Summary
En metod för spatio-temporal kontroll av små GTPas-aktivitet genom ljus beskrivs. Denna metod är baserad på rapamycin-inducerad FKBP-FRB heterodimerisering och foto-placering i kasse system. Optimering av ljus-bestrålning gör det möjligt för rums-tidsmässigt styrd aktivering av små GTPases på subcellulära nivå.
Abstract
Dynamisk reglering av Rho familj av små guanosin triphosphatases (GTPases) med stor Spatiotemporal precision är viktigt för olika cellfunktioner och evenemang 1, 2. Deras spatiotemporally dynamiska karaktär har avslöjats av visualisering av deras verksamhet och lokalisering i realtid 3. För att få djupare förståelse för deras roller i olika cellulära funktioner på molekylär nivå, bör nästa steg vara störning av protein aktiviteter på ett exakt subcellulär plats och tidpunkt.
För att uppnå detta mål har vi utvecklat en metod för ljus-inducerad, rums-tidsmässigt styrd aktivering av små GTPases genom att kombinera två metoder: (1) rapamycin-inducerad FKBP-FRB heterodimerisering och (2) en foto-placering i bur metod rapamycin. Med hjälp av rapamycin-medierad FKBP-FRB heterodimerisering, har vi utvecklat en metod för att snabbt induceras aktivering eller inaktivering av små GTPases including Rac 4, 4 Cdc42, RhoA 4 och Ras 5, i vilken rapamycin inducerar translokation av FKBP-fuserade GTPaser, eller deras aktivatorer, till plasmamembranet där FRB är förankrad. För koppling med detta heterodimerisering system har vi också utvecklat en foto-placering i bur system rapamycin analoger. Ett foto-bur föreningen är en liten molekyl vars aktivitet hämmas med en fotoklyvbar grupp känd som en bur grupp. För att undertrycka heterodimerisering verksamheten helt, utformade vi en bur rapamycin som är bundna till en makromolekyl så att det resulterande stora komplexet inte kan passera plasmamembranet, vilket leder till praktiskt taget ingen bakgrund aktivitet som en kemisk Dimeriserings inuti celler 6. Figur 1 visar ett schema av vår systemet. Med kombinationen av dessa båda system, rekryterade vi lokalt ett Rac aktivator till plasmamembranet på en tidsskala av sekunder och nådde ljus-inducerad Rac aktivering på subcellulära Level 6.
Protocol
1. Transfektion av plasmid-DNA
- Tillsätt plasmid-DNA och 0,5 pg membran-bunden FRB (hädanefter kallad LDR) och 0,5 ^ g av FKBP-Tiam1 (T-cell-lymfom och metastas-inducerande protein 1: Rac aktivator) märkt med fluorescerande protein till 37,5 | il dHaO 2 O. Tillsätt 1 pl Fugene HD.
- Vortexa och inkubera vid rumstemperatur under 20 minuter. Under tiden, gå till steg 1,3-1,8.
- Tvätta varje brunn av en 8-brunns kammare med 50 | il poly-D-lysin.
- Tvätta mitten av varje brunn med dH 2 O.
- Trypsinisera 80-85% sammanflytande NIH-3T3-celler och späd till 10 ml odlingsmedium (DMEM med 10% FBS).
- Ta bort 375 pl suspension och centrifugera vid 1750 rpm i 3 minuter.
- Aspirera medierna, är noga med att inte störa pelleten.
- Tillsätt 750 pl av DMEM vikt / 10% FBS och återsuspendera.
- Tillsätt cellsuspension till dH 2 O / DNA / Fugene HD-lösning och blanda försiktigt.
- Tillsätt 250il celler / DNA-suspensionen i varje brunn (kommer att fylla upp till 3 brunnar).
- Inkubera de transfekterade cellerna vid 37 ° C och 5% CO2 under 15-18 timmar.
2. Beredning av CRB-A lösning
- Syntetisera bur rapamycin-biotin addukt (CRB). Se "Syntetisk system för CRB" för mer information. Kortfattat Buren och biotin-grupper framställdes separat. Den bur delen är sedan konjugeras till rapamycin (LC lab), produkten kopplades därefter till biotindelen av ett medel för klick reaktion 7 för att ge CRB.
- Bered en 1-lösning M beståndet av CRB i DMSO.
- Lös 1 mg avidin i 250 | il av PBS i en 0,5 ml Eppendorf-rör.
- Tillsätt 1 pl CRB stamlösning till löst avidin. Blanda genom att vända flera gånger.
- Inkubera vid rumstemperatur under 15 min för erhållande av CRB-avidinkonjugat (CRB-A)-Lösning.
- Uteslut obundna små molekyler och rena CRB-A med en storlek-utanförskap kolumn.
3. Mikroskopi och Ljus belysning på Subcellulär nivå
- Serum svälta transfekterade celler i DMEM utan FBS under 12 timmar.
- Försiktigt aspirera media från cellerna och tillsätt 250 fil av det beredda 400 nM CRB-En lösning (från steg 2,6).
- Att visualisera protein dynamik i levande celler vid subcellulär upplösning före och efter ljusbehandlingen, snurrade disk mikroskopi används (figur 2a). UV-belysning uppnåddes genom koppling av optik för UV-lampan ljus (365 nm) med epi-fluorescens-ljus (Figur 2b).
- MetaMorph mjukvara användes för att fånga fluorescerande bilder av transfekterade celler var 15 sekunder.
- Definiera koordinaterna och storleken av en belysning fläck med användning av en glasplatta belagd med fluorescerande färgämnen som exciteras av UV-ljus. Storleken kandifferentieras genom tillämpning av objektiv med olika förstoringar och genom att välja optiska fibrer med olika core storlek.
- Efter bestämning bakgrundsnivåerna av membranet ruffling, bestråla UV-ljus vid periferin av celler. Följande två steg är att jämföra före lokala effekter.
- Globalt bestråla cellerna med 365 nm ljus från en kvicksilverlampa.
- Lös Uncaged, vilket original rapamycin i DMSO och sedan i PBS (400 nM slutlig), och tillsätt lösningen till avbildning kammaren att inducera globala effekter.
4. Representativa resultat
Ett exempel på representativa resultat visas i figur 3. UV-ljusbestrålning vid en liten region nära en cellulär kant snabbt inducerade bildning av lokaliserade rysch endast i och nära det bestrålade området. För att bekräfta att det verkligen var lokal aktivitet, vi sedan globalt bestrålas celler med UV-eller läggas rapamycin till bulk medier, både för whiCH induceras globala rufsar bildning genom hela membranet. För en kvantitativ analys, delade vi målceller i fyra kvadranter, och räknade frekvensen av rufsar bildas i varje kvadrant vid såväl lokala som följa den globala stimulering under olika förhållanden inklusive kontroller (Figur 4). Det är bara denna kombination av UV-strålning, CRB-A, och lämpliga FKBP-FRB konstruktioner som inducerar lokal ruffling.
Figur 1. Schematisk av rumsligt begränsad proteinet dimerisering med användning bur rapamycin-avidinkonjugat (CRB-A) och UV-ljus. UV-bestrålning klyver linkern mellan rapamycin och biotin, vilket resulterar i frisättning av kemiska Dimeriserings (HE-Rapa, C40-O-(2-hydroxietyl)-rapamycin) och dess biprodukt. Den frigjorda Dimeriserings diffunderar sedan in i celler och inducerar dimerisering mellan FKBP-POI (protein av intresse) och plasma MEMBRANE förankrad FRB endast i närheten av det bestrålade området (blå cirkel). Utan UV-bestrålning, FKBP och FRB inte förknippar (röda korset), och därför producerar ingen effekt. (Copyright @ ACS2011) 6
Figur 2. Bild på kundanpassade konfokala fluorescensmikroskop. (A) frontvy av det konfokala mikroskopet (inverterad Axiovert 200, Zeiss). (B) närbild, toppvy av en kopplingsenhet för EPI-fluorescens och UV-belysning.
Figur 3. Spatially begränsas rufsar bildning i en transfekterad NIH3T3 celler inducerad genom lokaliserad UV-bestrålning. Konfokala fluorescens bilder av en NIH3T3 fibroblast cell som transfekteras med YFP-märkt FKBP-Tiam1 (RAC aktivator) och LDR (membran förankrade FRB) genomgick strålning i ett begränsat område nära sin kant med LED-ljus vid 365 nm för 15 sek med början vid 210 sek, i närvaro av CRB-A-konjugat i bulk medier. Denna behandling följdes av den globala belysning med kvicksilverlampa i 1 sek vid 1063 sek och global tillägg av rapamycin slutliga 400 Nm vid 1560 sek. Cellen visade nästan ingen ruffling aktivitet i början (a) men visade rumsligt begränsad ruffling efter lokaliserad belysning (gul cirkel) (b). Cellen uppvisade globala rufsar bildning efter global belysning och tillsats av rapamycin (cd), vilket indikerar att den lokala bildningen rufsar orsakades av rumsligt begränsad aktivering av RAC. Skala bar: 10 nm. (Copyright @ ACS2011) 6
Figur 4. Frekvens av rufsar bildning i kvadranter av transfekterade NIH3T3-celler. Lokal UV bestrålning med CRB-A och följa den globala UV-bestrålning utfördes på 13 celler. CRB-A CRB-A utan UV-bestrålning, eller lokal UV-bestrålning med eller utan avidin i bulk medier. Vi samlade data från celler med låg bakgrund rufsa bildning, men som hade förmågan hos rapamycin-inducerad rufsar bildning, som vi kontrollerades efter varje experiment genom att bekräfta den globala rufsar bildning som ett resultat av tillsats av rapamycin (slutliga 400 nM). Dessa resultat visade att CRB-A och lokal UV-bestrålning är nödvändiga för lokal rufsar bildning i cellerna. (Copyright @ ACS2011) 6
Förkortningar:
FKBP: FK506-bindande protein
FRB: FKBP-rapamycin-bindande protein
Tiam1: T-cell-lymfom och metastas-inducerande protein 1 (Rac GEF)
LDR: Lyn-DSAG linker-FRB (Lyn: N-terminala 11 aminosyrorna av Lyn kinas)
HE-Rapa: C40-O - (2-hydroxietyl)-rapamycin
CRB: caged rapamycin med biotindel
CRB-A: CRB konjugerad till avidin
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskrivit en teknik som använder en ny bur förening tillsammans med FKBP-FRB heterodimerisering system för att manipulera Rho GTPase verksamhet på ett exakt subcellulär plats på en tidsskala av sekunder.
Det finns tre begränsningar av det nuvarande tillvägagångssättet. För det första eftersom metoden bygger på att förebygga eller tillåter diffusion av Dimeriserings över plasmamembranet behöver målet cellulära platsen att vara plasmamembranet eller dess närhet. Ytterligare optimering av den kemiska strukturen av CRB tillåta föreningen att komma in i celler utan att inducera dimerisering tills ljusbestrålning. Med en sådan Dimeriserings, kan vi i teorin manipulera verksamhet signalmolekyler var som helst i celler. För det andra kan molekylär diffusion av kemiska dimerizers och FKBP-FRB dimerisation komplexa eller aktiverade endogena signalmolekyler påverkar i hög grad exakta inneslutning av de avsedda effekterna. Denna effekt är speciellt uttaladvid senare tidpunkter och är beroende av parametrar som är associerade med UV-bestrålning (t.ex. strålbredd, energi och stråle (kontinuerlig kontra pulsad)) och koefficienterna spridning av de berörda föreningarna. Ytterligare empiriska optimering av dessa parametrar ger strängare isolering av signal aktiviteter. För det tredje uppvisar en UV-ljus icke-trivial fototoxicitet till celler. Ett enkelt sätt att förbättra detta problem är att använda en längre våglängd såsom 405 nm till uncage nitrobensylgrupper Buren grupper. Två-foton-belysning för uncaging tillåter belysning vid en ännu längre våglängd liksom vid extremt begränsat område av celler. Nyligen har andra forskare rapporterat ett elegant sätt att aktivera Rac på en subcellulär plats med ljuskänsliga växtproteiner 8-11. Hittills, är dess tillämpning begränsas till endast ett fåtal proteiner. Jämfört med sina strategier, är vår nuvarande teknik lättare kan anpassas till utöka antalet målproteiner utan omfattande och TiJag tidskrävande re-engineering. Vi och andra har redan utvecklat en rad dimerisering sonder som kan manipulera aktiviteten av olika signalmolekyler i plasmamembranet 5, 6, 12-14. Spatiotemporally dynamiska cellulära händelser är nu direkt testbar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av NIH forskningsmedel (DK090868 och GM092930 till TI). Det finns en väntande patent på en bur rapamycin analog.
References
- Etienne-Manneville, S., Hall, A.
- Takai, Y., Sasaki, T., Matozaki, T.
- Kiyokawa, E., Aoki, K., Nakamura, T., Matsuda, M. Spatiotemporal regulation of small GTPases as revealed by probes based on the principle of Forster Resonance Energy Transfer (FRET): Implications for signaling and pharmacology. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 51, 337-358 (2011).
- Inoue, T., Heo, W. D., Grimley, J. S., Wandless, T. J., Meyer, T. An inducible translocation strategy to rapidly activate and inhibit small GTPase signaling pathways. Nat. Methods. 2, 415-418 (2005).
- Komatsu, T. Organelle-specific, rapid induction of molecular activities and membrane tethering. Nat. Methods. 7, 206-208 (2010).
- Umeda, N., Ueno, T., Pohlmeyer, C., Nagano, T., Inoue, T. A photocleavable rapamycin conjugate for spatiotemporal control of small GTPase activity. J. Am .Chem. Soc. 133, 12-14 (2011).
- Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40, 2004-2021 (2001).
- Kennedy, M. J. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nat. Methods. 7, 973-975 (2010).
- Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction. Nature. 461, 997-1001 (2009).
- Wu, Y. I. A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells. Nature. 461, 104-108 (2009).
- Yazawa, M., Sadaghiani, A. M., Hsueh, B., Dolmetsch, R. E. Induction of protein-protein interactions in live cells using light. Nat. Biotechnol. 27, 941-945 (2009).
- Fegan, A., White, B., Carlson, J. C., Wagner, C. R. Chemically controlled protein assembly: techniques and applications. Chem. Rev. 110, 3315-3336 (2010).
- Suh, B. C., Inoue, T., Meyer, T., Hille, B. Rapid chemically induced changes of PtdIns(4,5)P2 gate KCNQ ion channels. Science. 314, 1454-1457 (2006).
- Varnai, P., Thyagarajan, B., Rohacs, T., Balla, T. Rapidly inducible changes in phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate levels influence multiple regulatory functions of the lipid in intact living cells. J. Cell. Biol. 175, 377-382 (2006).
