Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase aktivitet på subcellulære nivå og på Tidsskala sekunder i levende celler

Summary

En metode for spatio-temporal kontroll av små GTPase aktivitet av lys er beskrevet. Denne metoden er basert på rapamycin-indusert FKBP-FRB heterodimerization og foto-merd systemer. Optimalisering av lys-bestråling muliggjør spatio-timelig kontrollert aktivering av små GTPases på subcellulære nivå.

Abstract

Dynamisk regulering av Rho familien av små guanosine triphosphatases (GTPases) med stor spatiotemporal presisjon er viktig for ulike cellulære funksjoner og hendelser ^{1, 2.} Deres spatiotemporally dynamiske natur er blitt avslørt av visualisering av sin aktivitet og lokalisering i sanntid ^tre. For å få dypere forståelse av sine roller i ulike cellulære funksjoner på molekylært nivå, bør neste skritt være endringen av protein aktiviteter på en presis subcellulære sted og tidspunkt.

For å oppnå dette målet, har vi utviklet en metode for lys-indusert, spatio-timelig kontrollert aktivering av små GTPases ved å kombinere to teknikker: (1) rapamycin-indusert FKBP-FRB heterodimerization og (2) en foto-bur metode for rapamycin. Med bruk av rapamycin-mediert FKBP-FRB heterodimerization, har vi utviklet en metode for raskt induserbar aktivering eller inaktivering av små GTPases including ⁴ Rac, ^4, Cdc42 ⁴ RhoA og Ras ^5, der rapamycin induserer translokasjon av FKBP-sammenvokste GTPases, eller deres aktivatorer, til plasmamembranen hvor FRB er forankret. For kopling med dette heterodimerization system, har vi også utviklet en foto-bur system av rapamycin analogs. Et bilde-bur forbindelsen er et lite molekyl hvis virksomhet er undertrykt med en photocleavable beskytte gruppe kjent som en bur gruppe. For å undertrykke heterodimerization aktivitet helt, designet vi et inngjerdet rapamycin som er bundet til en macromolecule slik at den resulterende store komplekset ikke kan krysse plasmamembranen, som fører til praktisk talt ingen bakgrunn aktivitet som en kjemisk dimerizer inni cellene ^6. Figur 1 illustrerer en ordning med vår system. Med kombinasjonen av disse to systemene, vi lokalt rekruttert en Rac aktivator til plasmamembranen på en tidsskala av sekunder og oppnådde lysindusert Rac aktivering ved subcellulære level ^6.

Protocol

1. Transfeksjon av plasmid DNA

1. Legg Plasmid DNAS, 0,5 mikrogram membran-tethered FRB (heretter referert til som LDR) og 0,5 _g FKBP-Tiam1 (T-celle lymfom invasjon og metastasering-induserende protein 1: Rac aktivator) merket med fluorescerende protein til 37,5 mL dH ₂ O. Legg en mL FuGENE HD.
2. Vortex og Inkuber ved romtemperatur i 20 minutter. I mellomtiden, fortsett til trinn 1.3-1.8.
3. Vask hver brønn av en åtte-brønns kammer med 50 mL poly-D-lysin.
4. Vask midten av hver brønn med dH ₂ O.
5. Trypsinize 80-85% konfluent NIH-3T3 celler og fortynnes til 10 ml kultur medium (DMEM med 10% FBS).
6. Fjern 375 mL av suspensjon og sentrifuger ved 1750 rpm i 3 minutter.
7. Sug media, være forsiktig for ikke å forstyrre pelleten.
8. Legg 750 mL av DMEM w / 10% FBS og resuspender.
9. Legg cellesuspensjon til dH ₂ O / DNA / FuGENE HD-løsning og bland forsiktig.
10. Tilsett 250mL av celle / DNA oppheng til hver brønn (vil fylle opp til 3 brønner).
11. Inkuber transfekterte cellene ved 37 ° C og 5% CO ₂ for 15-18 timer.

2. Utarbeidelse av CRB-A Solution

1. Syntetisere bur rapamycin-biotin addukt (CRB). Se "Syntetisk ordningen CRB" for detaljer. Kort, blir merd-og biotin moieties forberedt separat. Det bur moiety er så konjugert til rapamycin (LC lab), produktet senere koblet til biotin moiety ved et middel klikk reaksjon ⁷ råd til CRB.
2. Forbered en 1 mM stamløsning av CRB i DMSO.
3. Løs 1mg avidin i 250 mL PBS i en 0,5 ml Eppendorf rør.
4. Legg en mL av CRB stamoppløsning til oppløst avidin. Bland ved å snu flere ganger.
5. Inkuber ved romtemperatur i 15 min å gi CRB-avidin konjugat (CRB-A) Løsning.
6. Ekskluder ubundne små molekyler og rense CRB-A med en størrelse-eksklusjon kolonne.

3. Mikroskopi og Lys Belysning ved subcellulære nivå

1. Serum sulte transfekterte celler i DMEM uten FBS i 12 timer.
2. Forsiktig aspirer media utenfor cellene og legge 250 mL av den tilberedte 400 nM CRB-A løsning (fra trinn 2,6).
3. For å visualisere protein dynamikk i levende celler på subcellulære oppløsning før og etter lysbehandling, spant disk mikroskopi brukt (figur 2a). UV belysning ble oppnådd ved å koble optikk for UV LED lys (365 nm) med epi-fluorescens lys (Figur 2b).
4. MetaMorph programmet ble brukt til å fange fluorescens bilder av transfekterte celler hvert 15 sekunder.
5. Definer koordinatene og størrelsen på en belysning sted ved hjelp av en glassplate belagt med fluorescerende fargestoffer opphisset av UV lys. Størrelsen kanvarieres ved å bruke objektiv med ulike forstørrelser og ved å velge optiske fibre med ulik kjerne størrelse.
6. Etter å bestemme bakgrunnsnivåer av membran ruffling, strålebehandling UV lys i periferien av cellene. Følgende to trinn er å kontrastere forrige lokaliserte effekter.
7. Globalt strålebehandling celler med 365 nm lys levert av en kvikksølv lampe.
8. Løs uncaged, dermed original rapamycin i DMSO og deretter i PBS (400 nM endelig), og tilsett løsningen til bildebehandling kammeret for å indusere globale effekter.

4. Representative Resultater

Et eksempel på representative resultater er vist i figur 3. UV lys bestråling på et lite område i nærheten av en mobil kant raskt indusert dannelse av lokalisert ruffles bare i og nær det bestrålte området. For å bekrefte at dette virkelig var lokal aktivitet, vi så globalt bestrålt celler med UV, eller lagt rapamycin til bulk media, både av WHIch indusert global krusning formasjon gjennom membranen. For en kvantitativ analyse, delte vi målceller inn i fire kvadranter, og telles hyppigheten av krusning formasjonen i hver kvadrant på lokale så vel som å følge global stimulering under ulike forhold, inkludert kontroller (figur 4). Det er bare denne kombinasjonen av UV bestråling, CRB-A, og hensiktsmessige FKBP-FRB konstruksjoner som induserer lokal ruffling.

Figur 1. Skjematisk av romlig begrenset protein dimerization bruke bur rapamycin-avidin konjugat (CRB-A) og UV-lys. UV bestråling kløyver linker mellom rapamycin og biotin, som resulterer i utslipp av kjemiske dimerizer (HE-Rapa, C40-O-(2-hydroxyethyl) rapamycin) og biprodukt. Den frigjorte dimerizer diffunderer så inn i cellene og induserer dimerization mellom FKBP-POI (protein av interesse) og plasma medl.RANE forankret FRB bare i nærheten av det bestrålte området (blå sirkel). Uten UV bestråling, FKBP og FRB gjør ikke advokatfullmektig (rødt kryss), derav produserer ingen effekt. (Copyright @ ACS2011) ⁶

Figur 2. Bilde av tilpassede confocal fluorescens mikroskop. (A) Frontal syn på confocal mikroskop (invertert 200 Axiovert, Zeiss). (B) Nærbilde, topp utsikt en kobling enhet for EPI fluorescens og UV belysning.

Figur 3. Romlig begrenset krusning formasjonen i en transfekterte NIH3T3 celle indusert av lokaliserte UV bestråling. Confocal fluorescens bilder av en NIH3T3 fibroblast celle som er tilført med YFP-merket FKBP-Tiam1 (Rac aktivator) og LDR (membran-forankret FRB) gjennomgikk bestråling i et begrenset område nær kanten med LED lys ved 365 nm for 15 sek starter på 210 sek i nærvær av CRB-A konjugat i bulk media. Denne behandlingen ble etterfulgt av global belysning med kvikksølv lampe i 1 sek på 1063 sek og global tilførsel av rapamycin siste 400 Nm ved 1560 sek. Cellen viste nesten ingen ruffling aktivitet i begynnelsen (a), men viste romlig avgrenset ruffling etter lokaliserte belysning (gul sirkel) (b). Cellen viste globale krusning dannelsen etter global belysning og tilsetting av rapamycin (cd), som indikerer at den lokale krusning formasjonen ble forårsaket av romlig avgrenset aktivering av Rac. Scale bar: 10 mikrometer. (Copyright @ ACS2011) ⁶

Figur 4. Frekvens av krusning formasjonen i kvadranter med transfekterte NIH3T3 celler. Lokal UV bestråling med CRB-A og følgende global UV bestråling ble utført på 13 celler. CRB-A CRB-A uten UV bestråling, eller lokal UV bestråling med eller uten avidin i bulk media. Vi samlet data fra celler med lavt bakgrunn krusning formasjon, men som hadde den kapasiteten rapamycin-indusert krusning formasjonen, som vi sjekket etter hvert forsøk, ved å bekrefte global krusning formasjon som følge av tilførsel av rapamycin (endelige 400 nM). Disse resultatene viste at CRB-A og lokale UV bestråling er nødvendig for lokal krusning formasjon i cellene. (Copyright @ ACS2011) ⁶

Forkortelser:

FKBP: FK506-binding protein
FRB: FKBP-rapamycin-bindende protein
Tiam1: T-celle lymfom invasjon og metastasering-induserende protein 1 (Rac GEF)
LDR: Lyn-DSAG linker-FRB (Lyn: N-terminal 11 aminosyrer av Lyn kinase)
HE-Rapa: C40-O - (2-hydroxyethyl) rapamycin
CRB: bur rapamycin med biotin moiety
CRB-A: CRB konjugert til avidin

Discussion

Vi beskrev en teknikk som bruker en roman bur sammensatt sammen med FKBP-FRB heterodimerization system for å manipulere Rho GTPase aktivitet på en presis subcellulære sted på en tidsskala av sekunder.

Det er tre begrensninger i denne tilnærmingen. For det første, fordi metoden er basert på å hindre eller tillate spredning av dimerizer over plasmamembranen, må målet mobilnettet sted å være plasma membran eller dens nærhet. Videre optimalisering av den kjemiske strukturen til CRB kan tillate det sammensatte å angi celler uten å indusere dimerization til lys bestråling. Med en slik dimerizer, kunne vi i teorien manipulere aktivitet av signalmolekyler hvor som helst inne i cellene. Dernest kan molekylær diffusjon av kjemiske dimerizers og FKBP-FRB dimerization komplekse eller aktiveres endogene signalmolekyler i stor grad påvirke presis innesperring av de tilsiktede virkninger. Denne effekten er spesielt storpå senere tidspunkter og er avhengig av parametere forbundet med UV-bestråling (som stråle, energi, og stråle-modus (kontinuerlig vs pulset)) og diffusjonen koeffisientene til forbindelser involvert. Videre empirisk optimalisering av disse parametrene gir strengere innesperring av signal aktiviteter. For det tredje viser en UV lys ikke-triviell fototoksisitet til cellene. En enkel måte å forbedre dette problemet er å bruke en lengre bølgelengde som 405 nm til uncage nitrobenzyl merd grupper. To-foton belysning for uncaging lar belysning på en enda lengre bølgelengde samt ved ekstremt lokaliserte regionen celler. Nylig har andre forskere rapporterte en elegant tilnærming for å aktivere Rac på et subcellulære posisjon ved hjelp av lys-sensitive planteproteiner ^8-11. Så langt, er dens anvendelse begrenset til bare noen få proteiner. Sammenlignet med sine strategier, er vår nåværende teknikk lettere tilpasningsdyktig å utvide antall target proteiner uten omfattende og TImeg tidkrevende re-engineering. Vi og andre har allerede utviklet en rekke dimerization sonder som kan manipulere aktiviteten av ulike signalmolekyler i plasma ^{5 membran, 6, 12-14.} Spatiotemporally dynamiske mobilnettet hendelser er nå direkte testbar.