במאמר זה, אנחנו מדגימים מבחני ללמוד nociception תרמית<em> תסיסנית</em> זחלים. אחת assay כולל גירוי מרחבית, מוגבלת (מקומי) של nociceptors תרמית<sup> 1,2</sup> ואילו השני כולל הפעלת הסיטונאי (העולמי) של רוב או את כל הנוירונים כאלה<sup> 3</sup>. יחד טכניקות אלה מאפשרות הדמיה וכימות של פונקציות התנהגות של<em> תסיסנית</em> עצב סנסורי nociceptive.
במאמר זה, אנחנו מדגימים מבחני ללמוד nociception תרמית הזחלים תסיסנית. אחת assay כולל גירוי מרחבית, מוגבלת (מקומי) של 1,2 nociceptors תרמית ואילו השני כולל הפעלת הסיטונאי (העולמי) של רוב או את כל הנוירונים כאלה 3. יחד טכניקות אלה מאפשרות הדמיה וכימות של פונקציות התנהגות של נוירונים חושיים תסיסנית nociceptive.
הזחל תסיסנית היא מערכת מודל הוקמה ללמוד nociception תרמית, תגובה חושית לטמפרטורות מזיקים, כי הוא שמור באבולוציה על פני 1,2 מינים. יתרונותיה של תסיסנית עבור מחקרים כאלה הם הפשטות היחסית של מערכת העצבים ואת התחכום של טכניקות גנטיות שניתן להשתמש בהם כדי לנתח את הבסיס המולקולרי של הביולוגיה הבסיסית 4-6 ב תסיסנית, כמו כל metazoans, respons אתדואר לגירויים תרמית רעילים בדרך כלל כרוך בנסיגה "nocifensive" מרתיעה לגירוי המוצג 7. גירויים אלה מזוהים באמצעות קצות עצבים או nociceptors חופשיות משרעת התגובה האורגניזם תלוי במספר nociceptors שקיבלו גירוי מזיק 8. ב תסיסנית, זה arborization את המעמד הרביעי הדנדריטים עצב סנסורי המזהים גירויים תרמי מכני רעילים 9 בנוסף לתפקיד לאחרונה גילו שלהם photoreceptors 10. אלו נוירונים, אשר נחקרו היטב ברמה התפתחותית, arborize על דף את מחסום האפידרמיס וליצור קשרים עם כמעט כל התאים אפידרמיס 11,12. האקסון אחת של כל אחד הרביעי פרויקטים ברמה נוירונים לתוך חוט העצב הגחון של מערכת העצבים המרכזית 11 שבו הם יכולים להתחבר 2 מסדר נוירונים הפרויקט למוח.
בתנאי הבסיס, נוירו חושית nociceptiveNS לא יפטר עד לסף גבוהה יחסית הוא הגיע. מבחני המתוארים כאן לאפשר לחוקר לכמת תגובות התנהגותיות או הבסיס, יש להניח, כי רגישות מתפתח נזק לרקמות הבאות. Assay זה מעורר נפרדים אך קשורים תגובות התנהגותיות locomotory לגירויים תרמית רעילים ומאפשר לחוקר לחזות ולכמת היבטים שונים של nociception תרמית הזחלים תסיסנית. מבחני ניתן להחיל את הזחלים של גנוטיפים הרצויות או זחלים העלה בתנאים סביבתיים שונים שעשויים להשפיע nociception. מאז nociception תרמית נשמרת בין זנים, הממצאים שלוקטו לנתיחה גנטי תסיסנית צפויה להודיע הבנתנו nociception תרמית של מינים אחרים, כולל בעלי חוליות.
מבחני שתוארו כאן ניתן להעריך איכותית וכמותית הזחלים של גנוטיפים שונים של היענות לגירויים תרמית רעילים. התכונה העיקרית של assay בדיקה החום הוא הגירוי ניתנת רק מוקד אחד. זה כנראה מוביל ירי של תת היחידה הקטנה של המעמד הרביעי נוירונים-the אלה במגזר קשר עם החללית ואולי אלה מיד קטעים הסמוכים 11. בגלל גירוי מקומי, assay בדיקה החום מחקה את החוויה החושית משותף של גילוי גירוי מזיק, כי הוא מקומי לגוף מסוים באזור, כגון יד יצירת קשר עם תנור חם. החיסרון של assay בדיקה חום היא כי יש כמה לשונות המשתמש אל המשתמש יכול סביר לייחס לשלושה גורמים: א) את הלחץ שבו המשתמש חל בדיקה כדי הזחל, ב) את המיקום המדויק של החללית על הזחל יחסית לתאי העצב nociceptive הבסיסית, ו, ג) ang מדויקלה בו בדיקה קשרים פני השטח של הזחל.
אנחנו קודם לכן דיווחו אסטרטגיה כמותית של הזחלים לסווג את המגיבים, שאינם מגיבים איטיים, המגיבים מהר המבוססים על זמן אחזור נסיגתם לטמפרטורה מסוימת 1. כאן אנו מדווחים על היענות הזחל לטמפרטורות גבוהות יותר אפילו. מעניין, אנו מוצאים כי קיימת תקרה הזחל תגובות nociceptive תרמית וכי התקרה זה נמצא בין 52 ו – 54 ° C. זה עשוי להצביע על כך הזחלים אינם בעלי פוטנציאל הקולטן חולף (TRP) ערוץ מסוגל gating בטמפרטורות גבוהות מ 52 ° C. לחלופין, הוא יכול להציע את הנוירונים או השרירים ליזום או לבצע את תגובת המנוע ניזוק לפני שהם יכולים גם לתפקד הנסיגה מרתיעה. כמו כן, אנו מדווחים על ניתוח שונה של משרעת של נסיגה בתגובה, או באמצעות מספר לחמניות אינדיקטור "חוסן" התגובה. בתמימות, 1היינו מצפים כי הפרמטרים הללו יגדילו את הטמפרטורה או הגדלת זמן של גירוי. למרבה ההפתעה, אנו מוצאים כי זה לא המקרה. הזחלים מגורה זמן רב יותר בטמפרטורה בקצה הנמוך של טווח מזיק (42 ° C) הצג לחמניות יותר ויותר זמן ביליתי מתגלגל מ הזחלים נחקר בטמפרטורות גבוהות (48-52 מעלות צלזיוס). הדבר מצביע על כך בתוך חלון הטמפרטורה מזיק זה בעיקר משך החשיפה הקובע את האמפליטודה של התגובה. מאז הזחלים חשופים לטמפרטורות רעילים מאוד (48-52 מעלות צלזיוס) להגיב בממוצע מהר מאוד, הם אינם מציגים כמו לחמניות רבים ככל זחלי נחשף לטמפרטורה מזיק פחות לאורך זמן ארוך יותר. אנליזה של משרעת התגובה דווח כאן מוסיף עוד מימד כמותי שלאורכו גנוטיפים שונים או מניפולציות סביבתיות ניתן להשוות.
התכונה העיקרית של assay צלחת חום היא שזה כרוך בחשיפה גלובלית מזיקחום. ככזה, הוא דומה יותר לחיה יושב קלחת חימום מאשר לגעת בתנור חם. אם כי לא ברור מתי הזחל עשויה לחוות גירוי מזיק ברחבי העולם בטבע, במעבדה את תגובות התנהגותיות חשיפה הגלובלי הזה הם מורכבים יותר מאשר אלו שנצפו על גירוי מקומי. כוחו של assay צלחת חום, ציין גם על ידי אחרים 3, היא כי יש שונות קטנה המשתמש אל המשתמש מאז נוגע הזחל אינו מרכיב של הפרוטוקול. השונות רק ניכר נראה בהגדרת כאשר התנהגות זו מתחילה וזה יכול להיות ממוזער עם צפייה חוזרת / היכרות. הבדל מעניין בין מבחני הוא הטמפרטורה שבה ההתנהגויות אברסיביים להתחיל. אלה הם הרבה יותר נמוך ב assay צלחת חום מאשר עם החללית חום. התנהגות ראשונית הוצגו על ידי הזחלים קשר עם החללית חום (ראש ולהעלות את הזנב) עשוי להיות מתאם של ת'ראש ראש העיר ב ~ 27 ° C ב Plat חוםדואר assay. יתכן כי תגובה זו משקפת "נוחות" יותר "כאב". אנחנו לא נצפה מתאם של הצלפה, פרכוסים, ושיתוק אפילו גבוהה (עד 48 מעלות צלזיוס) בטמפרטורות ב assay בדיקה חום וייתכן כי מסה קריטית של תא עצב תחושתי ירי מאזור אחד או יותר של הגוף היא צריך להביא על התנהגויות אלה. מעניין לציין, כי התנהגויות של תפיסה ושיתוק הם נצפו בטמפרטורות (~ 34-37 ° C) מתחת בסופו של דבר לסף התחתון של nociceptive ציין עם החללית חום המעיד כי גירוי העולמי עשוי לכלול סיכום של תגובות עצביות, כי הם לא מספיק כדי לעורר התנהגות עם המקומיים היישום של החללית חום. אלה הטמפרטורות נתפסים ממש כמו מזיק זחלי נתמך על ידי התבוננות כי זחלים שמתחילים התנהגות שיתוק מותר לאחר מכן לשחזר את האוכל זבוב לא ברוב המקרים לשרוד (איור 5 ג). יתר על כן התומכות בטענה כי החום PLassay אכלו קורא את התגובות nociceptive היא העובדה כי חסימת הולכה סינפטית ב הידועים עצב סנסורי nociceptive מגדיל את זמן האחזור של רוב ההתנהגויות הנצפות (איור 6). תצפית שאין עליה חביון על התנהגות גבוה יותר בטמפרטורה מתוקה עולה כי נוירונים חושיים אחרים שאינם מבטאים MD-Gal4 עשויות להידרש להתנהגות זו.
לסיכום, שני מבחני כרוך בחשיפת הזחל הפרט לגירוי תרמי מזיק של הטמפרטורה מוגדר – עצה חמה של החללית מתכת קטן assay טבילה המקומית בטיפת מים במהירות חימום assay העולמי. תגובות התנהגותיות של הזחלים תסיסנית משתנה רקע גנטי ו / או חשיפה לתנאי סביבה משתנים (למשל פלוס או מינוס נזק לרקמות), ניתן ללמוד לכמת באמצעות אלה מבחני. בסופו של דבר, התוצאות של מבחני אלה יסייעו לנו להבין טוב יותר רשתות גנטיות השליטה NOCiception ב תסיסנית ו מינים קרובים אחרים.
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים כריסטיאן לאנדרי על עיצוב החללית חום, דניאל בבקוק לפיתוח חום הזחל בדיקה assay, שון סוויני עבור המצביע על הצלחת חום assay, תסיסנית Bloomington מרכז במלאי למניות לעוף, Galko חברי המעבדה של קריאה ביקורתית של כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי NIH R01 NS069828 כדי MJG ואת מרק NIH U-STAR הדרכה גרנט (T34GM079088 לאוניברסיטת יוסטון-Downtown חוקרים באקדמיה) עבור גישה המיעוט לקריירות המחקר (ממוצע).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Thermal Probe | Pro-Dev Engineering | Custom-built on demand | Contact information can be provided on request |
Dry Bath Incubator | Fisher Scientific | 11-718 | 1 solid heating block and 1 heating block with 16mm wells |
Leica DFC290 12v/400mA Color camera |
Leica Microsystems | 12730080 | Any equivalent camera will do. |
Leica MZ6 microscope | Leica Microsystems | Part number for MZ6 zoom body (optics carrier) is 10445614 | |
Schott Ace Modulamp Unit | Schott North America, Inc. | A20500 | |
Schott Dual Gooseneck 23 inch Fiber Optic Light Guide | Schott North America, Inc. | Schott A08575 | |
Thermal Control Unit | TSCI corp. | Custom Built | Details can be provided on request |
Zeiss Stemi 2000 microscope | Zeiss | NT55-605 | Any equivalent microscope will do. |
Forceps | FST | FS-1670 | |
1mm mesh | Genesee Scientific | 57-101 | |
Paintbrush | Dick Blick Art Materials | 06762-1002 | |
UV crosslinker | Fisher Scientific | 1199289 | |
Coplin Jars | Fisher Scientific | 08-816 | |
10ml beaker | Fisher Scientific | 02-540C | |
Diethyl ether | Fisher Scientific | E138-500 | |
35 X 10 mm Polystyrene Petri Dish | Falcon | 351008 | We have not tested alternative dishes. |
Glass Microscope Slide | Corning | 26003 | |
Thermocouple | Omega Engineering, Inc. | HH802U | |
Piece of vinyl | Office Depot | 480009 | |
Microcentrifuge tube | Denville Scientific Inc. | C-2170 |