Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

على رقاقة Isotachophoresis للفصل بين الأيونات والتنقية من الأحماض النووية

Published: March 2, 2012 doi: 10.3791/3890
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Mechanical Engineering, Stanford University

Summary

Isotachophoresis (آي تي ​​بي) هو فصل قوي حركي كهربي وتقنية preconcentration مع التطبيقات التي تتراوح بين اكتشاف السم إلى إعداد عينة. نستعرض المبادئ الفيزيائية للITP والمنهجية لتطبيق هذه التقنية لاثنين من التطبيقات مثال محدد: الفصل والكشف عن جزيئات صغيرة وتنقيتها من الأحماض النووية من المحللة ثقافة الخلية.

Abstract

تقنيات حركي كهربي هي من دعائم من التطبيقات الميكروسكيل نظرا لقدرتها الفريدة على أداء مجموعة متنوعة من العمليات fluidic والكهربي في النظم، وبسيط التعاقد مع أي أجزاء متحركة. Isotachophoresis (آي تي بي) هي تقنية بسيطة وقوية جدا حركي كهربي التي يمكن أن تحقق الفصل مليون أضعاف 1،2 preconcentration والكفاءة والاستخراج على أساس الحركة الأيونية. 3 على سبيل المثال، أننا أظهرنا تطبيق آي تي بي للانفصال وكشف حساسة من غير المسماة الأيونية جزيئات (السموم على سبيل المثال، الحمض النووي، والريباسي، ميرنا) مع ضئيلة أو معدومة عينة إعداد 4-8، واستخراج وتنقية الأحماض النووية من المصفوفات المعقدة بما في ذلك ثقافة الخلية والبول، والدم. 9-12

ITP يحقق التركيز والفصل باستخدام مجال تطبيق الكهربائية ومخازن 2 ضمن نظام قناة fluidic. لالتحاليل أنيوني، يتم اختيار الشركة الرائدة في مجال المنحل بالكهرباء (LE) العازلة قاوك أن الأنيونات لها أن تكون أعلى التنقل الكهربي فعالية من الأنيونات من المنحل بالكهرباء زائدة (TE) العازلة (التنقل الفعالة ويصف سرعة الانجراف ملاحظتها لايون، ويأخذ في الاعتبار حالة التأين من الأيونات، كما هو موضح بالتفصيل من قبل Persat وآخرون 13). بعد تأسيس حلقة وصل بين الشركة المصرية للاتصالات وجنيه، يتم تطبيق حقل كهربائي بحيث أيونات جنيه الابتعاد عن المنطقة التي تحتلها أيونات الشركة المصرية للاتصالات. يمكن الأيونات عينة من وسيط سباق التنقل فعال قبل الأيونات الشركة المصرية للاتصالات ولكن لا تجاوز أيونات جنيه، وبالتالي فهي تركز على واجهة LE-TE (وتسمى فيما بعد "واجهة آي تي ​​بي"). علاوة على ذلك، الشركة المصرية للاتصالات والمناطق شكل جنيه من الموصلية المنخفضة على التوالي وارتفاع، والذي وضع حاد الانحدار الحقل الكهربائي في واجهة ITP. هذا التدرج حقل preconcentrates الأنواع عينة لأنها تركز. خيار مناسب لنتائج الشركة المصرية للاتصالات وجنيه في التركيز وتنقية من الأنواع المستهدفة من الأنواع غير المركزة الأخرى، وفي نهاية المطاف، والفصل 1د الفصل بين الأنواع عينة.

نستعرض هنا ITP المبادئ الفيزيائية التي يقوم عليها، ومناقشة وضعي معيار من العملية: "الذروة" و "الهضبة" وسائط. في وضع الذروة، ويخفف نسبيا الأيونات عينة تركيز معا ضمن تداخل القمم ضيق في واجهة ITP. في وضع هضبة، الأيونات عينة أكثر وفرة التوصل الى تركيز ثابت للدولة وفصل إلى مناطق مثل هضبة مجاورة امر بها الحركة على نحو فعال. الذروة والهضبة وسائط تنشأ من الفيزياء الكامنة نفسه، ولكنها تمثل الأنظمة متميزة تختلف عن تركيز تحليلها الأولي و / أو كمية من الوقت المخصص للتراكم عينة.

وصفنا 1 بالتفصيل وضع ذروة تجربة نموذجية وشرح بعد ذلك فحص وضع ذروة لاستخلاص الأحماض النووية من E. كولاي خلية ثقافة. نستنتج من خلال تقديم فحص وضع هضبة، حيث نستخدم عدم التركيز التتبع (NFT) الأنواع لتصور الانفصال ولكلتشكيل الكميات من الأحماض الأمينية.

Protocol

1. فيزياء ITP

ITP يشكل الحدود حاد يتنقل بين أيونات من تهمة مثل. لا يمكن أن يؤديها تقنية مع عينات أنيوني أو الموجبة، ولكن علينا تكييف هذه المقدمة إلى ITP أنيوني ونلاحظ أن المبادئ نفسها تنطبق على ITP الموجبة. نختار جنيه والشركة المصرية للاتصالات من هذا القبيل أن مخازن أيونات جنيه لديها حجم أكبر فعالية الحركة الكهربي. فعالية تحرك رحلاني، μ = U / E، هو ثابت التناسب بين الحقل الكهربائي التطبيقية، E، وايون سرعة الانجراف، يو. 13 ونحن إنشاء واجهة منتشر بين جنيه والشركة المصرية للاتصالات وتطبيق مجال كهربائي الموجهة من عالية الموصلية جنيه منطقة إلى منطقة TE منخفضة الموصلية. ويضع هذا النظام بسرعة الانحدار القوي في الحقل الكهربائي في واجهة آي تي ​​بي، ويرجع ذلك إلى الوضع الموصلية غير موحدة. حسب اسمها (من اليونانية، "التضامن الدولي" يعني "المساواة"، "takhos" تعني "السرعة")، والشركة المصرية للاتصالات جنيه السفر الأيونات في هاء، نفس موحدةlocity، نتيجة لهذا المجال غير موحدة الكهربائية وحفظ الحالية (وهذا هو ما يسمى ب "حالة ITP"، انظر الشكل 1).

واجهة ITP الاكتفاء الذاتي في شحذ: أيونات جنيه الذي نشر في تجربة منطقة TE دفق قوي استعادة والعودة الى المنطقة الرائدة (والعكس بالعكس لأيونات الشركة المصرية للاتصالات في منطقة جنيه). الأيونات عينة تركز على هذه الواجهة إذا تنقل بصورة فعالة في منطقة الشركة المصرية للاتصالات أكبر من تلك الأيونات المشترك الشركة المصرية للاتصالات، وإذا كان التحرك على نحو فعال في المنطقة جنيه هو أقل من ذلك من الأيونات المشارك جنيه (انظر الشكل 1) شحذ الذاتي والتركيز خصائص ITP تساهم في متانة هذه التقنية، وجعل آي تي ​​بي غير حساس نسبيا إلى اضطرابات في واجهة (على سبيل المثال بسبب ضغط يحركها تدفق أو تغييرات في علم الهندسة، مثل تقلصات، التوسعات، والمنعطفات).

في ذروة وضع ITP (انظر الشكل 2A والفيديو 1-2)، تركيز أيون العينة هيفي جميع الأوقات، أقل بكثير من جنيه وتركيزات TE ايون، والمساهمة بالتالي لا تذكر إلى الموصلية المحلية. يتحدد توزيع الأيونات عينة من قبل واجهة الذاتي شحذ بين المناطق المجاورة (هنا في الشركة المصرية للاتصالات وجنيه) وقيمة تنقل عينة فعالة بالنسبة إلى هذه المناطق. 14 الأيونات عينة متعددة تركز في نفس المنطقة واجهة ضيقة ITP كما إلى حد كبير تداخل القمم. بعرض واجهة، والذروة، فضلا عن عامل preconcentration المرتبطة بها، على نطاق عكسيا مع التيار تطبيقها (انظر التجارب في الشكل 2B) 14

لتركيزات عالية بما فيه الكفاية عينة الأولية وتراكم ما يكفي من الوقت، الأيونات عينة تبلغ ما قيمته تركيز عتبة. لبالكامل المتأينة الأنواع، ويتم تحديد هذه القيمة من قبل وظيفة التنظيم كولراوش (ينتج KrF). 15 لالشوارد ضعيف، فإنه يتم تحديد من قبل وظائف Alberty وJovin. 16،17 في هضبةواسطة، كما هو مبين في الشكل (3) والفيديو 3، والأيونات عينة فصل وتنقية إلى مناطق تركيز موحدة محليا ومستمرة في أمر يحدده التنقل على نحو فعال. قد أيونات مخفف جدا التركيز لا يزال في وضع الذروة بين مناطق الهضبة. في آي تي بي، يمكن إدخال أيونات عينة في حقن محدود بين الشركة المصرية للاتصالات وجنيه (انظر الشكل 3) أو مختلطة معا بالتناوب مع / والشركة المصرية للاتصالات أو جنيه (انظر الشكل 2). نشير إلى خلط في منطقة الشركة المصرية للاتصالات وحقن "شبه لا نهائية"، والتي يمكن استخدامها لتجميع ايونات تحليلها بشكل مستمر. استمرار تراكم عينة يزيد من حساسية في كل من الذروة وفحوصات وضع هضبة. ومع ذلك، حقن محدود هي أكثر شيوعا في وضع هضبة. وهذا هو الأرجح لأن تركيزات عالية من تحليلها الأولي في شبه لانهائية الحقن يمكن أن تزيد بشكل كبير TE الموصلية، وانخفاض معدلات التركيز. أيضا، وتنقية الكامل غير ممكن في شبه لانهائية حقن (نظرا لوجود ريماانس تركيز محدود في الشركة المصرية للاتصالات).

2. تنظيف الجهاز وإعداد

للفحوصات التي قدمت في هذا البروتوكول التي نستخدمها بشكل متساو الرطب محفورا (نحو دال على شكل المقطع العرضي) رقائق الزجاج ميكروفلويديك مع تصميم عبر قناة (انظر الشكل 1). هو الأمثل لتنظيف التالية وإعداد بروتوكول للقنوات السيليكا البورسليكات وتنصهر فيها، ولكن يمكن استخدامها أيضا مع الزجاج / PDMS رقائق البطاطس. تنفيذ هذا الإجراء التنظيف قبل التجارب لضمان تشغيل للتشغيل التكرار والتطبيق الناجح لالطلاء الديناميكية اللازمة لقمع تدفق electroosmotic (EOF). وقد حذف هذا البروتوكول يؤدي إلى تشتت قوي من واجهة آي تي بي. 14

  1. لتطهير القناة، وملء شمال وشرق وجنوب والخزانات مع 10-20 ميكرولتر من التبييض 10٪ وتطبيق فراغ في الخزان الغربية لمدة 2 دقيقة. إذا باستخدام معيار الفرجار رقاقة العلبة، ويمكن تطبيقها على نحو فعال من قبل فراغ attachin ببساطةز نهاية واسعة من ميكرولتر 200 (فلتر) ماصة معلومات سرية إلى الخزان رقاقة وربط خط أنبوب فراغ إلى 2 مم قطر داخلى.
  2. تفريغ الخزانات وشطف قناة (كما في الخطوة 1) 1 م مع هيدروكسيد الصوديوم لمدة 2 دقيقة. هذا يحفر بلطف جدران القناة، مما أسفر عن سطح نظيف البورسليكات للمساعدة في تأسيس خصائص سطح موحدة.
  3. تفريغ الخزانات ونظيفة مع دي المتأينة المياه (دي)، ثم شطف القناة مع جنيه للدقيقة 2 ~. خلال هذه الفترة خصائص السطح والطلاء ديناميكية تتوازن داخل القناة.

3. Fluorophore التركيز في ذروة وضع ITP

  1. إعداد 1 مل جنيه تتكون من حمض الهيدروكلوريك 100 ملم، 200 تريس ملم، وPVP 1٪.
  2. 1 مل تعد الشركة المصرية للاتصالات التي تتكون من HEPES 100 ملم و 200 ملم تريس. ضم 90 ميكرولتر من الشركة المصرية للاتصالات مع 10 ميكرولتر من 1 ميكرومتر اليكسا فلور 488 (AF488).
  3. بعد الشطف مع جنيه على النحو المبين في الجزء 2، فارغ الخزان غرب وتنظيف عدة مرات مع دي في أودر لتمييع أي جنيه المتبقية في الخزان. ملء هذا الخزان مع 20 ميكرولتر الشركة المصرية للاتصالات التي تحتوي على AF488.
  4. وضع القطب الموجب في الخزان شرق والأرض (سلبية) الكهربائي في الخزان غرب وتطبيق 2 ميكروأمبير (بالسعر الثابت الحالي). وذروة عينة تهاجر بسرعة منتظمة من الخزان الغرب إلى الشرق الخزان (انظر الشكل 1)، والجهد بين هذه الخزانات وزيادة على خفض TE الموصلية يملأ قناة.

4. استخلاص وتنقية الأحماض النووية من E. مثقف كولاي

القدرة على التركيز بشكل انتقائي الأنواع الأيونية يجعل ITP تقنية مثالية لإعداد عينة بيولوجية. نحن تنقية الأحماض النووية من المحللة خلية غير المعالجة عن طريق اختيار شاردة زائدة مع حجم الحركة فعالة أقل من حمض النووي الهدف ولكن أعلى من مثبطات PCR شارك في الأيونية (مثل المنظفات، والبروتينات، والمذيبات العضوية، حتى لو كان موجودا في مرحباتركيز غ). الموجبة PCR مثبطات (الفلزات القلوية مثل البروتينات والموجبة والمنظفات الصناعية) تهاجر في الاتجاه المعاكس، وهكذا يتم ترك أيضا وراء. ITP عصائر وتركز الأحماض النووية الهدف من الخزان عينة، في حين ترك أبطأ PCR المثبط للأنواع وراء (انظر الشكل 4).

  1. الحصول على عينة من ثقافة أو E. خلايا القولونية إلى كثافة أكبر من 10 8 كفو / مل.
  2. 1 نقل ثقافة خلية مل في أنبوب microcentrifuge آمن للانغلاق وبيليه بواسطة الطرد المركزي عند 4000g لمدة 6 دقائق.
  3. اعادة تعليق على بيليه في 80 ريبونوكلياز المياه خالية من ميكرولتر وإضافة 10 ميكرولتر من lysing عامل يتألف من tricine 10 ملم، 10 ملم مكرر تريس، 2 مم EDTA، 0.1٪ تريتون-X، و 5 ملغ / مل الليزوزيم. مزيج بلطف واحتضان لمدة 5 دقائق. في درجة حرارة الغرفة (بروتوكول lysing مقتبسة من Bercovici وآخرون. 11).
  4. إضافة 10 ميكرولتر من 1 هيدروكسيد الصوديوم M لرفع درجة الحموضة المحللة إلى ~ 12.5. تحريك بلطف ماصة صعودا ونزولا حتىالحل أصبح واضحا، وعند هذه النقطة lysing كاملة.
  5. ضم 10 ميكرولتر من المحللة مع 90 ميكرولتر من tricine 50 ملم و 100 ملم مكرر تريس. ويمكن الآن هذا الحل يمكن استخدام مثل الشركة المصرية للاتصالات.
  6. 1 مل من إعداد جنيه تتكون من 500 ملي مكرر تريس، حمض الهيدروكلوريك 250 ملم، 1٪ PVP، و1X SYBR الثاني الأخضر. ملء رقاقة ميكروفلويديك مع جنيه على النحو المبين في الجزء 3.
  7. من أجل انتزاع الحامض النووي لتنقية خارج رقاقة تحليل بعد ITP، استبدال محتويات الخزان الشرق مع جنيه PCR المتوافقة التي تحتوي على 50mM مكرر تريس، حمض الهيدروكلوريك 25 مم، و 0.1٪ PVP. تطبيق 1000 فولت بين الشرق والغرب الآبار لبدء التجربة. هذا التيار بين هذه الخزانات نقصان.
  8. في نهاية التجربة على عينة elutes في المكمن جنيه. تتزامن مع هذا شطف، في الوقت الحالي مقابل لهذا النظام وعادة ما تصل قيمة الهضبة (منذ يهيمن الآن مقاومة من قبل الشركة المصرية للاتصالات أيونات موزعة بشكل متجانس في قناة). مزيج بلطف الخزانوكرر مضمون من قبل pipetting وانتزاع حجم 5 ميكرولتر من أجل التحليل الكمي بواسطة RT-PCR.

5. فصل من الأحماض الأمينية مع الموجبة ITP وضع الهضبة والتتبع عدم التركيز (NFT) لتصور

ويمكن استخدام آي تي ​​بي لفصل وتركيز الايونات الصغيرة في الهضاب المجاورة، ويمكن اكتشافها بين الشركة المصرية للاتصالات وجنيه. هذا يسمح للكشف وتحديد الهوية على أساس الخصائص الفيزيائية والكيميائية، مثل الموصلية المحلية، وامتصاص الأشعة فوق البنفسجية، والاستشعار عن درجة الحرارة، أو مؤشر الانكسار. نحن هنا يبرهن على وجود عدم التركيز التتبع (NFT) الفحص حيث يتم إضافة فلوري، الذي شارك في الأيونية الأنواع إلى جنيه. هذه الأنواع فلوري لا يركز، ولكن تركيزه تتكيف مع حقل الكهربائية المحلية، وتمكن بالتالي من تصور مناطق هضبة المنقى (انظر الشكل 5).

  1. إعداد 1 مل جنيه تتكون من إيثانولامين 100 ملم، 200 tricine مم، و 1٪ PVP، و 100 ميكرون من 6G fluorophore رودامين الموجبة.
    2. <لى> إعداد 1 مل الشركة المصرية للاتصالات التي تتكون من تريس ملي 20، 40 tricine ملي. تحضير عينة عن طريق خلط 90 ميكرولتر من الشركة المصرية للاتصالات مع 10 ميكرولتر كل من أرجينين 50 ملم و 50 ملم ليسين.
  2. الاستغناء عن 20 جنيه ميكرولتر في الغرب والخزانات الشمالية وعينة في الخزان الشرق. تطبق في فراغ خزان جنوب ل1 دقيقة.
  3. شطف الشرق بشكل جيد مع DI واستبدالها مع الشركة المصرية للاتصالات (TE بدون العينة).
  4. تطبيق 500 V بين الشرق والغرب الخزانات.

6. ممثل النتائج

نعرض isotachopherograms من التجارب وضع الذروة في الشكل 2B والتجارب النووية استخلاص حامض في الشكل 4. في التجارب وضع الذروة مع مراسل فلوري (على سبيل المثال AF488، SYBR الأخضر الثاني)، ويمكن أن تكون متكاملة لشدة الشاملة مضان ومقارنتها ضد منحنى المعايرة للحصول على معلومات كمية تركيز. 12 بالإضافة إلى ذلك، في التجارب النووية استخلاص حامض، ما سمح لعينة أزل إلى رانه جنيه خزان واستخراجه مع ماصة للتحليل الكمي من قبل 10،12. RT-PCR نظهر isotachopherograms وضع هضبة لفصل الأحماض الأمينية في الشكل 5. ويمكن استخدام كثافة مضان (نسبة إلى جنيه أو TE كثافة المنطقة) لتحديد هوية المنطقة، في حين بعرض منطقة تمكين تحديد الكميات.

الشكل 1.
الشكل 1. Isotachophoresis (آي تي بي) هو أسلوب حركي كهربي استخدامها في تطبيقات ميكروفلويديك للكشف عن حساسية والفصل بين الأيونات. ITP تقدم فصل، مع التركيز الانتقائي، وقدرات preconcentration. وبالإضافة إلى ذلك، فمن قوي للغاية وحساسة للاضطرابات البدنية بسبب طبيعتها الذاتية شحذ. الأيونات عينة تركز بشكل انتقائي بين المنحل بالكهرباء الرائدة (LE) وزائدة (TE) والسفر من خلال متناهية بسرعة ثابتة تحددها سرعة الأيونات الرائدة في منطقة جنيه. عينة أيوناتتركز في حالة قدرتهم على التنقل بين قوسين الكهربي فعالة من جانب الحركة الفعال للأيونات جنيه والشركة المصرية للاتصالات. التخطيطي يصور تجربة نموذج آي تي ​​بي حيث يركز نموذج مستمر بين جنيه ومناطق الشركة المصرية للاتصالات.

الشكل 2.
الشكل 2. خفف عينة أيونات التركيز في "ذروة وضع" آي تي بي. أ) اثنان متميزة المخففة (ج عينة << ج جنيه) التركيز الأنواع في وضع الذروة في واجهة شكلت بين جنيه ومناطق الشركة المصرية للاتصالات. فقط على جنيه والشركة المصرية للاتصالات تحديد الحقل الكهربائي، والأنواع عينة لا تساهم بشكل كبير في الحالية. الأيونات عينة مختلطة مع الشركة المصرية للاتصالات (في حقن شبه لانهائية) والتركيز معا في ذروة التمويه تقريبا في واجهة ITP. معيار التركيز (كما هو موضح عدم المساواة) ينطبق على الأنواع المتأين بقوة. ب) التجارب تبين اليكسا فلور 488 (AF488) ركز في وضع الذروة بالنسبة لمجموعة واسعة من التيارات التطبيقية (انظر أيضا VIDEO 1). عرض عينة ذروة يتناسب عكسيا مع الحالي (لتشتت عبر الهوائي الأفقي لا تذكر نظرا لتدفق electroosmotic) 14 واجهة الذاتي شحذ المقاومة للتشتت بسبب الضغط يحركها تدفق (انظر فيديو 2).

الشكل 3.
الأيونات عينة الرقم 3. في التركيز تركيز عالية بما فيه الكفاية في "وضع هضبة" وحكم الموصلية المحلية. نقدم عادة الأيونات عينة في حقن محدود بين الشركة المصرية للاتصالات وجنيه. في هذه الطريقة، الأيونات عينة منفصلة والنظام وفقا لقدرتهم على الحركة الكهربي فعالة (انظر الفيديو 3). بالنسبة للأنواع المتأين بقوة، مصممون على الشركة المصرية للاتصالات وتركيزات هضبة المنطقة من قبل وظيفة التنظيم كولراوش (ينتج KrF، مجموعة ثابتة في البداية من منطقة جنيه). الأيونات المخففة مواصلة التركيز في وضع الذروة بين أقواس مناطق هضبة التنقل على نحو فعال. تركز جriterion (كما هو موضح عدم المساواة) ينطبق على الأنواع المتأين بقوة.

الشكل 4.
الشكل 4. المحللة إعداد واستخراج حامض النووي مع ITP وضع الذروة. ويتم استخراج الحمض النووي من E. كولاي ثقافة الخلية باستخدام الليزوزيم بمساعدة lysing القلوية وتنقيته بواسطة الكهربي انتقائية تركز عبر ITP. TE مختلطة مع المحللة (براون) على الهدف الحمض النووي (الأخضر)، والبروتينات، وإمكانات كيمياء PCR المثبط لل. اختيار المناسب من زائدة وقيادة أيونات تمكن انتقائي تركيز حمض النووي الهدف مع ترك مثبطات PCR وراء. مجموع النووي ذروة ITP حامض غالبا ما يأخذ شكلا غير مثالي، كما هو موضح هنا في صورة أقحم. كدليل على هذا الاختبار، ونحن الحمض النووي المستخرج من مجموع الجراثيم سلبية الغرام، كولاي (هي lysed مع حل هيدروكسيد الصوديوم وحدها)، منقى من NA المحللة باستخدام آي تي بي، التي تم جمعهافي. استخراج المواد الجينية، وأداء qRT-PCR تحليل للتحقق من نجاح تنقية الريباسي 16S (الأحمر) و16S rDNA (الخضراء) من ثقافة جرثومية كانت سلبية دورات عتبة السيطرة على 16S الريباسي (الأزرق) و 16S rDNA (الصفراء) كل أكثر من 30 دورة. أجرينا qRT-PCR باستخدام القوة SYBR الأخضر RNA إلى C 1-T الخطوة مجموعة من النظم البيولوجية التطبيقية مع 150 نانو متر إلى الأمام (5'-CGGATTGGAGTCTGCAACTCG)، وعكس الاشعال (5'-CACAAAGTGGTAAG CGCCCTC)، في ظروف الدراجات الحرارية الموصى بها.

الشكل 5.
الشكل 5. عدم التركيز التتبع (NFT) فحص للانفصال وكشف من الأحماض الأمينية غير المسماة. أ) تخطيطي للفحص NFT. أن يتم وضع حقن محدود من الأيونات عينة في القناة الشرقية. مزيج نحن جنيه مع fluorophore التتبع الموجبة مع الحركة الفعالة أقل من الأيونات الشركة المصرية للاتصالات (التتبع μ <μ TE). وfluorophoreوقال ليكون بمثابة "التتبع underspeeding". كما fluorophore electromigrates من جنيه في المناطق المحتلة الآن من قبل عينة الهضاب والشركة المصرية للاتصالات، وهو يمر أعلى الحقل الكهربائي، وبالتالي زيادة تركيزه. هذا التغيير في تركيز يخلق الخطوات في isotachopherogram. ب) الفصل بين اثنين من الأحماض الأمينية، وأرجينين ليسين، وذلك باستخدام الفحص NFT مع 6G رودامين كما التتبع underspeeding فلوري. ذروة طفيف بين الشركة المصرية للاتصالات وأرجينين هو شائع في آي تي ​​بي، ليست مفهومة جيدا، وهنا لا يتعارض مع كشف أو قياس الهضاب.

فيلم تكميلية 1. انقر هنا لعرض الفيلم تكميلية .

فيلم التكميلي 2. انقر هنا لعرض الفيلم تكميلية .

فيلم التكميلي 3. انقر هنا لعرض الفيلم تكميلية .

Discussion

قدمت وسائل تمكين ITP هنا الكشف السريع وحساسة وقوية والتعامل مع الجزيئات الأيونية. التحدي الرئيسي في استخدام آي تي ​​بي هو الخيار السليم للمخازن جنيه والشركة المصرية للاتصالات. في آي تي ​​بي أنيوني، نختار عادة كلوريد كما أنيون الرائدة لأنه هو حمض قوي مع الحركة المطلقة عالية جدا، وبالتالي لها خصائص يمكن التنبؤ بها جدا. لذلك، ينخفض ​​عادة خيار عازلة في ITP أنيوني إلى اختيار الشركة المصرية للاتصالات المناسبة وcounterion. لانتقائية تركز التجارب، TE الاختيار أمر بالغ الأهمية لاستبعاد تلويث الأيونات. في التطبيقات حيث لا وجود الملوثات، وانخفاض TE التنقل فعال يؤدي إلى أسرع معدل من التركيز. نوصي باستخدام ما يلي، نسبيا حسن تصرف أنيوني أيونات الشركة المصرية للاتصالات: MES، المماسح، HEPES، tricine. اختيار counterion يؤثر على كل من درجة الحموضة النظام والشركة المصرية للاتصالات تنقل فعالة. counterions شيوعا هي تريس (الباكاف الحمضية 8.1) ومكرر تريس (الباكاف الحمضية 6.4). للفحوصات التي تتطلب درجة الحموضة أقل أو أعلى، فإننا نوصي بيريدين (الباكاف الحمضية 5.25) وإيثانولامين (الباكاف الحمضية 9.5)، على التوالي. في الجدولين 1 و 2، آي تي بي للأنيوني والموجبة، على التوالي، ونحن تلخيص عدة أمثلة العازلة مفيد. نحن نأخذ حمض الهيدروكلوريك كما أيون جنيه أنيوني والصوديوم وأيون جنيه الموجبة، ونحن نفترض 100 قوة الأيونية ملم من المنطقة العازلة جنيه.

والقارئ لاحظ أن قوة أيونية عازلة في بروتوكولات لدينا (والجداول 1-2) هي دائما أكبر من أو يساوي 10 مم. بينما في نظرية فيزياء ITP ينطبق على القوة الأيونية أقل من 10 ملم، والملوثات الطبيعية (حامض الكربونيك على سبيل المثال من التفاعل بين الماء وغاز ثاني أكسيد الكربون في الغلاف الجوي) بالقرب من مستوى ملي 1 غالبا ما تحد من الاستخدام العملي للمنخفض مخازن القوة الأيونية.

نلاحظ أن لا يقتصر إشارة آلية تنبيغ لفحوصات الواردة في هذا البروتوكول. كما يمكن مناقشتها بإيجاز في الجزء 5، في وضع هضبة تنقية مناطق يمكن اكتشافها من خلال التغييرات في الموصلية المحلية، والأشعة فوق البنفسجية absorبانس، ودرجة الحرارة، أو مؤشر الانكسار. في المجموعة الخاصة بنا، وقمنا بتطوير طريقة التي تستخدم ampholytes الناقل فلوري للكشف عن الحساسية، وتحديد من analytes غير معروف. (5) والتجارب وضع الذروة، ويمكن استخدام مجسات خاصة لتسمية التحاليل تركيزا. في مثال واحد، ونحن نستخدم منارات الجزيئية - تحقيقات قليل النوكليوتيد أن يتألق على تهجين تسلسل إلى هدفهم - للكشف عن الحمض النووي المستهدف أو جزيئات الحمض النووي الريبي مع خصوصية عالية 11،18.

في حين ITP قوية نسبيا إلى التشتت الناجم عن الضغط يحركها تدفق وEOF، EOF المفرط يمكن أن يؤدي إلى ركود واجهة ITP، حيث سرعة EOF يعني يصبح مساويا لسرعة ITP. 14 EOF قوي مثل هذا يحدث خصوصا في ظل ظروف ارتفاع درجة الحموضة والقوة الأيونية منخفضة. لهذا السبب، من المستحسن استخدام العازل مع درجة الحموضة (8) أو أقل، ومع القوة الأيونية بناء على أمر من 100 مم إذا مريحة. في تجربتنا، هو PVPمعظم طلاء فعالة لقمع EOF في رقائق البورسليكات. ومع ذلك، لما له من خصائص النخل، قد PVP لا يكون مناسبا لبعض التطبيقات، مثل التركيز الحمض النووي الجيني. في التجارب، ونحن نلاحظ أن إضافة PVP يمكن أن يقلل كثيرا الجينومية التنقل الحمض النووي المطلق (لدرجة أنها لا تركز). في هذه الحالات يمكن للطلاء silanol مثل Sigmacote في الاقتران مع السطحي (مثل تريتون-X 100) أيضا أن تكون فعالة في الحد من EOF. 10

TE أنيون (الباكاف الحمضية -1)
التخزين المؤقت counterion (الباكاف الحمضية +1) MES (6.10) اجتماعات الأطراف (7.20) HEPES (7.50) tricine (8.15)
إيثانولامين (9.50) 21.41 20.40 17.38 22.85
تريس (8.08) 21.00 19.23 </ TD> 15.84 17.56
مكرر تريس (6.40) 18.22 10.41 7.30 5.23
بيريدين (5.18) 1.01 3.72 2.42 1.48

الجدول رقم 1. فعال حجم التنقل (× 10 -9 م 2 / V / S) من المعدل منطقة الحليلة نقي في ITP أنيوني حيث هو 100 جنيه حمض الهيدروكلوريك ملم و 200 ملم counterion التخزين المؤقت.

TE الكاتيون (الباكاف الحمضية +1)
التخزين المؤقت counterion (الباكاف الحمضية -1) إيثانولامين (9.50) تريس (8.08) مكرر تريس (6.40) بيريدين (5.18)
MES (6.10) 35.57 21.96 16.39 10.45
MOPS (7.20) 35.47 20.92 9.76 3.93
HEPES (7.50) 35.35 19.97 7.77 2.88
Tricine (8.15) 34.77 16.72 4.50 1.44

الجدول 2. الفعال حجم التنقل (× 10 -9 م 2 / V / S) من المعدل منطقة الحليلة نقي في ITP الموجبة حيث هو 100 جنيه الصوديوم ملم و 200 ملم counterion التخزين المؤقت.

Disclosures

ليس لدينا ما يكشف.

Acknowledgments

نحن الامتنان على تمويل من ترعاه DARPA مايكرو / نانو التركيز أساسيات Fluidics (MF3) مركز تحت رقم العقد N66001-10-1-4003، ومنحة من داربا N660001-09-C-2082.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Distilled water GIBCO, by Life Technologies 10977 RNase/DNase free
Clorox Ultra Clorox 02489CT
sodium hydroxide (NaOH) Mallinckrodt Baker Inc. 7708
hydrochloric acid (HCl) EMD Millipore HX0603-4
Trizma base (tris) Sigma-Aldrich T6066
polyvinylpyrrolidone (PVP) Polysciences, Inc. 06067 MW 1,000,000
HEPES Sigma-Aldrich H-4034
Alexa Fluor 488 carboxylic acid Invitrogen A20000
tricine Sigma-Aldrich T-9784
bis-tris Sigma-Aldrich B4429
EDTA GIBCO, by Life Technologies AM9260G
Triton-X 100 Sigma-Aldrich X100
lysozyme Sigma-Aldrich L6876
SYBR Green II Invitrogen S7564
ethanolamine Sigma-Aldrich 411000
Rhodamine 6G Acros Organics CAS 989-38-8
L-Amino Acids Sigma-Aldrich LAA21
Power SYBR Green RNA-to-CT 1-Step Kit Applied Biosystems 4389986
PCR primers Integrated DNA Technologies
Borosilicate microfluidic chip Caliper Life Sciences NS12A Supplied with or without plastic caddy
Vacuum pump Gast Manufacturing, Inc. DOA-P104-AA
Sourcemeter Keithley 2410 Constant current and constant voltage operation modes
Inverted epifluorescent microscope Olympus Corporation IX70 Use mercury lamp (Olympus) or LED (Thorlabs) for illumination
Filter cube Omega Engineering, Inc. XF115-2 Excitation/emission: blue/green
Safe-lock microcentrifuge tubes Eppendorf 022363204 1.5mL capacity
Centrifuge Eppendorf 5417C
Table 3. Specific reagents and equipment.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jung, B., Bharadwaj, R., Santiago, J. G. On-chip millionfold sample stacking using transient isotachophoresis. Anal. Chem. 78 (7), 2319-2319 (2006).
  2. Jung, B., Zhu, Y., Santiago, J. G. Detection of 100 am fluorophores using a high-sensitivity on-chip CE system and transient isotachophoresis. Anal. Chem. 79 (1), 345-345 (2007).
  3. Everaerts, F. M., Beckers, J. L., Verheggen, T. P. E. M. Isotachophoresis: Theory, instrumentation, and applications. Elsevier Science & Technology. , (1976).
  4. Khurana, T. K., Santiago, J. G. Preconcentration, separation, and indirect detection of nonfluorescent analytes using fluorescent mobility markers. Anal. Chem. 80 (1), 279-279 (2008).
  5. Bercovici, M., Kaigala, G. V., Backhouse, C. J., Santiago, J. G. Fluorescent carrier ampholytes assay for portable, label-free detection of chemical toxins in tap water. Anal. Chem. 82 (5), 1858-1858 (2010).
  6. Bercovici, M., Kaigala, G. V., Santiago, J. G. Method for analyte identification using isotachophoresis and a fluorescent carrier ampholyte assay. Anal. Chem. 82 (5), 2134-2134 (2010).
  7. Kaigala, G. V. Miniaturized system for isotachophoresis assays. Lab Chip. 10 (17), 2242-2242 (2010).
  8. Chambers, R. D., Santiago, J. G. Imaging and quantification of isotachophoresis zones using nonfocusing fluorescent tracers. Anal. Chem. 81 (8), 3022-3022 (2009).
  9. Schoch, R. B., Ronaghi, M., Santiago, J. G. Rapid and selective extraction, isolation, preconcentration, and quantitation of small RNAs from cell lysate using on-chip isotachophoresis. Lab Chip. 9 (15), 2145-2145 (2009).
  10. Persat, A., Marshall, L. A., Santiago, J. G. Purification of nucleic acids from whole blood using isotachophoresis. Anal. Chem. 81 (22), 9507-9507 (2009).
  11. Bercovici, M. Rapid detection of urinary tract infections using isotachophoresis and molecular beacons. Anal. Chem. 83 (11), 4110-4110 (2011).
  12. Marshall, L. A., Santiago, J. G. Extraction of DNA from malaria-infected erythrocytes using isotachophoresis. Anal. Chem. 83 (24), 9715-9715 (2011).
  13. Persat, A., Chambers, R. D., Santiago, J. G. Basic principles of electrolyte chemistry for microfluidic electrokinetics. Part I: Acid-base equilibria and pH buffers. Lab Chip. 9 (17), 2437-2437 (2009).
  14. Garcia-Schwarz, G., Bercovici, M., Marshall, L. A., Santiago, J. G. Sample dispersion in isotachophoresis. J. Fluid Mech. 1 (1), 1-1 (2011).
  15. Kohlrausch, F. Über concentrations-verschiebungen durch electrolyse im inneren von lÖsungen und lÖsungsgemischen. Ann. Phys. 298 (10), 209-209 (1897).
  16. Alberty, R. A. Moving boundary systems formed by weak electrolytes. Theory of simple systems formed by weak acids and bases. J. Am. Chem. Soc. 72 (6), 2361-2361 (1950).
  17. Jovin, T. M. Multiphasic zone electrophoresis. I. Steady-state moving-boundary systems formed by different electrolyte combinations. Biochem. 12 (5), 871-871 (1973).
  18. Persat, A., Santiago, J. G. MicroRNA profiling by simultaneous selective isotachophoresis and hybridization with molecular beacons. Anal. Chem. , (2011).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 61، Isotachophoresis، electrokinetics، على microfluidics، إعداد عينة
على رقاقة Isotachophoresis للفصل بين الأيونات والتنقية من الأحماض النووية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Garcia-Schwarz, G., Rogacs, A.,… More

Garcia-Schwarz, G., Rogacs, A., Bahga, S. S., Santiago, J. G. On-chip Isotachophoresis for Separation of Ions and Purification of Nucleic Acids. J. Vis. Exp. (61), e3890, doi:10.3791/3890 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter