FRB heterodimerización, hemos desarrollado un método para la rápida inducible activación o inactivación de pequeño includi GTPasasng Rac 4, 4 Cdc42, RhoA 4 y 5 de Ras, en el que la rapamicina induce la translocación de FKBP fusionados GTPasas o sus activadores, a la membrana plasmática, donde está anclado FRB. Para el acoplamiento con este sistema heterodimerización, también hemos desarrollado un sistema de foto-jaulas de los análogos de rapamicina. Un compuesto foto-enjaulado es una pequeña molécula cuya actividad se suprime con un grupo protector conocido photocleavable como un grupo enjaulamiento. Para suprimir la actividad heterodimerización completamente, hemos diseñado un rapamicina enjaulado que está atado a una macromolécula tal que el gran complejo resultante no puede atravesar la membrana plasmática, que conduce a prácticamente ninguna actividad de fondo como una dimerizer química dentro de las células 6. Figura 1 ilustra un esquema de nuestra sistema. Con la combinación de estos dos sistemas, contratación local un activador de Rac a la membrana plasmática en una escala de tiempo de segundos y alcanzar la luz inducida por la activación de Rac a niveles subcelularEl 6.
Protocol
1. La transfección de ADN del plásmido
- Añadir ADN de plásmido, 0,5 g de membrana anclada FRB (en adelante, LDR) y 0,5 mg FKBP-Tiam1 (la invasión de las células T linfoma y metástasis de inducción de proteínas 1: Rac activador) marcados con la proteína fluorescente a 37,5 l O. DH 2 Añadir 1 l HD FuGENE.
- Vortex y se incuba a temperatura ambiente durante 20 minutos. Mientras tanto, siga con los pasos 1.3-1.8.
- Lavar cada pocillo de una cámara de 8-bien con 50 l de poli-D-lisina.
- Lavar el centro de cada pocillo con dH 2 O.
- Trypsinize 80-85% confluentes células NIH-3T3 y diluir a 10 ml de medio de cultivo (DMEM con FBS al 10%).
- Quitar 375 l de la suspensión y centrifugar a 1750 rpm durante 3 minutos.
- Aspirar los medios de comunicación, teniendo cuidado de no perturbar el sedimento.
- Añadir 750 l de FBS DMEM w / 10% y volver a suspender.
- Añadir suspensión celular a DH 2 O / ADN / solución FuGENE HD y mezclar suavemente.
- Añadir 250l de suspensión de células / ADN a cada pocillo (llenarán hasta 3 pocillos).
- Se incuban las células transfectadas a 37 ° C y 5% de CO 2 durante 15-18 horas.
2. Preparación de la CRB-Una solución
- Sintetizar enjaulado rapamicina-biotina aducto (CRB). Consulte la sección "esquema de síntesis de la CRB" para más detalles. Brevemente, restos enjaulamiento y biotina se preparan por separado. El resto enjaulamiento es entonces conjugado con rapamicina (LC laboratorio), el producto posteriormente acoplado al resto de biotina por un medio de reacción clic 7 para dar CRB.
- Prepare una solución de 1 mM de valores de CRB en DMSO.
- Disolver 1 mg avidina en 250 l de PBS en un tubo Eppendorf de 0,5 ml.
- Añadir 1 l de solución madre CRB avidina disuelto. Mezclar invirtiendo varias veces.
- Incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos para dar CRB-avidina conjugada (CRB-A) Solución.
- Excluir las moléculas pequeñas no consolidados y purificar CRB-A. Utilizando una columna de exclusión por tamaño
3. Microscopía e iluminación de luz en el nivel subcelular
- Suero de hambre células transfectadas en DMEM sin FBS durante 12 horas.
- Aspire con cuidado los medios de comunicación fuera de las células y añadir 250 ml del preparado 400 nM CRB-Una solución (desde el paso 2.6).
- Para visualizar la dinámica de proteínas en las células vivas en la resolución subcelular antes y después del tratamiento de la luz, la microscopía de disco giratorio se utiliza (figura 2a). Iluminación UV se logró mediante el acoplamiento de la óptica de la luz UV LED (365 nm) con epi-fluorescencia de luz (Figura 2b).
- MetaMorph software se utiliza para capturar imágenes de fluorescencia de las células transfectadas cada 15 segundos.
- Definir las coordenadas y el tamaño de un punto de iluminación mediante el uso de una placa de vidrio recubierta con colorantes fluorescentes excitadas por la luz UV. El tamaño puedeser variada mediante la aplicación de la lente objetivo con diferentes aumentos y mediante la selección de las fibras ópticas con núcleo tamaño diferente.
- Después de determinar los niveles de fondo de la membrana fruncido, la luz irradian rayos UV en la periferia de las células. Los siguientes dos pasos son para contrastar anteriores efectos localizados.
- A nivel mundial irradiar las células con luz de 365 nm proporcionada por una lámpara de mercurio.
- Disolver uncaged, por lo que la rapamicina original en DMSO y luego en PBS (400 mM final), y la solución a la cámara de imágenes para producir efectos globales.
4. Los resultados representativos
Un ejemplo de resultados representativos se muestran en la Figura 3. La irradiación de luz UV a una pequeña región cerca de un borde celular inducida rápidamente la formación de volantes localizada sólo en y cerca de la zona irradiada. Para confirmar que éste era de hecho la actividad local, luego a nivel internacional las células irradiadas con UV, o añadidos a los medios de rapamicina a granel, tanto de la WHIch inducida por la formación volante global a lo largo de la membrana. Para un análisis cuantitativo, hemos dividido las células diana en cuatro cuadrantes, y contó con la frecuencia de la formación de volantes en cada cuadrante al local, así como después de la estimulación global bajo diversas condiciones, incluyendo los controles (Figura 4). Es sólo que esta combinación de la radiación UV, CRB-A, y apropiadas FKBP-FRB construcciones que induce fruncido local.
Figura 1. Esquema de la dimerización de la proteína espacialmente confinados con enjaulado rapamicina-avidina conjugada (CRB-A) y la luz ultravioleta. Irradiación UV escinde el enlazador entre la rapamicina y la biotina, resultando en la liberación de productos químicos dimerizer (HE-rapa, C40-O-(2-hidroxietil) rapamicina) y su subproducto. El dimerizer luego liberado se difunde en las células e induce la dimerización entre FKBP-PDI (proteína de interés) y de plasma membRane anclado FRB sólo en la proximidad de la región irradiada (círculo azul). Sin la radiación UV, FKBP y FRB no asociado (cruz roja), por lo tanto, la producción de ningún efecto. (Derechos de Autor @ ACS2011) 6
Figura 2. Imagen del microscopio de fluorescencia confocal personalizado. (A) Vista frontal del microscopio confocal (invertido Axiovert 200 de Zeiss). (B) Primer plano, vista desde arriba de una unidad de acoplamiento para el PAI de fluorescencia y luz UV.
Figura 3. Formación espacialmente confinado en un volante transfectadas NIH3T3 celular inducida por la irradiación UV localizada. Confocal de imágenes de fluorescencia de un celular de fibroblastos NIH3T3 que se transfectaron con YFP de etiquetado FKBP-Tiam1 (Rac activador) y LDR (anclado a la membrana FRB) fueron sometidos a la irradiación en un área confinada cerca de su borde con LED luz a 365 nm durante 15 segundos a partir de 210 segundos en la presencia de CRB-Un conjugado en los medios a granel. Este tratamiento fue seguido por la iluminación global con lámpara de mercurio de 1 seg a 1063 Además seg y global de rapamicina finales 400 Nm a 1560 segundos. La célula casi no mostraron actividad alborotaba al principio (a), pero mostró espacialmente confinados revolviendo después de la iluminación localizada (círculo amarillo) (b). La célula mostró la formación de volante mundial después de la iluminación global y además de la rapamicina (cd), lo que indica que la formación volante local fue causada por la activación de Rac espacialmente confinados. Barra de escala: 10 m. (Derechos de Autor @ ACS2011) 6
Figura 4. Frecuencia de la formación de volantes en los cuadrantes de transfectadas las células NIH3T3. La radiación UV local con CRB-A y después de la irradiación UV mundial se realizaron en 13 celdas. CRB-A CRB-A sin irradiación UV o irradiación UV local con o sin avidina en los medios a granel. Se recogieron los datos a partir de células con baja formación volante de fondo, pero que tenía la capacidad de la rapamicina inducida por la formación de volante, lo que nos marchamos después de cada experimento, al confirmar la formación de volante global como resultado de la suma de la rapamicina (finales de 400 nm). Estos resultados mostraron que CRB-A y la irradiación UV, son necesarias para la formación de volante local en las células. (Derechos de Autor @ ACS2011) 6
Abreviaturas:
FKBP: FK506-proteína de unión
FRB: FKBP-rapamicina-proteína de unión
Tiam1: la invasión de las células T linfoma y metástasis que induce la proteína 1 (Rac FMAM)
LDR: Lyn-DSAG enlazador-FRB (Lyn: N-terminal de 11 aminoácidos de Lyn-quinasa)
HE-rapa: C40-O - (2-hidroxietil) rapamicina
CRB: la rapamicina con el resto de biotina enjaulado
CRB-A: CRB conjugado con avidina
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Discussion
Se describe una técnica que emplea un novedoso compuesto enjaulado junto con el sistema heterodimerización FKBP-FRB con el fin de manipular a la actividad GTPasa Rho en un lugar concreto subcelular en una escala de tiempo de segundos.
Hay tres limitaciones del enfoque actual. En primer lugar, porque el método se basa en la prevención o permitiendo la difusión de dimerizer través de la membrana plasmática, la ubicación de destino celular necesita ser membrana plasmática o sus proximidades. Optimización adicional de la estructura química de CRB puede permitir que el compuesto a entrar en las células sin inducir dimerización hasta irradiación de luz. Con una dimerizer, podríamos, en teoría, manipular la actividad de moléculas de señalización en cualquier lugar dentro de las células. En segundo lugar, la difusión molecular de dimerizers químicos, FKBP-FRB complejos dimerización, o se activan las moléculas de señalización endógenas pueden afectar enormemente la reclusión precisa de los efectos deseados. Este efecto es particularmente pronunciadoen puntos de tiempo más tarde y depende de los parámetros asociados con la irradiación UV (tales como ancho de haz, la energía, y el modo de haz (vs continua pulsante)) y los coeficientes de difusión de los compuestos implicados. Una mayor optimización empírica de estos parámetros permite la reclusión más estricta de las actividades de la señal. En tercer lugar, una luz ultravioleta muestra no trivial fototoxicidad a las células. Una forma sencilla de mejorar este problema es utilizar una longitud de onda mayor, tales como 405 nm a desenjaular grupos nitrobencilo enjaulamiento. Dos fotones de iluminación para uncaging permite la iluminación en una longitud de onda más larga, así como en la región extremadamente localizada de células. Recientemente, otros investigadores han reportado un enfoque elegante para activar Rac en una localización subcelular utilizando proteínas sensibles a la luz de las plantas 8-11. Hasta ahora, su aplicación se limita a sólo unas pocas proteínas. En comparación con sus estrategias, nuestra técnica actual es más fácilmente adaptable a ampliar el número de proteínas de la meta, sin una amplia y tiMe consume la reingeniería. Nosotros y otros ya han desarrollado una variedad de sondas de dimerización que pueden manipular la actividad de diversas moléculas de señalización en la membrana plasmática 5, 6, 12-14. Eventos celulares espaciotemporalmente dinámicos son ahora directamente comprobable.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por el NIH financiación de la investigación (DK090868 y GM092930 a TI). No es una patente pendiente en un análogo de la rapamicina enjaulado.
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