Summary
被描述为轻小GTPase活性的时空控制的方法。这种方法是基于FKBP-FRB雷帕霉素诱导的异二聚体和照片囚禁系统。优化的光照射，使时空，时间控制在亚细胞水平的小GTP酶激活。
Abstract
Rho家族的小的鸟嘌呤triphosphatases与伟大的时空精度（GTP酶）的动态监管是必不可少的各种细胞功能和事件1，2。已经揭示了他们的活动可视化和实时3本地化他们spatiotemporally动态性质。为了获得更深入地了解自己的角色在不同的细胞功能，在分子水平上，下一步应该是摄蛋白质的活动在一个精确的亚细胞定位和定时。
为了实现这一目标，我们已经开发出一种光致，时空，时间控制的小GTP酶激活两种技术结合的方法：（1）雷帕霉素诱导FKBP联邦储备银行的异二聚体和（2）的雷帕照片囚禁的方法。与使用雷帕霉素介导的FKBP-FRB异二聚体，我们已经开发出一种快速诱导includi小GTP酶的激活或灭活方法吴RAC 4，Cdc42的4 4 RhoA蛋白和Ras 5，其中雷帕霉素诱导易位的的FKBP融合GTP酶，或他们的活化，在联邦储备银行锚定在细胞膜。与此异二聚体系统的耦合，我们还制定了雷帕霉素类似物的照片囚禁系统。图片笼状化合物是一种小分子，被称为作为一个囚禁组与photocleavable保护组抑制其活动。为了抑制异二聚体活性完全，我们设计了1笼中雷帕霉素，被拴1高分子这样认为，由此产生的大量复杂的可以不穿过细胞膜，导致1细胞6内的化学dimerizer几乎没有背景活动。我们计划图1所示系统。与这两个系统的结合，我们在本地招募了RAC激活质膜上几秒钟的时间表，并取得了在亚利光致RAC激活EL 6。
Protocol
1。转染质粒DNA
- 加入质粒DNA，0.5微克膜栓联邦储备银行（以下简称为的LDR）和0.5微克FKBP-Tiam 1 mRNA（37.5微升DH 2 O荧光蛋白标记的T-细胞淋巴瘤侵袭转移诱导蛋白1：激活RAC）加入1μLFuGENE HD。
- 涡，在室温下孵育20分钟。同时，进行步骤1.3-1.8。
- 每8井室以及50μL聚-D-赖氨酸洗净。
- 每口井的中心洗DH 2 O
- Trypsinize 80-85％汇合NIH-3T3细胞，并稀释至10毫升培养基（含10％胎牛血清的DMEM培养液）。
- 取出375μL悬浮，离心1750转每分钟为3分钟。
- 抽吸介质，小心不要打扰沉淀。
- 加入750μL培养液W / 10％FBS和重悬。
- DH 2的O / DNA / FuGENE HD解决方案，并加入细胞悬液轻轻混匀。
- 新增250个每口井（细胞/ DNA的悬浮液将填补了3口井）。
- 转染细胞在37°C和5％的CO 2为15-18小时。
2。 CRB解决方案的制备
- 雷帕霉素生物素加合物的合成笼（CRB）。见“CRB综合计划”的细节。简而言之，准备单独囚禁和生物素基。然后囚禁成分是共轭雷帕（LC实验室），该产品随后加上素成分的点击反应7负担CRB手段。
- 准备的CRB 1μM的股票在DMSO溶液。
- 1mg的抗生物素蛋白溶解在250的PBS液0.5毫升的Eppendorf管中。
- CRB原液中加入1μL抗生物素蛋白溶解。混合反相几次。
- 孵育15分钟，在室温下产生CRB抗生物素蛋白结合（CRB-）解决方案。
- 排除未结合的小分子和净化CRB-A使用大小排斥列。
3。在显微镜和亚细胞水平的光照
- 血清挨饿12小时，在无血清培养液转染细胞。
- 轻轻地吸了媒体的细胞，并加入250μL准备好的400毫微米CRB解决方案（从2.6步）。
- 可视化蛋白质动力学，光治疗前，后生活的细胞在细胞内的决议，旋转盘显微镜（ 图2a）。紫外光照射UV LED灯（365纳米）与外延荧光光（ 图2b）由耦合光学实现。
- MetaMorph软件被用来捕捉每15秒转染细胞的荧光图像。
- 通过使用紫外光激发荧光染料涂在玻璃板定义照明点的坐标和大小。大小可以可以采用不同的放大倍数的物镜，通过选择不同的核心大小的光纤不同。
- 膜皱裂，照射紫外光后，决定在细胞周围的背景水平。下面的两个步骤是前本地化效果对比。
- 在全球范围内提供365纳米，由汞灯光照射的细胞。
- 解散开锁，从而在DMSO，然后在PBS（400毫微米）最后的原始霉素，并添加成像室解决方案，以促使全球影响。
4。代表结果
一个例子具有代表性的结果如图3所示。在蜂窝边缘附近的一个小区域的紫外光照射迅速诱导形成局部褶皱只有在和附近的照射面积。为了证实这的确是当地的活动，然后，我们在全球范围的紫外线照射细胞，或添加雷帕散装媒体，WHICH诱导遍布全球的膜皱褶形成。为定量分析，我们分为四个象限的靶细胞，并计算在每个象限根据当地的皱褶形成，以及根据各种条件，包括控制（图4）全球刺激后的频率。这是只有这种结合的紫外线照射，CRB-，并适当FKBP联邦储备银行的结构，引起当地皱裂。
图1。使用笼雷帕霉素抗生物素蛋白结合（CRB-A）的紫外光空间局限蛋白二聚体示意图。紫外线照射劈开雷帕霉素和生物素之间的连接器，导致释放的，化学dimerizer（HE-拉帕努伊 ，C40的-O-（2 -羟乙基） -雷帕霉素）和及其产品。然后释放dimerizer扩散进入细胞，并诱导二聚体之间FKBP的POI（兴趣蛋白）和血浆MEMBRANE联邦储备银行只在照射区域（蓝圈）附近停泊。没有紫外线的照射下，FKBP和联邦储备银行不联营公司（红十字会），因此不产生任何效果。 （版权所有：ACS2011）6
图2。定制的共焦荧光显微镜图片。 （一）正面共聚焦显微镜（Axiovert 200，蔡司倒置）。 （二）关闭，为计划免疫荧光和紫外线照射的耦合单元的顶视图。
图3。空间局限在转染NIH3T3细胞局部紫外线照射引起的皱褶形成。共聚焦荧光图像与YFP的标签FKBP-Tiam 1 mRNA（RAC激活）和LDR（膜锚联邦储备银行的）转染的NIH3T3成纤维细胞进行照射只限于在其边缘附近L区海关在15秒210秒开始，在CRB-共轭在散装媒体存在的365纳米的光。其次是这种治疗与汞全局照明灯1秒，1063秒和全球雷帕最后400毫微米除了1560秒。细胞发现几乎没有惹怒活动开始（一），但显示空间局限惹怒后局部照明（黄圈）（B）。后的细胞显示全局照明和雷帕霉素（CD）除了全球皱褶形成，表明当地皱褶形成，RAC激活空间局限造成的。比例尺：10微米。 （版权所有：ACS2011）6
图4象限的转染NIH3T3细胞中的皱褶形成的频率。当地紫外线照射与CRB-13细胞及以下全球紫外线照射。CRB- CRB-怎幺形成。我们收集了从细胞与低背景皱褶形成的数据，但有雷帕霉素诱导的皱褶形成，我们每个实验后检查，此外，雷帕霉素（最后400毫微米）的结果确认为全球皱褶形成能力。这些结果表明，CRB-A和当地的紫外线照射是在当地皱褶细胞形成所必需的。 （版权所有：ACS2011）6
缩写：
FKBP：FK506结合蛋白
联邦储备银行：FKBP-雷帕霉素结合蛋白
Tiam 1 mRNA：T细胞淋巴瘤侵袭转移诱导蛋白1（RAC环境基金）
的LDR：林恩-DSAG链接联邦储备银行（林恩：Lyn激酶N-末端11氨基酸）
拉帕：C40的- O - （2 -羟乙基） -雷帕霉素
CRB：笼与雷帕霉素生物素基
CRB-：CRB抗生物素蛋白结合
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Discussion
我们描述了一个技术，它采用一种新型的笼状化合物与FKBP联邦储备银行的异二聚体系统一起为了操纵Rho GTP酶的活性，在几秒钟的时间尺度上精确的亚细胞定位。
本办法有三个限制。首先，因为该方法的基础上，对防止或允许跨质膜dimerizer扩散的目标细胞的位置需要质膜或附近。可能使该化合物进入细胞，而直到光线照射诱导二聚体的的CRB化学结构的进一步优化。随着这种dimerizer，我们在理论上可以操纵的信号分子在细胞内的任何地方的活动。其次，的化学dimerizers，FKBP-FRB二聚体复杂，或激活内源性信号分子的分子扩散，可以极大地影响了预期的效果精确禁闭。此效果尤为显着在稍后的时间点，是依赖于紫外线照射（如波束宽度，能量，光束模式（连续与脉冲））和所涉及的化合物的扩散系数与相关参数。这些参数的经验进一步优化，使更严格的隔离信号活动。第三，紫外光表现出了不平凡的光毒性细胞。一个简单的方法来改善这个问题是不再使用，如405纳米的波长uncage硝基囚禁组。双光子uncaging照明，允许在更长的波长，以及在极其局部区域细胞的照明。最近，其他研究人员报告了一个优雅的方式来激活RAC使用光敏感的植物蛋白8-11在亚细胞位置。到目前为止，其应用受到限制，只有少数的蛋白质。他们的策略相比，我们目前的技术是更容易适应扩大的靶蛋白的数量，没有广泛和TI我耗时的重新设计。我们和其他人已经开发出多种二聚体探针，可以操纵不同的信号分子的活性，质膜5，6，12-14。现在直接测试的spatiotemporally动态蜂窝事件。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项研究是由美国国立卫生研究院的研究经费（DK090868和GM092930要德州仪器）的支持。有一个在笼中的雷帕霉素模拟待批专利。
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