Multimodal Imaging af stamcelle implantation i det centrale nervesystem mus

Summary

Denne artikel beskriver en optimeret sekvens af begivenheder for multimodal billeddannelse af cellulære transplantater i gnaverhjerne med: (i) in vivo bioluminescens og magnetisk resonansimagografi, og (ii) post mortem histologisk analyse. Ved at kombinere disse billeddiagnostiske metoder på et enkelt dyr giver cellulære graft evaluering med høj opløsning, følsomhed og specificitet.

Abstract

I det sidste årti har stamcelletransplantation vundet stigende interesse som primær eller sekundær terapeutisk modalitet for en række sygdomme, både i prækliniske og kliniske undersøgelser. Men til dato resultater med hensyn til det funktionelle resultat og / eller vævsregeneration følgende stamcelletransplantation er ret forskellige. Generelt er en klinisk fordel observeres uden dybere forståelse af de underliggende mekanisme (r) ^1. Derfor har flere indsats førte til udviklingen af ​​forskellige molekylære billeddiagnostiske metoder til at overvåge stamceller podning med det endelige mål at præcist vurdere overlevelse, skæbne og fysiologi af podede stamceller og / eller deres mikro-miljø. Observerede ændringer i en eller flere parametre bestemmes ved molekylær billeddannelse kan være relateret til den observerede kliniske effekt. I denne sammenhæng fokusere vores undersøgelser på kombineret anvendelse af bioluminescens imaging (BLI), magnetisk resonans imaging (MRI) og histologiske analysis vurdere stamcelle podning.

BLI er almindeligt anvendt til ikke-invasivt at udføre cellesporing og overvåge celleoverlevelse i tid efter transplantation ^2-7, baseret på en biokemisk reaktion, hvor celler, der udtrykker luciferase-reportergenet, er i stand til at udsende lys efter interaktion med dets substrat (fx D- luciferin) ^{8, 9.} MRI på den anden side er en ikke-invasiv teknik, som er klinisk relevant ¹⁰ og kan anvendes til præcist at lokalisere cellulære transplantater med meget høj opløsning ^11-15, selv om dens følsomhed afhænger i høj grad kontrast genereret efter cellemærkning med et MRI-kontrastmiddel . Endelig post mortem histologisk analyse er den foretrukne fremgangsmåde til validering forskningsresultater opnået med ikke-invasive teknikker med den højeste opløsning og følsomhed. Endvidere endepunkt histologisk analyse gør det muligt at udføre detaljeret fænotypisk analyse af podede celler og / eller det omgivende væv, baSED om brugen af ​​fluorescerende reporter-proteiner og / eller direkte cellemærkning med specifikke antistoffer.

Sammenfattende, her er vi visuelt påvise komplementariteten af ​​BLI, MRI og histologi at udrede forskellige stamcelle-og / eller miljø-associerede egenskaber som følge stamceller podning i centralnervesystemet hos mus. Som et eksempel marv-afledte knogle stromaceller, genetisk manipuleret til at udtrykke forøget Green Fluorescent Protein (EGFP) og ildflueluciferase (udsving), og mærkes med fluorescerende blå mikrometerstore jernoxidpartikler (MPIOs) vil blive podet på CNS af immun-kompetente mus, og resultaterne vil blive overvåget af BLI, MRI og histologi (figur 1).

Protocol

1. Cellepræparat

1. Forsøgene skal initieres ved hjælp af ex vivo-dyrket stamcellepopulationer genetisk manipuleret til at udtrykke luciferase og EGFP reporter-proteiner. Her anvender Luciferase / EGFP-udtrykkende murine knoglemarv-afledte stromaceller (BMSC-Luc/eGFP) som tidligere beskrevet af Bergwerf et al. ^{2, 5.}
2. To dage før cellemærkning, plade BMSC-Luc/eGFP celler ved en densitet på 8 x 10 ⁵ celler pr T75 dyrkningskolbe i 15 ml komplet ekspansionsmedium (CEM) suppleret med 1 ug / ml Puromycine.
3. Tillader celler at vokse i 48 timer ved 37 ° C og _5% CO2.
4. Tilsæt 5 x 10 ⁶ Glacial blå mikrometerstore jernoxidpartikler (GB MPIO) per ml dyrkningsmedium til dyrkning cellekultur (total: 75 x 10 ⁶ partikler pr 15 ml dyrkningsmedium i en T75 dyrkningskolbe).
5. Inkuberes i 16 timer for at tillade partikel optagelse via endocytose.
6. Bortvaske resterende partiklerog tillader celler at vokse i yderligere 24 timer til opnåelse cellekonfluens og homogen fordeling af GB MPIO.
7. Validere partikel optagelse visuelt ved hjælp af fluorescensmikroskopi ved tælling af forholdet mellem EGFP + og GB MPIO +-celler til den totale mængde af eGFP +-celler.
8. Vask GB MPIO-mærkede BMSC-Luc/eGFP celler to gange med 10 ml PBS, og høst celler efter trypsin-EDTA-behandling (5 ml pr T75 dyrkningskolbe i 5 minutter).
9. Vask høstede celler og resuspender i en slutkoncentration på 133 x 10 ⁶ celler / ml i PBS.
10. Holde cellerne på is indtil transplantation.

2. Celle implantation i CNS hos mus

1. Bedøve mus ved en intraperitoneal injektion af en ketamin (80 mg / kg) + xylazin (16 mg / kg) blanding.
2. Vent 5 minutter for at tillade mus at falde i søvn.
3. Barbering musen hovedet for at tillade sterile manipulationer.
4. Placer musen i en stereotaktisk ramme.
5. Desinfect denhud og våde øjne mus for at forhindre udtørring.
6. Lav en midtlinie hovedbund snit til at eksponere kraniet, og bore et hul i kraniet ved en tandlægebor grat på den givne koordinater: 2 mm posterior og 2 mm lateralt for bregma.
7. Vortex cellesuspensionen kort opsuges cellesuspensionen i sprøjten.
8. Placere sprøjtenålen i en dybde på 2,5 mm under dura og tillade trykudligning i 1 minut.
9. Injicere en 3 pi cellesuspension (4 x 10 ⁵ celler) i en dybde på 2 mm under dura og ved en hastighed på 0,70 gl / minut under anvendelse af en automatiseret mikro-indsprøjtningspumpen.
10. Vent i yderligere 5 minutter for at forhindre tilbagestrømning af den injicerede celle suspension.
11. Langsomt trække kanylen og desinficer huden grænser inden syning huden.
12. Injicer 300 pi 0,9% NaCI-opløsning subkutant for at forhindre udtørring og anbringe musen under en varmelampe for at komme sig anæstesi. Administrer pOst-operativ analgetikum i overensstemmelse med institutionelle standarder.

3. In vivo Bioluminescens

1. Bedøve musene med en blanding af 3% isofluran og oxygen.
2. Placere mus i Photon Imager og reducere anæstesi niveau på 1,5% isofluran og oxygen.
3. Injicere 150 mg D-luciferin per kg kropsvægt intravenøst.
4. Anskaf billede i 5 minutter ved hjælp af Photo Vision software.
5. Udføre billedbehandling ved hjælp af M3vision software. Kvantificere observerede signal ved hjælp af faste områder af interesse.

4. In vivo Magnetic Resonance Imaging

1. Bedøve musene med 3% isofluran i en blanding _{af O2:} N2 O (3:7).
2. Placere mus i harpiksstopperen af en vandret 9.4T MR-systemet og reducere anæstesi niveau på 1% isofluran i en blanding _{af O2:} N2 O (3:7).
3. Befugte øjne mus for at forhindre dehydration, vedhæfte en rektal sonde til at overvåge kropstemperaturen og overvåge vejrtrækning ved at placere en sensor under musen maven.
4. Opretholde vejrtrækning ved 110 ± 10 åndedrag per minut og holde legemstemperatur konstant inden for et snævert interval af 37 ± 0,5 ° C.
5. Anbring overfladen RF-spolen på toppen af ​​muse hovedet og position musen i midten af ​​magneten.
6. Erhverve et sæt af 10 koronale T2-vægtede spin-ekko (SE) billeder for at opnå specifikke anatomiske oplysninger og T2 *-vægtede gradient-ekko (GE) billeder for at studere stamceller migration med en in-plan opløsning på 70 um ^2. Indstil sekvens parametre som følger: gentagelse tid (TR): 500 ms, ekkotid (TE): 8 ms (GE sekvens) og gentagelse tid (TR): 4200 ms, ekkotid (TE): 12,16 ms (SE sekvens); synsfelt (FOV): 18x18 ^mm2, matrix: 256x256, 1 mm skivetykkelse og 1 mm skive separation (Paravision 5,1 software).
7. Udfør databehandlinganvendelse Amira 4,0 software.

5. Post mortem Histologi

1. Bedøve musene dybt ved inhalation af en isofluoran (4%), oxygen (0,5 L / min) og nitrogen (1 l / min) blanding i 2 minutter. Ofre musene ved cervikal dislokation.
2. Fjerne musehjerne fra kraniet og fiksere hjernevæv i 4% paraformaldehyd i PBS i 2 timer.
3. Dehydrere hjernevæv ved at placere hjernen derefter i forskellige gradienter af saccharose: 2 timer i 5% saccharose i PBS, 2 timer i 10% sucrose i PBS natten over i 20% saccharose i PBS.
4. Fryse hjernevæv med væske nitrogen og opbevares vævet ved -80 ° C indtil sektionering.
5. Sektion af hjernevæv med 10 um tykke snit under anvendelse af en kryostat.
6. Skærmen ufarvede kryosektioner for blå fluorescens fra GB MPIO partikler og grøn fluorescens fra EGFP-udtrykkende celler under anvendelse af et fluorescensmikroskop.
7. Screen ufarvet kryosnit forgrøn / rød baggrund fluorescens fra inflammatoriske celler.
8. Udføre yderligere immunohistokemiske og immunofluorescens farvninger identificere endogene cellepopulationer (f.eks microglia, astrocytter og T-celler, ...) vekselvirker med cellulære transplantater.

6. Repræsentative resultater

Vi her visuelt præsenteret en optimeret sekvens af begivenheder for en vellykket multimodal billeddannelse af luciferase / EGFP der udtrykker (STEM) cellepopulationer i CNS hos mus. Først ved anvendelse af de beskrevne GB MPIO mærkning procedure resulterer i højeffektive mærkning af BMSC-Luc/eGFP celler, som let kan valideres fluorescensmikroskopi (Figur 2A). Dernæst ved podning af GB MPIO mærket BMSC-Luc/eGFP i CNS hos mus kan overlevelse af cellulære transplantat overvåges ved in vivo BLI baseret på luciferase-aktivitet (figur 2B). Desuden kan den nøjagtige lokalisering af transplanterede celler overvåges ved in vivo (figur 2C). Endelig histologisk analyse tillader validering af resultaterne opnået ved BLI og MRI. Stabil overlevelse blev bekræftet ved en stabil EGFP ekspression i tid (figur 2D). Til dette-EGFP udtrykker colokalisering af celler med blåt fluorescerende MPIO giver mulighed for nøjagtig bestemmelse af lokalisering og overlevelse af transplanterede celler. Desuden reducerer denne dobbelte fluorescerende mærkning af stamcellerne mulighed for at observere falske positive resultater på basis af baggrundsfluorescens lavet af inflammatoriske celler ^5.

Figur 1. Oversigt over behandlingen sekvensen

1. Cellemærkning: BMSC-Luc/eGFP er mærket med 5 x 10 ⁶ GB MPIO partikler pr ml dyrkningsmedium. Efter 16 timers inkubation, og en efterfølgende hvileperiode på 24 timer, høstes cellerne forintracerebral implantation.
2. Cell implantation: GB MPIO mærket BMSC-Luc/eGFP podes i musehjerne på følgende koordinater: bregma -2 mm, 2 mm lige fra midterlinjen og 2 mm under dura.
3. In vivo BLI: Efter intravenøs indgivelse af 150 mg D-luciferin/kg legemsvægt blev genererede lys opnået løbet af 5 minutter under anvendelse af Photon Imager.
4. In vivo MRI: Et sæt af 10 koronale T2-vægtede spin-ekko (SE) billeder og T2 *-vægtede gradient-ekko (GE) billeder med en in-plan opløsning på 70 um ² blev erhvervet. Sequence parametre var som følger: gentagelse tid (TR): 500 ms, ekkotid (TE): 8 ms (GE sekvens) og gentagelse tid (TR): 4200 ms, ekkotid (TE): 12,16 ms (SE sekvens); synsfelt (FOV): 18x18 ^mm2, matrix: 256x256, 1 mm skivetykkelse og 1 mm skive separation.
5. Post-mortem histologi: 10 um tyk kryosektion blev screenet for EGFP ekspression og blå fluorescens-mærket BMSC usynge en fluorescens mikroskop.

Figur 2. Multimodal billeder af stamceller grafts

1. Direkte immunfluorescensmikroskopi af Glacial blå (DK) MPIO mærket BMSC-Luc/eGFP.
2. In vivo BLI af mus injiceret med 4x10 ⁵ GB MPIO mærket BMSC-Luc/eGFP celler i uge 1 og uge 2 efter implantation. Statistisk analyse af opdagede BLI signaler i uge 1 og uge 2 post-implantation. Data er udtrykt som gennemsnitligt antal fotoner per sekund per steradian per kvadratcentimeter (pH / s / SR / cm ²⁾ fra en 5 minutters periode + / - standard error beregnet ud fra en fast område af interesse i mus, der udviser en tydelig BLI signal på injektionsstedet.
3. Koronale todimensional MRI i GB MPIO mærket BMSC-Luc/eGFP (venstre panel: (i) T2-vægtet spin-ekko billede og (ii) T2 *-vægtet gradient-ekko billede) og umærket BMSC-LUC / EGFP (højre panel: (iii) T2-vægtet spin-ekko billede og (vi) T2 *-vægtet gradient-ekko billede) transplantater i musehjerne.
4. Histologisk analyse af GB MPIO mærket BMSC-Luc/eGFP implantater i uge 2 post-implantation. (I) direkte immunofluorescens-analyse for lokalisering af EGFP-udtrykkende og GB MPIO mærkede BMSC-Luc/eGFP transplantater. (Ii) Stor forstørrelse detalje af (i). (Iii) immunfluorescensfarvning for GFAP antigen, hvilket indikerer udvikling af astrocytisk arvæv i omkredsen af ​​GB MPIO mærket BMSC-Luc/eGFP. (Vi) immunofluorescensmærkning for Iba-1-antigen, med angivelse af invasionen og de omkringliggende af GB MPIO mærket BMSC-Luc/eGFP af mikroglia.

Discussion

I denne rapport beskriver vi en optimeret protokol til en kombination af tre komplementære billeddiagnostiske metoder (BLI, MRI og histologi) for detaljeret karakterisering af cellulære implantater i CNS i immunkompetente mus. En kombination af reportergen mærkning af celler, baseret på genetisk modifikation med reportergener ildflueluciferase og EGFP og en direkte cellemærkning med GB MPIO, fører til en nøjagtig vurdering af stamceller transplantater in vivo.

For partikel mærkning af BMSC er GB MPIO partikelstørrelse (1.63μm) i kombination med anioniske overfladeaktive (carboxyl substitutter) foreslog at lette endocytotisk optagelse af disse partikler af ikke-fagocytiske celler ^16-18. Imidlertid skal det nævnes, at inkubationstiden for at opnå høj mærkning effektivitet celletype afhængig. For eksempel er fagocytceller (såsom makrofager og dendritiske celler) kan internalisere disse partikler hurtigere (inkubationstid på 0,5 - 1 time) sammenlignet med ikke-phaghocytic celletyper (f.eks BMSC eller neurale stamceller), som har brug for en inkubationstid på mindst 16 timer for effektiv mærkning. Dette skal tages i betragtning, mens de udfører cellemærkning eksperimenter og effektivitet mærkning bør altid bestemmes på forhånd ved hjælp af fluorescens mikroskopi og / eller flowcytometrisk analyse. Som mærkning af cellepopulationer med GB MPIOs ikke påvirker cellelevedygtighed, celleproliferation eller cellefænotype ^5, kombinationen af jernoxid og en fluorofor i disse partikler skaber derfor en ideel mulighed for at visualisere dem begge med MRI og optisk billeddannelse. Som følge af det høje jernindhold og stor partikelstørrelse, kan MPIO partikler anvendes til enkelt-celle ^12,19,20 og enkelt partikel billeddannelse ²¹ ved hjælp af MRI. Dette er yderst interessant, når det kommer til at studere cellemigrering som enkelte celler kan observeres. Det høje jernindhold af den anvendte GB MPIOPartiklerne har også visse ulemper, når der sigtes for at afgrænse den nøjagtige størrelse af implantatet site ved MRI. Den meget høje jernindhold MPIOs skaber ikke blot magnetiske inhomogeniteter på implantatstedet, men også i omkredsen af ​​det cellulære implantatet, hvilket resulterer i en overestimering af implantatstedet volumen og en mindre nøjagtig diskriminering mellem implanterede celler og det omgivende væv. Følgelig type partikel, der er nødvendige for cellemærkning, vil afhænge af studie. Når det formål at bestemme stamcelle migration en meget høj følsomhed og dermed en høj jern indeholdende MPIOs vil være nødvendig. På den anden side kan, når der sigtes til nøjagtig lokalisering af stamceller transplantater, mindre SPIOs med et lavere indhold af jern være et foretrukket alternativ ^22. Desuden jernpartikler generere negativ kontrast indføre et andet problem vedrørende forskelsbehandling af implanterede celler og blødning efter celle transplantation. Derfor er en masse forskning der foregårvidere mod anvendelse af positive kontrastmidler til cellemærkning. Siden af ​​partiklen type, typen af ​​sekvensen, der anvendes til MRI-indfangningssystemet afhænger også formålet med undersøgelsen. Når MR bruges til at afgrænse implantatet at indhente nøjagtige oplysninger om placeringen af ​​implantatet og implantatet volumen, T2 sekvens (spin-ekko) er positiv, da det giver anatomiske oplysninger med stor nøjagtighed. På den anden side er T2 *-sekvensen (gradient-ekko) en sekvens, der anvendes til at undersøge mulig migrering af transplanterede celler, som denne sekvens tager hensyn til alle inhomogenities af magnetfeltet gør en højere følsomhed over for forbindelser, der påvirker magnetfelt. Denne sekvens er absolut nødvendigt, når det kommer til detektering af en lille mængde af celler, der kunne have migreret af den implanterede region. Ved hjælp af denne sekvens var vi i stand til at konkludere, at BMSC-Luc/eGFP celler ikke migrere efter striatale implantation i CNS hos mus.

MensMR leverer data vedrørende celle implantat lokalisering, yderligere BLI Analysen giver data om celle implantat overlevelse ^2,4,11. Den enzymatiske reaktion mellem luciferase enzymet og substratet luciferin behov for tilstedeværelsen _af O2 og ATP, er en pålidelig teknik til at undersøge celleoverlevelse. Nekrotiske celler ikke udtrykker luciferase enzymet og ikke _O2 og ATP vil være til stede. Desuden er det kun celler, der udtrykker luciferaseenzymet er i stand til at katalysere reaktionen, hvilket resulterer i produktion af lys, som ligner den høje følsomhed af teknikken. BLI kan udføres på en kvantitativ måde, fordi mængden af ​​produceret lys er proportional med mængden af ​​luciferase-udtrykkende celler. Imidlertid vigtige overvejelser skal tages i betragtning under udførelse BLI kvantitativt som adskillige andre faktorer end celle mængder kan påvirke ekspressionsniveauet af luciferase eller mængden af ​​detekteret lys. For eksempel anesthesiet niveau kan påvirke luciferaseenzymet og / eller luciferin tilgængeligheden ^23, forskellige faktorer og forbindelser kan påvirke substratet tilgængelighed og / eller optagelse ^24-26 eller promotor-aktivitet ^27-30, hvilket resulterer i forskelle i signalet. Endvidere anvendelsen af ​​BLI er begrænset til små dyr teknikken er begrænset til lave vævspenetration af lys. Følgelig, når det formål at udføre kvantitative BLI opfølgning celleoverlevelse efter transplantation, er alle parametre eventuelt påvirke signal variationer skal holdes så standard som muligt. For eksempel implantation dybde cellulære transplantater, anæstesi niveau og indgivelsesvej / mængde af substratet administreres før BLI erhvervelse, passende skær af dyrets hud, etc.

Under hensyntagen til ovenstående beskrevne fordele og ulemper ved molekylær billeddannelse, de opnåede resultater altid skal godkendes af histologisk analyse. Herved varioos cellulære fænotyper og cellulære interaktioner mellem forskellige celletyper, der kan visualiseres med størst følsomhed post mortem. Til trods for at denne teknik er valideringsværktøjet foretrukne, tilstedeværelsen af ​​baggrundsfluorescens skabt af inflammatoriske celler, der omgiver og / eller invadere implantatet stedet skal overvejes, da dette kan føre til falske positive resultater. Imidlertid er anvendelsen af ​​en dobbelt mærkning med en fluorescerende reporter-gen, såsom EGFP og en fluorescerende probe, såsom GB MPIO, reducerer muligheden for fejlagtig identifikation (dvs. transplanterede celler bør vise både specifikke fluorescenser, uden at vise baggrundsfluorescens i irrelevant lys kanaler).

Opsummerer, medens BLI er en unik metode til at overvåge celleoverlevelse i tid på en kvantitativ måde med meget høj følsomhed, men lav opløsning, MRI er en teknik valg at overvinde den lave opløsning, der opnås med BLI. Kombinationen af disse in vivo tekniskepågældende gør tilstrækkelige information om overlevelse og lokalisering af transplanterede celler in vivo i en ikke-invasiv måde. Endelig kan cellulære podede interaktioner med omgivende væv og / eller endogene inflammatoriske celler let overvåges post mortem hjælp histologi. Selv i øjeblikket, vil disse stadig skal gøres ved histologisk analyse, vil de vigtigste udfordringer for fremtiden være at forbedre de eksisterende in vivo molekylær billeddannelse metoder at give real-time vurdering af de parametre, med lignende opløsning og følsomhed, som opnås ved hjælp af histologisk analyse.