I den här artikeln visar vi analyser för att studera termisk nociception i<em> Drosophila</em> Larver. En analys involverar rumsligt begränsad (lokal) stimulering av termiska nociceptorer<sup> 1,2</sup> Medan den andra innebär en grossist (global) aktivering av de flesta eller alla sådana neuroner<sup> 3</sup>. Sammantaget visar dessa tekniker möjliggör visualisering och kvantifiering av de beteendemässiga funktioner<em> Drosophila</em> Nociceptiva sensoriska neuroner.
I den här artikeln visar vi analyser för att studera termisk nociception i Drosophila larver. En analys involverar rumsligt begränsad (lokal) stimulering av termisk nociceptorer 1,2 medan den andra innebär en grossist (global) aktivering av de flesta eller alla sådana neuroner 3. Tillsammans utgör dessa tekniker kan visualisering och kvantifiering av de beteendemässiga funktioner Drosophila nociceptiva sensoriska neuroner.
Drosophila larv är en etablerad modell för att studera termisk nociception, ett sensoriskt svar till potentiellt skadliga temperaturer som evolutionärt är konserverad mellan arter 1,2. Fördelarna med Drosophila för dessa studier är den relativa enkelheten i dess nervsystem och sofistikerade av de genetiska tekniker som kan användas för att dissekera den molekylära grunden för den underliggande biologin 4-6 i Drosophila, som i alla metazoer de response för att skadliga termiska stimuli innebär i allmänhet en "nocifensive" obehaglig tillbakadragande till den presenterade stimulans 7. Sådana stimuli detekteras genom fria nervändar eller nociceptorer och amplituden hos den organismens respons beror på antalet av nociceptorer mottar skadligt stimulus 8. I Drosophila är det klass IV dendritiska förgrening sensoriska nervceller som upptäcker skadliga termiska och mekaniska stimuli 9 i tillägg till deras nyligen upptäckt roll som fotoreceptorer 10. Dessa nervceller, som har mycket bra studerats på utvecklingsnivå, arborize över barriären epidermal arket och knyta kontakter med nästan alla epidermalceller 11,12. Den enda axon i varje klass IV neuron projekt i den ventrala nerven ur det centrala nervsystemet 11 där de kan ansluta till andra ordningens neuroner som skjuter till hjärnan.
Enligt huvudscenariot, nociceptiv sensorisk neurons kommer inte att skjuta förrän en relativt hög tröskel nås. Analyserna som beskrivs här tillåter forskaren att kvantifiera grundläggande beteendemässiga svar eller, förmodligen, sensibilisering som följer efter vävnadsskada. Varje analys framkallar olika men besläktade motoriskt beteende svar på skadliga termiska stimuli och tillåter forskaren att visualisera och kvantifiera olika aspekter av termisk nociception i Drosophila larver. Analyserna kan användas för larver av önskade genotyper eller larver upp under olika miljöförhållanden som kan påverka nociception. Eftersom termisk nociception bevaras över arter kommer resultaten erfarenheter som samlats från genetisk dissektion i Drosophila informera sannolikt vår förståelse av termisk nociception i andra arter, inklusive ryggradsdjur.
Analyserna som beskrivs här kan användas för att kvalitativt och kvantitativt bedöma larver av olika genotyper för lyhördhet för skadliga termiska stimuli. En viktig aspekt av den värme som sonden analysen är att stimulans ges endast vid ett enda ställe. Detta leder sannolikt till bränning av endast en liten undergrupp av klass IV neuroner-de i segmentet i kontakt med sonden och kanske de i omedelbart intilliggande segment 11. På grund av den lokala stimulering, härmar den värme-probanalys den gemensamma sensorisk upplevelse av att detektera en skadlig retning som är lokaliserad till ett visst organ regionen, t.ex. en handen bringa en varm ugn. En nackdel med det värme-probanalys är att det ej har någon användare-till-användare variabilitet som sannolikt kan tillskrivas tre faktorer: i) det tryck med vilket användaren är tillämpligt sonden till larv, ii) det exakta läget för sonden på larven i förhållande till de underliggande nociceptiva neuroner och, iii) den exakta angle, vid vilken sonden i kontakt med ytan hos larven.
Vi har tidigare rapporterat en kvantitativ strategi kategorisera larver i icke-responders, långsamma responders och snabba responders baserat på deras tillbakadragande latens till en viss temperatur 1. Här rapporterar vi om larver lyhördhet för ännu högre temperaturer. Intressant, tycker vi att det finns ett tak för larver termiska nociceptiva svar och att detta tak ligger mellan 52 och 54 ° C. Detta kan tyda på att larver inte har en övergående receptor potential (TRP) kanal som kan slussning vid temperaturer högre än 52 ° C. Alternativt kan det tyder på att de nervceller eller muskler som används för att initiera eller utföra motorisk respons skadas innan de ens kan fungera i aversiv tillbakadragande. Vi rapporterar också en annan analys av amplituden för den tillbakadragande respons-användning av antingen antalet rullar som en indikator på den "robusthet" av svaret. Naivt, enskulle förvänta att dessa parametrar skulle öka med ökande temperatur eller tid av stimulering. Överraskande, finner vi att detta inte är fallet. Larver stimulerades under en längre tid vid en temperatur i den lägre delen av den skadliga intervallet (42 ° C) åskådliggör ytterligare rullar och mer tid valsning än larver sonderades vid högre temperaturer (48-52 ° C). Detta antyder att i den skadliga temperaturfönster det primärt är exponeringstiden, som bestämmer amplituden hos responsen. Eftersom larver exponeras för starkt skadliga temperaturer (48-52 ° C) reagera i genomsnitt mycket snabbt, de inte uppvisar så många valsar som larver exponeras för en mindre skadlig temperatur under en längre tidsperiod. Analysen av svaret amplituden redovisas här ger en kvantitativ dimension längs vilken olika genotyper eller miljö manipulationer kan jämföras.
En viktig aspekt av den värme som plattan analysen är att det handlar om en global exponering för skadligavärme. Som sådan är det mer liknar djuret sitta i en värme-gryta än att röra en het spis. Även om det är oklart när en larv kan uppleva ett globalt skadlig stimulans i naturen, i labbet beteendemässiga svaren till denna globala exponering är mer komplicerade än de som observerats vid lokal stimulering. En styrka av värmen plattan analysen, också noterat av andra 3, är att den har lite användare till användare variabilitet sedan röra larven inte är en del av protokollet. Den enda betydande variationen verkar vara att definiera när varje beteende inleds och detta kan minimeras med upprepad visning / kännedom. En intressant skillnad mellan analyserna är de temperaturer vid vilka de aversiva beteenden börja. Dessa är mycket lägre i den värme plattanalys än med värme-sonden. Den preliminära beteende som uppvisas av larver i kontakt med det värme-sond (huvud och svans höjning) kan vara en korrelera av huvudet trash observerades vid ~ 27 ° C i värme plate-analys. Det är möjligt att detta svar speglar "obehag" mer än "smärta". Vi har inte observerat ett nödvändigt korrelat för piska, beslag, och förlamning även vid hög (upp till 48 ° C) temperaturer i värmen sonden analysen och det kan vara att en kritisk massa av sensoriska neuron bränning från mer än en region av kroppen är krävs för att dessa beteenden. Intressant är beslag och förlamning beteenden observerades vid temperaturer (~ 34 till 37 ° C) under den nedre änden av nociceptiv tröskeln observerats med värmen proben indikerar att den globala stimulering kan innebära summering av neuronala svar som är otillräckliga för att utlösa beteendet med lokala applicering av värme sonden. Dessa temperaturer är i själva verket ses som skadliga för larverna stöds av observationen att larverna att påbörja förlamning beteende och därefter fick återhämta på fly livsmedel inte i de flesta fall överleva (figur 5C). Ytterligare stöd för argumentet att värmen PLåt analysen utläsning nociceptiva svaren är det faktum att blockering av synaptisk överföring i kända nociceptiva sensoriska neuroner ökar latensen för de flesta av de observerade beteendena (figur 6). Observationen att det inte finns någon ökning latens för den högre temperatur piska beteende tyder på att andra sensoriska nervceller som inte uttrycker MD-Gal4 kan krävas för detta beteende.
Sammanfattningsvis båda analyserna innebär att utsätta en individ larv till en skadlig termisk stimulans definieras temperatur – den heta spetsen av en liten metall sond i den lokala analysen och nedsänkning i en droppe snabbt värma vatten i den globala analysen. Beteendemässiga svaren hos Drosophila larver av varierande genetiska bakgrunder och / eller utsätts för varierande miljöförhållanden (t ex plus eller minus vävnadsskada), kan studeras och kvantifieras med användning av dessa analyser. I slutändan kommer resultatet från dessa analyser att hjälpa oss att bättre förstå genetiska nätverk som styr NOCiception i Drosophila och andra besläktade arter.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Christian Landry för värme prob design, Daniel Babcock för att utveckla larver analysen värmen sond, Sean Sweeney för att föreslå analysen värmen platta, Bloomington Drosophila Stock Center for flyga bestånd och Galko lab medlemmarna för kritisk läsning av manuskriptet. Detta arbete stöddes av NIH R01 NS069828 att MJG och NIH MARC U-STAR träningsprogram Grant (T34GM079088 till University of Houston-Downtown Scholars Academy) för minoriteternas tillgång till forskarkarriären (AVG).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Thermal Probe | Pro-Dev Engineering | Custom-built on demand | Contact information can be provided on request |
Dry Bath Incubator | Fisher Scientific | 11-718 | 1 solid heating block and 1 heating block with 16mm wells |
Leica DFC290 12v/400mA Color camera |
Leica Microsystems | 12730080 | Any equivalent camera will do. |
Leica MZ6 microscope | Leica Microsystems | Part number for MZ6 zoom body (optics carrier) is 10445614 | |
Schott Ace Modulamp Unit | Schott North America, Inc. | A20500 | |
Schott Dual Gooseneck 23 inch Fiber Optic Light Guide | Schott North America, Inc. | Schott A08575 | |
Thermal Control Unit | TSCI corp. | Custom Built | Details can be provided on request |
Zeiss Stemi 2000 microscope | Zeiss | NT55-605 | Any equivalent microscope will do. |
Forceps | FST | FS-1670 | |
1mm mesh | Genesee Scientific | 57-101 | |
Paintbrush | Dick Blick Art Materials | 06762-1002 | |
UV crosslinker | Fisher Scientific | 1199289 | |
Coplin Jars | Fisher Scientific | 08-816 | |
10ml beaker | Fisher Scientific | 02-540C | |
Diethyl ether | Fisher Scientific | E138-500 | |
35 X 10 mm Polystyrene Petri Dish | Falcon | 351008 | We have not tested alternative dishes. |
Glass Microscope Slide | Corning | 26003 | |
Thermocouple | Omega Engineering, Inc. | HH802U | |
Piece of vinyl | Office Depot | 480009 | |
Microcentrifuge tube | Denville Scientific Inc. | C-2170 |