Isotachophoresis (ITP) er en robust elektrokinetiske separation og preconcentration teknik med ansøgninger fra toksin afsløring til prøveforberedelse. Vi gennemgår de fysiske principper for ITP, og den metode at anvende denne teknik til to specifikke eksempel programmer: adskillelse og detektion af små molekyler og oprensning af nukleinsyrer fra cellekultur lysat.
Elektrokinetiske teknikker er et dagligt syn i mikroskala applikationer på grund af deres unikke evne til at udføre en bred vifte af fluidisk og elektroforetiske processer i enkle, kompakte systemer med ingen bevægelige dele. Isotachophoresis (ITP) er en enkel og robust elektrokinetisk teknik, kan opnå million-fold preconcentration 1,2 og effektiv separation og ekstraktion baseret på ionisk mobilitet. 3 For eksempel har vi vist, at anvendelsen af ITP til separation og følsom detektion af umærket ioniske molekyler (f.eks toksiner, DNA, rRNA, miRNA) med ringe eller ingen prøveforberedelse 4-8 og til ekstraktion og oprensning af nukleinsyrer fra komplekse matricer, herunder cellekulturer, urin og blod. 9-12
ITP opnår fokusering og separation under anvendelse af en påført elektrisk felt og to buffere i en strømningsteknisk kanalsystem. For anioniske analytter er ledende elektrolyt (LE) puffer valgt sn sådan at dens anioner har højere effektiv elektroforetisk mobilitet end anioner af den bageste elektrolyt (TE)-buffer (Effektiv mobilitet beskriver observerbare drift hastighed af en ion-og tager hensyn til ionisering tilstand ion, som beskrevet i detaljer af Persat et al 13). Efter oprettelse af en grænseflade mellem TE og LE er et elektrisk felt anvendes sådan, at LE ioner bevæge sig væk fra området besat af TE ioner. Eksempler på ioner af mellemliggende effektiv mobilitet løb foran TE ioner, men kan ikke overhale LE ioner, og så de fokuserer på LE-TE interface (herefter kaldet "ITP grænseflade"). Endvidere TE og Le danner regioner henholdsvis lav og høj ledningsevne, der etablerer en stejl elektrisk felt gradient ved ITP grænsefladen. Dette felt gradient preconcentrates prøve arter, som de fokuserer. Korrekt valg af TE og LE resultater i fokus og rensning af målarter fra andre ikke-fokuserede arter og i sidste ende, separation end adskillelse af prøve arter.
Vi her gennemgå de fysiske principper bag ITP og diskutere to standard driftsformer: "peak" og "plateauet" tilstande. Den maksimale indstilling, fortyndes relativt prøveioner koncentreres sammen i overlappende snævre toppe ved ITP grænsefladen. I plateau-tilstand, når mere rigelige prøveioner en steady state-koncentration og adskiller sig i tilstødende plateau-lignende zoner, ordnet efter deres effektiv mobilitet. Peak og plateau tilstande udspringer af de samme underliggende fysik, men repræsenterer forskellige regimer differentieret på grundlag af den indledende analytkoncentration og / eller den tid der er afsat til prøven akkumulering.
Vi først beskrive i detaljer en model top tilstand eksperiment og derefter viser en top tilstand assay til ekstraktion af nukleinsyrer fra E. coli cellekultur. Vi konkluderer ved at præsentere et plateau tilstand analyse, hvor vi bruger en ikke-fokus sporstof (NFT) arter til at visualisere den separation og prdannelse kvantificering af aminosyrer.
ITP metoder, der præsenteres her sikre en hurtig, følsom, og robust detektion og håndtering af ioniske molekyler. Den største udfordring i at bruge ITP er korrekt valg af LE og TE buffere. I anioniske ITP, typisk vælger vi chlorid som den ledende anionen, fordi det er en stærk syre med meget høj absolut mobilitet og således har meget forudsigelige egenskaber. Derfor er buffer valg i anioniske ITP typisk reduceret til at vælge en ordentlig TE og modionen. For selektive fokus eksperimenter, er TE valg afgørende for udelukkelse af forurenende ioner. I applikationer, hvor forurenende stoffer ikke er til stede, medfører lavere TE effektiv mobilitet til hurtigere at fokusere. Vi anbefaler at bruge følgende, relativt velopdragne anioniske TE ioner: MES, MOPS, HEPES, tricin. Valg af modionen påvirker både system pH og TE effektiv mobilitet. Almindelige modioner er tris (pKa 8,1) og bis-tris (pKa 6,4). For analyser, der kræver lavere eller højere pH, anbefaler vi pyridin (pKa 5,25) ogethanolamin (pKa 9,5), hhv. I tabel 1 og 2, for anioniske og kationiske ITP henholdsvis opsumme adskillige nyttige buffer eksempler. Vi tager HCI som den anioniske LE ion og natrium som den kationiske LE ion, og vi antager 100 mM ionstyrke LE buffer.
Læseren vil bemærke, at bufferen ionstyrke i vore protokoller (og i tabel 1-2) altid er større end eller lig med 10 mM. Mens der i teorien fysik ITP anvendelse ved ionisk styrke lavere end 10 mM, naturlige kontaminanter (f.eks carbonsyre fra reaktion mellem vand og atmosfærisk carbondioxid) nær 1 mM plan ofte begrænse den praktiske anvendelse af lav ionstyrke buffere.
Vi bemærker, at signaltransduktion mekanisme ikke er begrænset til de assays, der præsenteres i denne protokol. Som kort beskrevet i del 5, i plateau-tilstand renset zoner kan påvises via ændringer i den lokale ledningsevne, UV-absorbance, temperatur eller brydningsindeks. I vores egen gruppe, har vi udviklet en metode, der benytter fluorescerende carrier ampholytter til følsom påvisning og identifikation af ukendte analytter. 5 i top mode eksperimenter, kan specifikke prober bruges til at mærke fokuserede analytter. I et eksempel, anvender vi Molecular Beacons – oligonukleotidprober, som fluorescerer ved hybridisering til deres målsekvens – til påvisning af mål-DNA-eller RNA-molekyler med høj specificitet 11,18.
Mens ITP er relativt robust til dispersionen som følge af tryk-drevet flow og EOF, kan overdreven EOF føre til stagnation af ITP grænsefladen, hvor den gennemsnitlige EOF hastighed bliver lig med ITP hastighed. 14. Disse stærke EOF forekommer især under forhold med høj pH-værdi og lav ionstyrke. Af denne grund anbefaler vi anvendelse af puffere med pH 8 eller derunder og med ionstyrke af størrelsesordenen 100 mm, hvis passende. Det er vores erfaring, er PVP denmest effektive belægning EOF suppression i borsilicat chips. Men på grund af dets passage gennem en sigte egenskaber kan PVP ikke være egnet til visse anvendelser, såsom fokusering genomisk DNA. I forsøg, observere vi, at tilsætning af PVP kan reducere genomisk DNA absolut mobilitet (til det punkt, hvor det ikke fokusere). I disse tilfælde en silanol belægning, såsom Sigmacote, sammenholdt med et overfladeaktivt middel (fx Triton-X 100) kan også være effektive til at reducere EOF. 10
TE anion (pKa -1) | ||||
Pufrende modion (pKa +1) | MES (6.10) | MOPS (7,20) | HEPES (7,50) | tricin (8,15) |
ethanolamin (9,50) | 21,41 | 20,40 | 17,38 | 22,85 |
tris (8,08) | 21,00 | 19,23 </ Td> | 15,84 | 17,56 |
bis-tris (6,40) | 18,22 | 10,41 | 7,30 | 5,23 |
pyridin (5,18) | 1,01 | 3,72 | 2,42 | 1,48 |
Tabel 1. Effektiv mobilitet størrelsesorden (x 10 -9 m2 / V / s) af justerede ren analyt zone anioniske ITP hvor LE er 100 mM HCl og 200 mM buffering modion.
TE kation (pKa +1) | ||||
Pufrende modion (pKa -1) | ethanolamin (9,50) | tris (8,08) | bis-tris (6,40) | pyridin (5,18) |
MES (6.10) | 35,57 | 21,96 | 16,39 | 10,45 |
MOPS (7.20) | 35,47 | 20,92 | 9,76 | 3,93 |
HEPES (7,50) | 35,35 | 19,97 | 7,77 | 2,88 |
Tricin (8,15) | 34,77 | 16,72 | 4,50 | 1,44 |
Tabel 2 nedenfor. Effektiv mobilitet størrelsen (x 10 -9 m2 / V / s) af justerede ren analyt zone kationisk ITP hvor LE er 100 mM natrium og 200 mM buffering modion.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker for støtte fra DARPA sponsoreret Micro / Nano Fluidik Fundamentals Focus (MF3) Center under kontrakt nummer N66001-10-1-4003 og fra DARPA tilskud N660001-09-C-2082.
REAGENTS | |||
Name | Company | Catalogue number | Comments |
Distilled water | GIBCO | 10977 | RNase/DNase free |
Clorox Ultra | Clorox | 02489CT | |
sodium hydroxide (NaOH) | Mallinckrodt | 7708 | |
hydrochloric acid (HCl) | EMD Chemicals | HX0603-4 | |
Trizma base (tris) | Sigma-Aldrich | T6066 | |
polyvinylpyrrolidone (PVP) | Polysciences Inc. | 06067 | MW 1,000,000 |
HEPES | Sigma-Aldrich | H-4034 | |
Alexa Fluor 488 carboxylic acid | Invitrogen | A20000 | |
tricine | Sigma-Aldrich | T-9784 | |
bis-tris | Sigma-Aldrich | B4429 | |
EDTA | GIBCO | AM9260G | |
Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
SYBR Green II | Invitrogen | S7564 | |
ethanolamine | Sigma-Aldrich | 411000 | |
Rhodamine 6G | Acros Organics (Geel, Belgium) | CAS 989-38-8 | |
L-Amino Acids | Sigma-Aldrich | LAA21 | |
Power SYBR Green RNA-to-CT 1-Step Kit | Applied Biosystems | 4389986 | |
PCR primers | Integrated DNA Technologies | ||
EQUIPMENT | |||
Name | Company | Catalogue number | Comments |
Borosilicate microfluidic chip | Caliper Life Sciences Inc. | NS12A | Supplied with or without plastic caddy |
Vacuum pump | Gast | DOA-P104-AA | |
Sourcemeter | Keithley | 2410 | Constant current and constant voltage operation modes |
Inverted epifluorescent microscope | Olympus | IX70 | Use mercury lamp (Olympus) or LED (Thorlabs) for illumination |
Filter cube | Omega | XF115-2 | Excitation/emission: blue/green |
Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 022363204 | 1.5 mL capacity |
Centrifuge | Eppendorf | 5417C |
Table 3. Specific reagents and equipment.