Isotachophorese (ITP) ist eine robuste elektrokinetischen Trennung und Anreicherungstechnik mit Anwendungen, die von Toxinnachweis zu Probenvorbereitung. Wir prüfen die physikalischen Grundlagen der ITP und die Methodik der Anwendung dieser Technik auf zwei konkrete Anwendungsbeispiele: Trennung und Detektion von kleinen Molekülen und Aufreinigung von Nukleinsäuren aus Zellkultur-Lysat.
Elektrokinetischen Techniken sind ein Grundnahrungsmittel der mikro-Anwendungen aufgrund ihrer einzigartigen Fähigkeit, eine Vielzahl von fluidischen und elektrophoretische Prozesse in einfache, kompakte Systeme ohne bewegliche Teile durchführen. Isotachophorese (ITP) ist eine einfache und sehr robust elektrokinetische Technik, die Millionen-fache Anreicherung 1,2 und effiziente Trennung und Extraktion auf Ionenbeweglichkeit Basis erreichen können. 3 Zum Beispiel haben wir die Anwendung der ITP zu Trennung und sensitiven Nachweis von unmarkiertem demonstriert ionischen Molekülen (z. B. Toxine, DNA, rRNA, miRNA) mit wenig oder gar keine Probenaufbereitung und 08.04 bis Extraktion und Reinigung von Nukleinsäuren aus komplexen Matrices einschließlich der Zellkultur, Urin und Blut. 9-12
ITP erzielt Fokussierung und Trennung unter Verwendung eines angelegten elektrischen Feldes und zwei Puffer innerhalb eines fluidischen Kanal-System. Für anionische Analyten, ist der führende Elektrolyten (LE) Puffer gewählt such, dass die Anionen höhere effektive elektrophoretische Mobilität als die Anionen des hinteren Elektrolyten (TE)-Puffer (Effektive Mobilität beschreibt die beobachtbaren Driftgeschwindigkeit eines Ions und berücksichtigt die Ionisierung Zustand des Ions, wie ausführlich von Persat et al haben . 13). Nach Einrichtung einer Schnittstelle zwischen dem TE und LE, wird ein elektrisches Feld angelegt, so dass LE Ionen weg von der Region von TE-Ionen besetzt. Probenionen der mittleren effektiven Mobilität Rennen vor TE-Ionen, aber nicht überholen können LE-Ionen, so daß sie an der LE-TE-Schnittstelle (im Folgenden als "ITP-Schnittstelle") zu fokussieren. Ferner wird der TE und LE Form von Regionen bzw. niedriger und hoher Leitfähigkeit, die einen steilen Gradienten des elektrischen Feldes an der ITP-Schnittstelle zu etablieren. Diese Feldgradienten Vorkonzentrate Probe Spezies, wie sie zu konzentrieren. Die richtige Wahl der TE und LE führt zu konzentrieren und Reinigung von Zielarten aus anderen Nicht-fokussierte Arten und schließlich die Trennung eind Trennung der Probenspezies.
Wir überprüfen hier die physikalischen Grundlagen ITP und diskutieren zwei Standard-Betriebsarten: "Peak" und "Plateau"-Modi. Im Peak-Modus, relativ verdünnte Proben-Ionen konzentrieren gemeinsam innerhalb überlappenden schmalen Peaks bei der ITP-Schnittstelle. In Plateau-Modus, erreichen häufiger Probeionen eine stationäre Konzentration und trennen in angrenzende Plateau-Zonen, die durch ihre effektive Mobilität bestellt. Peak-und Plateau-Modi ergeben sich aus den gleichen zugrunde liegenden Physik, sondern stellen verschiedene Regimes durch die anfängliche Analytkonzentration und / oder der Höhe der Zeit für die Probe zugeteilt Akkumulation unterschieden.
Wir erstmals im Detail ein Modell Peak-Modus Experiment beschreiben und dann zeigen, Peak-Modus-Assay für die Extraktion von Nukleinsäuren aus E. coli Zellkultur. Wir schließen daraus, durch die Vorlage eines Plateau-Modus-Test, wo wir eine Nicht-Fokussierung Tracer (NFT) Arten, die Trennung zu visualisieren und nutzen probilden Quantifizierung von Aminosäuren.
Die ITP hier vorgestellten Methoden ermöglichen eine schnelle, empfindliche und robuste Erkennung und Behandlung von ionischen Molekülen. Die größte Herausforderung im Umgang mit ITP ist die richtige Wahl des LE und TE-Puffer. In anionischen ITP, wählen wir in der Regel Chlorid als führende Anion, weil es eine starke Säure mit einer sehr hohen absoluten Mobilität ist und somit sehr vorhersagbaren Eigenschaften. Daher wird in Puffer Wahl anionischen ITP in der Regel um die Wahl eines geeigneten TE und Gegenion reduziert. Für die selektive Fokussierung Experimente, ist entscheidend für die Wahl TE Ausschluss von verunreinigenden Ionen. In Anwendungen, bei denen Verunreinigungen sind nicht vorhanden, führt unteren TE effektive Mobilität auf schnellere Fokussierung. Wir empfehlen die Verwendung der folgenden, relativ brav anionische TE-Ionen: MES, MOPS, HEPES, Tricin. Wahl des Gegenions beeinflusst sowohl die System-und pH-TE effektive Mobilität. Gemeinsame Gegenionen sind Tris (pKa 8.1) und Bis-Tris-(pKa 6.4). Für Tests, die einen niedrigen oder höheren pH-Wert, empfehlen wir Pyridin (pKa 5,25) undEthanolamin (pKa 9,5), jeweils. In den Tabellen 1 und 2, für anionische und kationische ITP, jeweils fassen wir einige nützliche Beispiele Puffer. Wir nehmen HCl als anionische LE Ionen und Natrium als kationische LE-Ion, und wir nehmen an 100 mM Ionenstärke der LE-Puffer.
Der Leser wird bemerken, dass Puffer Ionenstärke in unserer Protokolle (und in den Tabellen 1-2) immer größer als oder gleich 10 mM. Während in der Theorie die Physik der ITP gilt bei Ionenstärke kleiner als 10 mm, natur Verunreinigungen (z. B. Kohlensäure aus Reaktion zwischen Wasser und atmosphärischem Kohlendioxid) in der Nähe der 1 mM Ebene beschränken oft den praktischen Einsatz von Puffern niedriger Ionenstärke.
Man beachte, daß Signaltransduktionsmechanismus nicht auf die Assays in diesem Protokoll vorgestellt beschränkt. Wie bereits kurz in Teil 5, in Plateau-Modus gereinigt Zonen diskutiert über Änderungen in der lokalen Leitfähigkeit, UV-absor erkannt werdenBance, der Temperatur oder des Brechungsindex. In unserer eigenen Gruppe, haben wir eine Methode, die fluoreszierende Trägerampholyten nutzt für empfindliche Detektion und Identifizierung von unbekannten Analyten entwickelt. 5 Im Peak-Modus Experimente, spezifischen Sonden verwendet werden, um konzentriert Analyten zu markieren. In einem Beispiel verwenden wir Molecular Beacons – Oligonukleotid-Sonden, die bei Hybridisierung fluoreszieren, um ihre Ziel-Sequenz – auf Ziel-DNA-oder RNA-Moleküle mit hoher Spezifität erkennen 11,18.
Während ITP ist relativ robust gegenüber Dispersion durch Druck-gesteuerte Strömungs-und EOF verursachten übermäßigen EOF zu einer Stagnation des ITP-Schnittstelle, wo die mittlere Geschwindigkeit EOF gleich der ITP Geschwindigkeit führen. Solche starken EOF 14 tritt vor allem bei hohem pH-Wert und niedriger Ionenstärke. Aus diesem Grund empfehlen wir die Verwendung von Puffern mit pH 8 oder niedriger und mit Ionenstärke in der Größenordnung von 100 mm, wenn praktisch. Nach unserer Erfahrung ist das PVPeffektivste Beschichtung für EOF-Unterdrückung in Borosilikat-Chips. Da jedoch der Siebeigenschaften kann PVP nicht für alle Anwendungen geeignet, wie die Fokussierung genomische DNA ist. In Experimenten beobachten wir, dass die Zugabe von PVP stark herabsetzen kann genomische DNA absolute Mobilität (bis zu dem Punkt, wo es nicht konzentrieren muss). In diesen Fällen ein Silanol Beschichtung wie Sigmacote in Verbindung mit einem Tensid (z. B. Triton X-100) kann auch wirksam bei der Verringerung EOF. 10
TE-Anion (pKa -1) | ||||
Pufferung Gegenion (pKa +1) | MES (6,10) | MOPS (7.20) | HEPES (7,50) | Tricin (8,15) |
Ethanolamin (9.50) | 21,41 | 20,40 | 17,38 | 22,85 |
Tris (8,08) | 21,00 | 19,23 </ Td> | 15,84 | 17,56 |
Bis-Tris-(6,40) | 18,22 | 10,41 | 7,30 | 5,23 |
Pyridin (5,18) | 1,01 | 3,72 | 2,42 | 1,48 |
Tabelle 1. Effektive Mobilität Größenordnung (× 10 -9 m 2 / V / s) des bereinigten reinen Analyten in anionischen ITP Zone, wo die LE ist 100 mM HCl und 200 mM Puffern Gegenion.
TE-Kation (pKa +1) | ||||
Pufferung Gegenion (pKa -1) | Ethanolamin (9.50) | Tris (8,08) | Bis-Tris-(6,40) | Pyridin (5,18) |
MES (6,10) | 35,57 | 21,96 | 16,39 | 10,45 |
MOPS (7.20) | 35,47 | 20,92 | 9,76 | 3,93 |
HEPES (7,50) | 35,35 | 19,97 | 7,77 | 2,88 |
Tricin (8,15) | 34,77 | 16,72 | 4,50 | 1,44 |
Tabelle 2. Wirksame Mobilität Größe (× 10 -9 m 2 / V / s) des bereinigten reinen Analyten Zone in kationische ITP wobei das LE 100 mM Natriumphosphat und 200 mM Puffer Gegenion.
The authors have nothing to disclose.
Wir bedanken uns für die Finanzierung von DARPA geförderte Mikro / Nano Fluidics Grundlagen Focus (MF3) Center unter Vertrag Zahl N66001-10-1 bis 4003, und von DARPA Zuschuss N660001-09-C-2082.
REAGENTS | |||
Name | Company | Catalogue number | Comments |
Distilled water | GIBCO | 10977 | RNase/DNase free |
Clorox Ultra | Clorox | 02489CT | |
sodium hydroxide (NaOH) | Mallinckrodt | 7708 | |
hydrochloric acid (HCl) | EMD Chemicals | HX0603-4 | |
Trizma base (tris) | Sigma-Aldrich | T6066 | |
polyvinylpyrrolidone (PVP) | Polysciences Inc. | 06067 | MW 1,000,000 |
HEPES | Sigma-Aldrich | H-4034 | |
Alexa Fluor 488 carboxylic acid | Invitrogen | A20000 | |
tricine | Sigma-Aldrich | T-9784 | |
bis-tris | Sigma-Aldrich | B4429 | |
EDTA | GIBCO | AM9260G | |
Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
SYBR Green II | Invitrogen | S7564 | |
ethanolamine | Sigma-Aldrich | 411000 | |
Rhodamine 6G | Acros Organics (Geel, Belgium) | CAS 989-38-8 | |
L-Amino Acids | Sigma-Aldrich | LAA21 | |
Power SYBR Green RNA-to-CT 1-Step Kit | Applied Biosystems | 4389986 | |
PCR primers | Integrated DNA Technologies | ||
EQUIPMENT | |||
Name | Company | Catalogue number | Comments |
Borosilicate microfluidic chip | Caliper Life Sciences Inc. | NS12A | Supplied with or without plastic caddy |
Vacuum pump | Gast | DOA-P104-AA | |
Sourcemeter | Keithley | 2410 | Constant current and constant voltage operation modes |
Inverted epifluorescent microscope | Olympus | IX70 | Use mercury lamp (Olympus) or LED (Thorlabs) for illumination |
Filter cube | Omega | XF115-2 | Excitation/emission: blue/green |
Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 022363204 | 1.5 mL capacity |
Centrifuge | Eppendorf | 5417C |
Table 3. Specific reagents and equipment.