Summary
本文介绍了优化多式联运成像啮齿动物脑细胞的使用移植的事件序列:(i)在活体动物和磁共振成像,及(ii)验尸的病理分析。结合在一个单一的动物允许这些成像分辨率高,灵敏度和特异性细胞移植评估。
Abstract
在过去十年中,造血干细胞移植已越来越为原发性或继发多种疾病,在临床前和临床研究的治疗方法的兴趣。然而,迄今为止,有关功能的结果和/或组织再生以下干细胞移植的结果是多种多样的。一般来说,临床受益观察没有深刻理解底层机制(S)1。因此,多的努力已导致不同的分子成像的发展,以监察其最终目的的干细胞移植,以准确评估移植的干细胞和/或他们的微环境的生存,命运和生理。分子成像确定一个或多个参数的变化可能与观察到的临床效果。在此背景下,我们的研究侧重于生物发光成像的结合使用。(BLI),磁共振成像(MRI)和病理analysis到评价干细胞移植。
,劳保局常用非侵入性细胞跟踪和监视细胞的生存时间,移植后2-7细胞表达荧光素酶报告基因的生化反应的基础上能够发出光以下的相互作用,其基板(例如D-荧光素),8,9。另一方面,MRI是一种非侵入性的技术,这是临床上适用10,可用于精确定位,具有很高的分辨率11-15细胞移植,但其灵敏度高,取决于细胞标记后生成的磁共振造影剂的对比。最后,验尸的病理分析的首选方法,以验证获得最高的分辨率和灵敏度的非侵入性技术的研究成果。此外终点的病理分析,让我们进行详细的表型分析移植的细胞和/或周围组织,BASED上使用荧光记者蛋白质和/或直接与特异性抗体细胞标记。
总之,我们在这里直观地展现劳保局,MRI和组织学的互补性,解开不同的干细胞和/或环境相关的特征后,干细胞移植在小鼠中枢神经系统。作为一个例子,骨髓基质细胞,基因工程表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和萤火虫荧光素酶(fLuc),和蓝色荧光微米大小的氧化铁粒子(MPIOs)标记,将嫁接中枢神经系统免疫能力的小鼠和成果将监测劳保局,MRI和组织学( 图1)。
Protocol
1。细胞的制备
- 应开始实验使用体外培养干细胞基因工程表达的荧光素酶和绿色荧光蛋白记者蛋白质的人群。在这里,我们使用荧光素酶/ EGFP表达小鼠骨髓来源的基质细胞(BMSC-Luc/eGFP)以前Bergwerf 等。2,5。
- 细胞标记,在8×10 5%的T75培养瓶中的细胞密度在15毫升完整的扩展介质(CEM),辅以1微克/毫升Puromycine板BMSC-Luc/eGFP细胞前两天。
- 让细胞成长为48小时37°C和5%的CO 2。
- 新增5 6冰川蓝微米大小的氧化铁粒子(GB MPIO)的每毫升培养基中日益增长的细胞培养(总数:75×10×10 6粒子中的T75培养瓶中,每15毫升的培养基)。
- 孵育16小时,让粒子通过内吞作用摄取。
- 洗去剩余的颗粒让细胞成长为一个额外的24小时,以获取细胞的汇合和均匀分布的GB的MPIO。
- 视使用荧光显微镜验证粒子吸收EGFP + GB的MPIO +细胞计数的EGFP +细胞总量的比例。
- 洗GB的MPIO标记BMSC-Luc/eGFP细胞10毫升PBS和收获细胞,胰蛋白酶EDTA治疗,每5分钟的T75培养瓶中(5毫升)的两倍。
- 在终浓度为133×10 6细胞/毫升的PBS洗收获和重悬细胞。
- 保持冰,直到移植的细胞。
2。在小鼠中枢神经系统的细胞移植
- 麻醉小鼠腹腔注射氯胺酮(80毫克/千克)+甲苯噻嗪(16毫克/千克)混合。
- 等待5分钟,让老鼠入睡。
- 刮胡子的无菌操作,让鼠标头。
- 鼠标放置在一个立体框架。
- Desinfect“皮肤和湿老鼠的眼睛,以防止脱水。
- 使头皮正中切口,暴露颅骨,并在使用在给定的坐标牙科钻毛刺的头骨钻洞后2毫米和2毫米,横向到囟门。
- 涡简要的细胞悬液,在注射器吸出细胞悬液。
- 放置在深度为2.5毫米的针头硬膜下,允许1分钟的压力平衡。
- 注入硬膜下2毫米的深度和0.70μL/ min的速度在3μl的细胞悬液(4×10 5细胞)使用自动微量注射泵。
- 等待一个额外的5分钟,注入细胞悬液,以防止回流。
- 慢慢地缩回针头和消毒皮肤缝合皮肤前的边界。
- 为了防止脱水,注入300μL0.9%NaCl溶液皮下注射,并将其置于鼠标下加热灯,从麻醉中恢复。管理带够按照制度标准的的OST手术镇痛。
3。 在活体动物
- 麻醉小鼠的3%异氟醚和氧气的混合物。
- 放置在光子成像的小鼠和麻醉水平降低至1.5%,异氟醚和氧气。
- 注射每公斤体重150毫克的D-荧光素静脉滴注。
- 收购照片Vision软件使用5分钟的形象。
- 执行图像处理使用M3vision软件。量化观测到的信号,使用固定利率地区。
4。 在体内磁共振成像
- 与O 2的混合物在3%异氟醚麻醉小鼠的N 2 O(3:7)。
- 限位水平的9.4T磁共振系统放置在老鼠和减少麻醉水平的1%O 2的混合物中的异氟醚的N 2 O(3:7)。
- 润润的老鼠的眼睛,以防止脱水TION,重视直肠探头监测体温和鼠标肚子底下放置一个传感器监测呼吸频率。
- 保持在110±10每分钟呼吸呼吸率和保持体温恒定在37±0.5℃的范围狭窄
- 将鼠标头和鼠标在磁铁的中间位置上的表面射频线圈。
- 获得一套10冠状T2加权自旋回波(SE)的影像,以获得特定的解剖信息和T2 *加权梯度回波(GE)的图像,为了研究干细胞移植与平面的分辨率为70微米2。设置序列参数如下:重复时间(TR):500毫秒,回波时间(TE):8毫秒(GE序列)和重复时间(TR):4200毫秒,回波时间(TE):12.16毫秒(SE序列);领域的视角(FOV):18×18毫米2,矩阵:256×256,1毫米层厚1毫米的片分离(Paravision 5.1软件)。
- 执行数据处理使用阿米拉4.0软件。
5。后验切片
- ,isofluorane(4%),氧气(0.5升/分钟)和氮(1升/分钟)2分钟的混合物吸入麻醉小鼠很深。牺牲小鼠颈椎脱位。
- 从头骨中取出的小鼠大脑和注视的脑组织在4%多聚甲醛的PBS 2小时。
- 脑组织脱水,被放置在不同的蔗糖梯度大脑随后在5%蔗糖PBS,2小时2小时,在10%蔗糖PBS中,20%蔗糖的PBS过夜。
- 使用液氮冻结的脑组织,并储存于-80°C至切片组织。
- 第10使用恒温器微米厚的部分脑组织。
- 屏幕不染的GB MPIO颗粒和EGFP表达细胞用荧光显微镜的绿色荧光的蓝色荧光的冰冻切片。
- 屏幕不染冰冻切片为绿色/红色炎性细胞的背景荧光。
- 执行进一步的免疫组化和免疫荧光染色,以确定内源性细胞群(如胶质细胞,星形胶质细胞,T细胞,...)与细胞移植相互作用。
6。代表结果
我们在这里直观地提出了一个优化多式联运成像成功的萤光素酶/ EGFP-气骨(干)在小鼠中枢神经系统的细胞群的事件序列。起初,描述GB的MPIO的标签高效的BMSC-Luc/eGFP细胞的标签,可以很容易地验证程序的结果用荧光显微镜( 图2A)。下一步,根据GB的MPIO的嫁接标记BMSC-Luc/eGFP在小鼠中枢神经系统,移植细胞的生存可以被监测,由劳保局在体内荧光素酶的活性( 图2B)的基础上。此外,移植细胞的精确定位, 在体内可以监控图2C)MRI检查。最后,病理分析,使BLI和MRI所取得的成果进行验证。稳定的生存证实EGFP表达稳定在时间( 图2D)。对于这一点,共存EGFP表达细胞与蓝色荧光的MPIO允许精确测定本地化和移植细胞的生存。此外,这种双重荧光标记的干细胞减少的可能性,以观察5炎性细胞产生的背景荧光的假阳性结果。
处理顺序概述图1。
- 细胞标记:BMSC-Luc/eGFP 5×10 6 GB的MPIO的每毫升培养液中的颗粒标记。孵化后16小时和24小时以下的休息时间,细胞收获脑内植入。
- 细胞植入的MPIO GB的标记BMSC-Luc/eGFP嫁接在老鼠大脑在以下坐标:前囟门-2毫米,从中线和硬膜下的2毫米2毫米的权利。
- 产生的光在体内劳保局:下面的静脉给药150毫克D-luciferin/kg体重,收购期间使用的光子成像的5分钟。
- 体内 MRI:一套10冠状T2加权自旋回波(SE)的图像和T2 *加权梯度回波(GE)的图像与平面的分辨率为70微米2,被收购。序列的参数如下:重复时间(TR):500毫秒,回波时间(TE):8毫秒(GE序列)和重复时间(TR):4200毫秒,回波时间(TE):12.16毫秒(SE序列);领域的视角(FOV):18×18毫米2,矩阵:256×256,1毫米层厚1毫米的片分离。
- 验尸报告组织学:10微米厚的冰冻切片,筛选表达EGFP和蓝色荧光标记的骨髓基质细胞ü唱荧光显微镜。
图2。多式联运成像干细胞移植
- 冰蓝色(GB)的MPIO直接免疫荧光显微镜标记BMSC-Luc/eGFP。
- GB 在体内注射4X10 5小鼠劳保局MPIO的标记在有BMSC-Luc/eGFP 1周和2周后植入细胞。劳保局信号的检测,在第1周和2周后植入的统计分析。从5分钟的时间,平均每平方厘米每秒每球面度的光子数(PH / S / SR /厘米2)数据表示为+ / -小鼠呈现出明显的劳保局信号从一个固定的区域利益计算标准错误在注射部位。
- 日冕二维MRI GB的MPIO的标记BMSC-Luc/eGFP(左侧面板:(一)自旋回波T2加权图像和(二)T2 *加权梯度回波图像)和未标记的骨髓基质细胞 - LUC / EGFP(右图:(三)T2加权自旋回波图像和(六)T2 *加权梯度回波图像)在鼠脑移植。
- GB的MPIO的组织学分析标记BMSC-Luc/eGFP种植体植入后2周。 (一)直接免疫荧光分析EGFP表达和GB的MPIO的的标记BMSC-Luc/eGFP移植本地化。 (二)高倍率的细节(我)。 (三)免疫荧光染色,GFAP的抗原,表明在GB的MPIO的周围的星形细胞瘢痕组织发展BMSC-Luc/eGFP标记。 (六)为伊巴-1抗原的免疫荧光染色,表明入侵和周围GB的MPIO的标记的小胶质细胞BMSC-Luc/eGFP。
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Discussion
在这份报告中,我们描述了一个在免疫小鼠中枢神经系统的细胞植入的详细描述。(BLI,MRI和组织学)三个互补的成像方式的组合优化的协议。记者细胞的基因标记,记者萤火虫荧光素酶和绿色荧光蛋白基因,并直接与GB的MPIO细胞标记基因改造的基础上,组合会导致体内的干细胞移植在准确的评估。
粒子标记的骨髓间充质干细胞,GB的的MPIO粒径组合与阴离子表面(羧基替代)(1.63μm)的建议,以方便非吞噬细胞16-18 endocytotic摄取这些颗粒。然而,它需要被提及的孵化时间,以获得高效率标识是细胞类型而定。例如,吞噬细胞(如巨噬细胞和树突状细胞)能够更迅速地内部,这些粒子(孵化时间为0.5 - 1小时)相比,非phaghocytic细胞类型(如骨髓基质细胞或神经干细胞),这需要一个高效的标签最小的16小时的孵化时间。这就需要考虑,而应采取的执行应始终在事先确定采用荧光显微镜和/或流式细胞仪分析细胞标记实验和效率标签。由于细胞群的标签符合GB MPIOs不影响细胞活力,细胞增殖或细胞表型5,氧化铁和在这些粒子的荧光相结合,因此,MRI和光学成像可视化创建一个理想的机会。此外,由于高铁含量和粒度大,MPIO的颗粒可用于单细胞12,19,20和21单粒子成像的MRI。当它来研究细胞迁移作为单个细胞可以观察到,这是非常有趣。然而,使用GB的MPIO的铁含量高颗粒也有一定的缺点,瞄准时划定移植的MRI网站的确切大小。不仅创造了非常高的铁含量的MPIOs在植入部位的磁场不均匀性,而且在周围的细胞植入,导致高估植入部位的体积和植入的细胞与周围组织之间的不准确的歧视。因此,颗粒型,细胞标记需要,将取决于研究设计。当以确定干细胞移植,灵敏度非常高,因此高铁将需要包含MPIOs。另一方面,当铁含量较低,为干细胞移植,小SPIOs准确定位目标可能是一个较好的替代品22。此外,铁粒子产生负面的对比度,引入另一个问题植入的细胞之间的歧视和出血后细胞移植。因此大量的研究会向细胞标记阳性造影剂的使用。颗粒型,用于收购的MRI序列类型也取决于研究的目的。当MRI用于划定种植体的植入位置和植入体积,在T2序列上获得准确的信息(自旋回波)是有利的,因为它提供了高精度的解剖信息。另一方面,在T2 *序列(梯度回波)是用来研究可能的移植细胞的迁移,这个序列考虑到所有的磁场对磁场影响的化合物呈现较高的灵敏度inhomogenities序列。这个序列是绝对必要的,当涉及到少量的细胞植入区域可能已迁移的检测。使用这个序列,我们可以得出结论,BMSC-Luc/eGFP细胞在小鼠中枢神经系统纹状体植入后不迁移。
而磁共振成像提供细胞植入本地化方面的数据,其他劳保局分析细胞植入存活2,4,11提供的有关数据。作为之间的荧光素酶和底物荧光素酶反应需要的O 2和ATP的存在,它是一个可靠的技术来研究细胞的存活。坏死的细胞不会表达荧光素酶和无O 2和ATP将出席。此外,只有细胞表达荧光素酶能够催化反应,导致生产的光,它类似于该技术的高灵敏度。劳保局可以在定量的方式进行,因为产生的光量与荧光素酶表达细胞的数量成正比。然而,重要的考虑因素需要考虑,同时表现为细胞数量比其他几个因素可以影响的荧光素酶的表达水平或检测到的光量劳保局定量。例如,anesthesi水平可以影响荧光素酶和/或荧光素可用性23,不同的因素和化合物可以影响基材的可用性和/或27-30摄取24-26或启动子活性,在信号输出的差异造成的。此外,劳保局的使用是有限的小动物,该技术仅限于低光组织渗透。因此,瞄准时执行定量劳保局跟进移植后的细胞存活,所有参数可能影响信号的变化,需要尽可能保持标准。例如,植入细胞移植,麻醉水平和给药途径/劳保局收购前管理的基板量,正确剃须动物的皮肤,等深度
考虑到上面描述的分子成像技术的优势和缺点,得到的结果总是需要由组织学分析验证。特此VARIO我们的细胞表型和不同类型的细胞之间的细胞相互作用,可以可视化,灵敏度最高的验尸。尽管事实上,这种技术是首选的验证工具,炎性细胞周围和/或入侵移植网站需要考虑的,因为这可能会导致假阳性结果产生的背景荧光的存在。然而,使用一个双标记荧光报告基因,如绿色荧光蛋白,荧光探针,如GB的MPIO,减少误认的可能性(即移植细胞在无关紧要的光,而不显示背景荧光显示的两个特定的荧光,通道)。
总结,而劳保局是一个独特的技术来监测细胞存活时间中具有很高的灵敏度,但分辨率低定量的方式,MRI是首选的技术来克服劳保局获得的分辨率低。这些组合在体内 TECHNIQUES移植细胞在体内生存和本地化的一种非侵入性的方式呈现了足够的信息。最后,与周围组织和/或内源性炎性细胞的细胞移植物的相互作用可以很容易地进行监测验尸利用组织学。虽然,目前,后者仍然需要做病理分析,未来面临的主要挑战将是改善现有的体内分子成像方式,允许实时评估获得类似的分辨率和灵敏度的参数使用组织学分析。
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Disclosures
作者宣称没有利益冲突。
Acknowledgments
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
IMDM | Lonza Inc. | BE12-722F | Component of the cell growth medium CEM |
Fetal bovine serum | GIBCO, by Life Technologies | 10270-106 | Component of the cell growth medium CEM |
Horse serum | GIBCO, by Life Technologies | 1605-122 | Component of the cell growth medium CEM |
Penicillin-streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | Component of the cell growth medium CEM |
Fungizone | GIBCO, by Life Technologies | 15290-018 | Component of the cell growth medium CEM |
PBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190 | |
Puromycine | Invitrogen | ant-pr-1 | |
trypsin | GIBCO, by Life Technologies | 25300 | |
GB MPIO | Bangs Laboratories | ME04F/7833 | |
D-luciferin | Promega Corp. | E1601 | |
Ketamine (Ketalar) | Pfizer Pharma GmbH | ||
Xylazine (Rompun) | Bayer AG | ||
Isoflurane | Isoflo | 05260-05 | |
0.9% NaCl solution | Baxter Internationl Inc. | ||
paraformaldehyde | Merck & Co., Inc. | 1.04005.1000 | |
sucrose | Applichem | A1125 | |
Micro-injection pump | KD scientific | KDS100 | |
Photon imager | Biospace Lab | ||
9.4T MR scanner | Bruker Corporation | Biospec 94/20 USR | |
BX51 microscope | Olympus Corporation | BX51 | |
Mycrom HM cryostat | Prosan | HM525 | |
syringe | Hamilton Co | 7635-01 | |
30 gauge needle | Hamilton Co | 7762-03 | |
Photo Vision software | Biospace Lab | ||
M3vision software | Biospace Lab | ||
Paravision 5.1 software | Bruker Corporation | ||
Amira 4.0 software | Visage Imaging |
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