Aspiration par micropipette des cellules au substrat joints pour estimer la rigidité cellulaire

Summary

Nous décrivons ici une méthode simple et rapide pour mesurer la rigidité cellulaire. Le principe général de cette approche consiste à mesurer déformation de la membrane en réponse à bien défini pression négative appliquée par le biais d'une micropipette à la surface cellulaire. Cette méthode fournit un outil puissant pour étudier les propriétés biomécaniques du substrat-jointes cellules.

Abstract

Nombre croissant d'études montrent que les propriétés biomécaniques des cellules individuelles jouent un rôle majeur dans de multiples fonctions cellulaires, y compris la prolifération cellulaire, la différenciation, la migration et interactions cellule-cellule. Les deux paramètres clés de la biomécanique cellulaires sont déformabilité cellulaire ou la rigidité et la capacité des cellules de se contracter et générer de la force. Nous décrivons ici une méthode rapide et simple pour estimer la rigidité cellulaire en mesurant le degré de déformation de la membrane en réponse à une pression négative appliquée par une micropipette de verre à la surface cellulaire, une technique qui s'appelle aspiration par micropipette ou microaspiration.

Microaspiration est effectuée en tirant un capillaire en verre pour créer une micropipette avec une pointe très petit (2-50 um de diamètre en fonction de la taille d'une cellule ou un échantillon de tissu), qui est ensuite reliée à un transducteur de pression pneumatique et amené à sa fin proximité d'une cellule sous un microscope. Lorsque l'la pointe de la pipette en contact avec une cellule, une étape de pression négative est appliquée à la pipette par le transducteur de pression pneumatique générant une pression bien définie sur la membrane cellulaire. En réponse à la pression, la membrane est aspiré dans la pipette et la membrane déformation progressive ou "membrane projection" dans la pipette est mesurée en fonction du temps. Le principe de base de cette approche expérimentale est que le degré de déformation de la membrane en réponse à une force définie mécanique est fonction de la rigidité de membrane. La rigidité de la membrane est, plus la vitesse de déformation de la membrane et plus la technique de l'état d'équilibre aspiration length.The peut être effectuée sur des cellules isolées, à la fois en suspension et le substrat-joints, organites grandes, et des liposomes.

Analyse est effectuée en comparant les déformations maximales membranaires obtenus sous une pression donnée pour différentes populations de cellules ou des conditions expérimentales. Un «coefficient de rigidité» est estimée en traçant la longueur de déformation de la membrane à aspiration en fonction de la pression appliquée. En outre, les données peuvent être analysées pour estimer le module d'Young des cellules (E), le paramètre le plus courant pour caractériser la rigidité des matériaux. Il est important de noter que les membranes plasmiques des cellules eucaryotes peut être considéré comme un système bi-composant où bicouche lipidique membranaire est sous-tendue par le cytosquelette sous-membranaire et que c'est le cytosquelette qui constitue l'échafaudage mécanique de la membrane et domine la déformabilité de l'enveloppe cellulaire. Cette approche, par conséquent, permet de sonder les propriétés biomécaniques du cytosquelette sous-membranaire.

Protocol

1. Tirer Micropipettes en verre Equipement: Micropipette Puller, microforge. Verre: Boroscillicate capillaires en verre (~ 1,5 mm de diamètre externe, ~ 1,4 mm de diamètre interne). Micropipettes sont tirés en utilisant la même approche de base qui est utilisé pour préparer des microélectrodes de verre pour les enregistrements électrophysiologiques. En bref, un capillaire en verre est chauffé …

Discussion

Microaspiration fournit une méthode simple et hautement reproductible pour estimer la rigidité cellulaire / déformation en appliquant une pression négative à une membrane cellulaire et la mesure de la déformabilité membrane en réponse à une pression bien défini. Il a d'abord été développé par Mitchison et Swann (1954) pour caractériser les propriétés élastiques des œufs d'oursin à fournir des indications sur les mécanismes de la division cellulaire de ^21, puis de regarder les prop…

Materials

Name of reagent	Company	Catalog/Model Number	Comments
Sutter pipette puller	Sutter Instruments	P-97
Microforge	Narishige	MF-830
Inverted Fluorescent Microscope	Zeiss	Axiovert 200M	The microscope should be preferably equipped with 3D/deconvolution capabilities.
Videocamera	Zeiss	AxioCam MRm
Image Acquisition sotware	Zeiss	AxioVision
Pneumatic Pressure Transducer	BioTek	DPM-1B	DPM1B Pneumatic Transducer Tester can now be found by FLUKE.
Pipette glass	Richland	Customized glass	Pipettes were customized with a 1.2 inner diameter and 1.6 outer diameter.
DiI Dye	Invitrogen	D282	Dissolves well in DMSO