Isotachophoresis (ITP) è una separazione solido elettrocinetico e tecnica preconcentrazione con applicazioni che vanno dal rilevamento della tossina alla preparazione del campione. Esaminiamo i principi fisici di ITP e la metodologia di applicazione di questa tecnica per due applicazioni specifiche esempio: separazione e la rilevazione di piccole molecole e di purificazione degli acidi nucleici da lisato di coltura cellulare.
Tecniche elettrocinetici sono una graffetta di applicazioni su microscala per la loro capacità unica di eseguire una varietà di processi e fluidici elettroforetica in sistemi semplici e compatti senza parti in movimento. Isotachophoresis (ITP) è una tecnica semplice e molto robusta elettrocinetico che può raggiungere 1,2 milioni di volte preconcentrazione ed efficiente separazione ed estrazione basata sulla mobilità ionica. 3 Per esempio, abbiamo dimostrato l'applicazione di ITP di separazione e rivelazione sensibile di non marcato ionici molecole (ad esempio tossine, DNA, rRNA, miRNA) con poco o nessun campione 4-8 preparazione e di estrazione e purificazione di acidi nucleici da matrici complesse compreso coltura cellulare, urina, sangue e 9-12.
ITP raggiunge focalizzazione e separazione utilizzando un campo elettrico applicato e due buffer all'interno di un sistema fluidico canale. Per analiti anionici, il principale elettrolita (LE) buffer viene scelto sale che i suoi anioni hanno una maggiore mobilità elettroforetica efficace rispetto agli anioni dell'elettrolita finale (TE) tampone (mobilità efficace descrive la velocità di deriva osservabile di uno ione e tiene conto dello stato di ionizzazione dello ione, come descritto in dettaglio da Persat et al . 13). Dopo aver stabilito un'interfaccia tra il TE e LE, un campo elettrico viene applicato in modo tale che gli ioni LE allontanarsi dalla regione occupata da ioni TE. Ioni del campione di razza intermedia mobilità efficaci prima di ioni TE, ma non può superare ioni LE, e così si concentrano presso il LE-TE interfaccia (in appresso denominata "interfaccia ITP"). Inoltre, la TE LE e aree del modulo di conducibilità rispettivamente a bassa ed alta, che stabiliscono una forte pendenza campo elettrico a livello di interfaccia ITP. Questo gradiente di campo preconcentrates specie campione come essi si concentrano. La corretta scelta dei risultati e di TE LE a messa a fuoco e la purificazione della specie bersaglio da altri non focalizzate specie e, infine, la separazione unod segregazione di specie campione.
Noi qui rivedere la ITP principi fisici alla base e discutere due modi standard di funzionamento: "picco" e "plateau" modalità. In modalità picco, relativamente diluire ioni del campione si concentrano insieme in sovrapposizione picchi stretti a livello di interfaccia ITP. In modalità plateau, ioni del campione più abbondanti raggiungere una concentrazione nello stato stazionario e segregare in adiacenti plateau-like zone ordinate per la loro mobilità effettiva. Modalità di picco e plateau derivare da la stessa fisica di base, ma rappresentano distinti regimi differenziati dalla concentrazione dell'analita iniziale e / o la quantità di tempo assegnato per l'accumulo di campione.
Per prima descritto in dettaglio un picco esperimento modello modalità e quindi dimostrare un saggio picco modalità per l'estrazione di acidi nucleici da E. coli di coltura cellulare. Concludiamo con la presentazione di un saggio modo di plateau, dove usiamo un non-traccianti di messa a fuoco (NFT) specie per visualizzare la separazione e performare quantificazione di amminoacidi.
I metodi di ITP qui presentati consentono la rilevazione rapida, sensibile e robusto e la manipolazione di molecole ioniche. La sfida principale con ITP è la scelta corretta di buffer LE e TE. In ITP anionico, si scelgono tipicamente cloruro come anione principale perché è un acido forte con elevata mobilità assoluto e quindi ha proprietà molto prevedibili. Pertanto, la scelta buffer in anionica ITP è tipicamente ridotto a scegliere un vero e proprio TE e controione. Per gli esperimenti di messa a fuoco selettiva, la scelta TE è fondamentale per l'esclusione di contaminare ioni. Nelle applicazioni in cui i contaminanti non sono presenti, in basso la mobilità TE efficace conduce a una più rapida velocità di messa a fuoco. Si consiglia di utilizzare i seguenti, relativamente ben educati anionici ioni TE: MES, MOPS, HEPES, tricina. Scelta del controione influenza sia il pH del sistema e della mobilità TE efficace. Controioni comuni sono tris (pKa 8,1) e bis-tris (pKa 6,4). Per i test che richiedono un pH inferiore o superiore, si consiglia di piridina (pKa 5,25) eetanolammina (pKa 9,5), rispettivamente. Nelle tabelle 1 e 2, per ITP anionici e cationici, rispettivamente, riassumiamo alcuni esempi buffer utili. Prendiamo HCl come ione LE anionico e sodio come cationico LE ioni e non assumiamo 100 mM forza ionica del tampone LE.
Il lettore noterà che la forza ionica tampone nei nostri protocolli (e nelle tabelle 1-2) è sempre maggiore o uguale a 10 mM. Mentre in teoria fisica di ITP vale a forza ionica inferiore a 10 mM, contaminanti naturali (ad esempio acido carbonico dalla reazione tra acqua e anidride carbonica atmosferica) vicino al livello 1 mM spesso limitano l'uso pratico di buffer a bassa forza ionica.
Notiamo che meccanismo di trasduzione del segnale non è limitato ai saggi presentati in questo protocollo. Come discusso brevemente nella parte 5, in modalità plateau purificato zone può essere rilevata tramite variazioni di conducibilità locale, assorbitori UVBance, temperatura, o di un indice di rifrazione. Nel nostro gruppo, abbiamo sviluppato un metodo che utilizza anfoliti portanti fluorescenti sensibili per la diagnosi e l'identificazione di analiti sconosciuti. 5 In esperimenti modalità di picco, sonde specifiche possono essere usati per etichettare analiti focalizzati. In un esempio, usiamo segnali molecolari – sonde oligonucleotidiche che reagiscono al momento ibridazione per la loro sequenza bersaglio – per rilevare il DNA bersaglio o molecole di RNA con elevata specificità 11,18.
Mentre ITP è relativamente robusto per dispersione causata dalla pressione-driven flusso e EOF, EOF eccessiva può portare ad una stagnazione del ITP, dove la velocità media EOF diventa uguale alla velocità ITP. 14 EOF Tale forte si verifica soprattutto in condizioni di pH elevato e bassa forza ionica. Per questo motivo, si consiglia l'uso di tamponi con pH 8 o inferiore e con forza ionica dell'ordine di 100 mm, se conveniente. Nella nostra esperienza, è il PVPrivestimento più efficace per la soppressione EOF in chips borosilicato. Tuttavia, a causa delle sue proprietà di setacciatura, PVP non può essere appropriato per alcune applicazioni, come focalizzazione DNA genomico. Negli esperimenti, si osserva che l'aggiunta di PVP può ridurre notevolmente la mobilità DNA genomico assoluto (al punto in cui non si concentra). In questi casi, un rivestimento silanolo come Sigmacote in congiunzione con un tensioattivo (per esempio Triton X-100) può anche essere efficace nel ridurre EOF 10.
TE anione (pKa -1) | ||||
Controione Buffering (pKa +1) | MES (6.10) | MOPS (7,20) | HEPES (7.50) | tricina (8.15) |
etanolammina (9,50) | 21,41 | 20,40 | 17,38 | 22,85 |
tris (8,08) | 21,00 | 19,23 </ Td> | 15,84 | 17,56 |
bis-tris (6.40) | 18,22 | 10,41 | 7,30 | 5,23 |
piridina (5.18) | 1,01 | 3,72 | 2,42 | 1,48 |
Tabella 1. Mobilità grandezza effettiva (× 10 -9 m 2 / V / s) della zona aggiustato analita puro ITP anionica in cui il LE è HCl 100 mM e 200 mM tampone controione.
TE zione (pKa +1) | ||||
Controione Buffering (pKa -1) | etanolammina (9,50) | tris (8,08) | bis-tris (6.40) | piridina (5.18) |
MES (6.10) | 35,57 | 21,96 | 16,39 | 10,45 |
MOPS (7.20) | 35,47 | 20,92 | 9,76 | 3,93 |
HEPES (7.50) | 35,35 | 19,97 | 7,77 | 2,88 |
Tricina (8.15) | 34,77 | 16,72 | 4,50 | 1,44 |
Tabella 2. Magnitudine mobilità effettiva (× 10 -9 m 2 / V / s) della zona aggiustato analita puro in ITP cationico dove il LE è sodio 100 mM e 200 mM tampone controione.
The authors have nothing to disclose.
Riconosciamo con gratitudine finanziamenti da DARPA sponsorizzato Micro / Nano di messa a fuoco Fluidics Fundamentals (MF3) Centro con il contratto numero N66001-10-1-4003, e dal DARPA concessione N660001-09-C-2082.
REAGENTS | |||
Name | Company | Catalogue number | Comments |
Distilled water | GIBCO | 10977 | RNase/DNase free |
Clorox Ultra | Clorox | 02489CT | |
sodium hydroxide (NaOH) | Mallinckrodt | 7708 | |
hydrochloric acid (HCl) | EMD Chemicals | HX0603-4 | |
Trizma base (tris) | Sigma-Aldrich | T6066 | |
polyvinylpyrrolidone (PVP) | Polysciences Inc. | 06067 | MW 1,000,000 |
HEPES | Sigma-Aldrich | H-4034 | |
Alexa Fluor 488 carboxylic acid | Invitrogen | A20000 | |
tricine | Sigma-Aldrich | T-9784 | |
bis-tris | Sigma-Aldrich | B4429 | |
EDTA | GIBCO | AM9260G | |
Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
SYBR Green II | Invitrogen | S7564 | |
ethanolamine | Sigma-Aldrich | 411000 | |
Rhodamine 6G | Acros Organics (Geel, Belgium) | CAS 989-38-8 | |
L-Amino Acids | Sigma-Aldrich | LAA21 | |
Power SYBR Green RNA-to-CT 1-Step Kit | Applied Biosystems | 4389986 | |
PCR primers | Integrated DNA Technologies | ||
EQUIPMENT | |||
Name | Company | Catalogue number | Comments |
Borosilicate microfluidic chip | Caliper Life Sciences Inc. | NS12A | Supplied with or without plastic caddy |
Vacuum pump | Gast | DOA-P104-AA | |
Sourcemeter | Keithley | 2410 | Constant current and constant voltage operation modes |
Inverted epifluorescent microscope | Olympus | IX70 | Use mercury lamp (Olympus) or LED (Thorlabs) for illumination |
Filter cube | Omega | XF115-2 | Excitation/emission: blue/green |
Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 022363204 | 1.5 mL capacity |
Centrifuge | Eppendorf | 5417C |
Table 3. Specific reagents and equipment.