Мультимодальные изображений имплантации стволовых клеток в центральной нервной системе мышей

Summary

В этой статье описываются оптимизированные последовательности событий для мультимодальных изображений клеточных трансплантатов у грызунов мозга с помощью: (I) в естественных условиях биолюминесценции и магнитно-резонансной томографии, и (II) после смерти гистологический анализ. Сочетание этих условий изображение на одного животного позволяет сотовой трансплантата оценки с высоким разрешением, чувствительностью и специфичностью.

Protocol

1. Сотовые подготовка

1. Эксперимент следует начать использование бывших естественных культурных стволовых клеточных популяций генетически модифицированных выразить люциферазы и белков EGFP репортера. Здесь мы используем люциферазы / EGFP экспрессией мышиных костномозгового происхождения стромальных клеток (BMSC-Luc/eGFP), как описано выше по Bergwerf соавт. ^{2, 5.}
2. За два дня до мечения клеток, клетки пластины BMSC-Luc/eGFP при плотности 8 х 10 ⁵ клеток на T75 культуры фляги в 15 мл полной среды расширения (CEM) с добавлением 1 мкг / мл Puromycine.
3. Позвольте клеткам расти в течение 48 часов при температуре 37 ° С и 5% CO _2.
4. Добавить 5 х 10 ⁶ Ледниковый Синий микронных размеров частиц оксида железа (GB MPIO) на мл культуральной среды на растущий культуре клеток (всего: 75 х 10 ⁶ частиц на 15 мл культуральной среды в колбе T75 культуры).
5. Выдержите в течение 16 часов, чтобы частица поглощения через эндоцитоза.
6. Смыть оставшиеся частицыи позволяет клеткам расти в течение еще 24 часов, чтобы получить клетки слияния и равномерное распределение Гб MPIO.
7. Проверить визуально поглощения частиц с помощью флуоресцентной микроскопии путем подсчета соотношения EGFP + и ГБ MPIO + клеток в общей сумме EGFP + клеток.
8. Wash Гб MPIO-меченых клеток BMSC-Luc/eGFP два раза по 10 мл PBS и урожай клеток после трипсин-EDTA лечение (5 мл на T75 культуры колбу в течение 5 минут).
9. Вымойте собранных клеток и ресуспендируют в конечной концентрации 133 х 10 ⁶ клеток / мл в PBS.
10. Держите клеток на льду до трансплантации.

2. Сотовые имплантации в ЦНС мышей

1. Анестезировать мышей внутрибрюшинного введения кетамина (80 мг / кг) + ксилазина (16 мг / кг) смеси.
2. Подождите 5 минут, чтобы мыши, чтобы заснуть.
3. Бритье головы мыши для обеспечения стерильных манипуляций.
4. Наведите в стереотаксической раме.
5. Desinfectкожа и влажные глаза мышей, чтобы предотвратить обезвоживание.
6. Сделайте срединный разрез кожи головы, чтобы выставить череп, и просверлить отверстие в черепе помощью бормашины грата в заданные координаты: 2 мм задний и 2 мм боковой брегмы.
7. Vortex клеточной суспензии кратко и аспирации суспензии клеток в шприце.
8. Поместите шприц иглой на глубину 2,5 мм под твердой мозговой оболочкой и позволяют давления равновесие в течение 1 минуты.
9. Вводите 3 мкл клеточной суспензии (4 х 10 ⁵ клеток) на глубину 2 мм под твердой мозговой оболочкой и при скорости 0,70 мкл / мин с использованием автоматизированных микро-топливного насоса.
10. Подождите еще 5 минут для предотвращения обратного потока вводили суспензию клеток.
11. Медленно отведите иглы и дезинфицируют кожу границы до сшивания кожи.
12. Вводите 300 мкл 0,9% NaCl раствора подкожно, чтобы предотвратить обезвоживание и поместите курсор под нагрева лампы, чтобы оправиться от наркоза. Администрирование рОст-оперативная анальгетик в соответствии с институциональными нормами.

3. В естественных условиях Биолюминесценция

1. Анестезировать мышей смесью 3% изофлуран и кислорода.
2. Поместите мышь в Фотон Imager и снизить уровень анестезии до 1,5%, ИФ и кислорода.
3. Вводите 150 мг D-люциферин на кг массы тела внутривенно.
4. Получить изображение в течение 5 минут с помощью программного обеспечения фотографии Vision.
5. Выполните обработку изображений помощью M3vision программного обеспечения. Количественная наблюдаемого сигнала с использованием основных регионах, представляющих интерес.

4. В естественных условиях Магнитно-резонансная томография

1. Анестезировать мышей с 3% изофлуран в смеси O _2: N ₂ O (3:7).
2. Поместите мышь в фиксатор горизонтальной системе 9.4T МР и снизить уровень анестезии до 1% изофлуран в смеси O _2: N ₂ O (3:7).
3. Влажные глаза мышей для предотвращения обезвоживанияТион, приложите ректального датчика для контроля температуры тела и контролировать частоту дыхания, поставив под датчик мыши живота.
4. Поддержание дыхания при 110 ± 10 вдохов в минуту и ​​поддерживать температуру тела постоянной в пределах узкого диапазона 37 ± 0,5 ° С.
5. Поместите катушку поверхность РФ на верхней части головы мыши и положение мыши в центре магнита.
6. Приобрести набор из 10 корональных T2-спиновое эхо (SE) изображения для получения конкретной анатомической информации и Т2 *-взвешенных градиент эхо (GE) изображений с целью изучения миграции стволовых клеток с в плоскости разрешением 70 мкм ^2. Установить последовательность параметры следующим образом: время повторения (TR): 500 мс, время эхо (TE): 8 мс (GE последовательности) и время повторения (TR): 4200 мс, время эхо (TE): 12.16 мс (SE последовательности); поле зрения (FOV): 18x18 мм ^2, матрица: 256x256, 1 мм толщиной среза и 1 мм разделение часть (5,1 Paravision программного обеспечения).
7. Выполните обработки данныхиспользование Amira 4.0.

5. Post Mortem гистологии

1. Анестезировать мышей очень глубоко при вдыхании isofluorane (4%), кислорода (0,5 л / мин) и азота (1 л / мин) смесь в течение 2 минут. Жертвоприношение мышей шейки дислокации.
2. Удалить мозга мышей от черепа и фиксировать ткани головного мозга в 4% параформальдегида в PBS в течение 2 часов.
3. Высушить ткани мозга путем размещения головного мозга в дальнейшем в различных градиентах сахарозы: 2 часа в 5% сахарозы в PBS, 2 часа в 10% сахарозы в PBS в течение ночи на 20% сахарозы в PBS.
4. Замораживание ткани мозга использованием жидкого азота и хранения ткани при температуре -80 ° C до секционирования.
5. Раздел ткани головного мозга в 10 мкм разделам помощи криостата.
6. Экран незапятнанный cryosections для голубой флуоресценции от ГБ частиц MPIO и зеленая флуоресценция от EGFP выражение клеток с помощью флуоресцентного микроскопа.
7. Экран незапятнанный cryosections длязеленый / красный фоновой флуоресценции из воспалительных клеток.
8. Выполните дальнейшие иммуногистохимического и иммунофлуоресцентного окрашивания для выявления эндогенных клеточных популяций (например, микроглии, астроцитов, Т-клетки, ...) во взаимодействии с клеточными трансплантатами.

6. Представитель Результаты

Мы здесь визуально представлена ​​оптимизированная последовательность событий для успешного мультимодальных изображений люциферазы / EGFP экспрессией (стволовые) клетки населения в центральной нервной системе мышей. Сначала описаны Гб MPIO маркировки процедура приводит к высокоэффективным маркировки BMSC-Luc/eGFP клетки, которые могут быть легко проверены с помощью флуоресцентной микроскопии (рис. 2A). Далее, после прививки Гб MPIO помечены BMSC-Luc/eGFP в ЦНС мышей, выживание сотовой трансплантат может контролироваться в естественных условиях BLI основаны на активности люциферазы (рис. 2В). Кроме того, точная локализация трансплантированных клеток могут быть проверены в естественных условиях (рис. 2). Наконец, гистологический анализ позволяет подтверждения результатов, полученных BLI и МРТ. Стабильный выживание было подтверждено стабильной выражение EGFP во времени (рис. 2D). Для этого колокализации EGFP-экспрессирующие клетки с голубыми флуоресцентными MPIO позволяет для точного определения локализации и выживанию трансплантированных клеток. Кроме того, этот двойной флуоресцентные маркировки стволовых клеток снижает возможность наблюдать ложные положительные результаты, основанные на фоновой флуоресценции созданные воспалительных клеток ^5.

Рисунок 1. Обзор обработки последовательности

1. Сотовые маркировки: BMSC-Luc/eGFP помечены 5 х 10 ⁶ Гб частиц MPIO в культуральной среде мл. После 16 часов инкубации и следующий период отдыха 24 часа в сутки, клетки собирают длявнутримозговой имплантации.
2. Сотовые имплантации: GB MPIO помечены BMSC-Luc/eGFP привиты в мозг мыши на следующие координаты: брегмы 2 мм, 2 мм вправо от средней линии и 2 мм под твердой мозговой оболочкой.
3. В естественных условиях BLI: после внутривенного введения 150 мг D-luciferin/kg массы тела, созданные свет был приобретен в течение 5 минут с помощью фотонов Imager.
4. В естественных условиях МРТ: набор из 10 корональных T2-спиновое эхо (SE), изображения и Т2 *-взвешенных градиент эхо (GE) изображения в плоскости разрешением 70 мкм ² были приобретены. Последовательность параметров были следующими: время повторения (TR): 500 мс, время эхо (TE): 8 мс (GE последовательности) и время повторения (TR): 4200 мс, время эхо (TE): 12.16 мс (SE последовательности); поле зрения (FOV): 18x18 мм ^2, матрица: 256x256, 1 мм толщиной среза и 1 мм разделение срез.
5. Посмертные гистология: 10 мкм толстый cryosection были обследованы на EGFP выражения и синий флуоресцентно меченных СККМ упеть флуоресцентного микроскопа.

Рисунок 2. Мультимодальные визуализации трансплантатов стволовых клеток

1. Прямая иммунофлюоресценция микроскопии Ледниковый синий (GB) MPIO помечены BMSC-Luc/eGFP.
2. В естественных условиях BLI мышей вводили 4x10 ⁵ Гб MPIO помечены BMSC-Luc/eGFP клеток в неделю 1 неделя 2 после имплантации. Статистический анализ обнаруженных сигналов BLI в неделю 1 неделя 2 после имплантации. Данные представлены как среднее число фотонов в секунду на стерадиан на квадратный сантиметр (тел / с / ср / см ²⁾ с 5-минутный период времени + / - стандартная ошибка рассчитывается из фиксированной области интереса у мышей показывает четкий сигнал BLI в месте инъекции.
3. Корональные двумерных МРТ Гб MPIO помечены BMSC-Luc/eGFP (левая панель: (I), Т2-взвешенные изображения спин эхо и (II), Т2 *-взвешенных градиент эхо изображения) и немеченого СККМ-LUC / EGFP (справа: (III), Т2-взвешенные изображения спин эхо и (VI), Т2 *-взвешенных градиент эхо изображение) трансплантатов в мозге мыши.
4. Гистологический анализ Гб MPIO помечены BMSC-Luc/eGFP имплантатов в неделю 2 после имплантации. (Я) прямой иммунофлюоресценции анализа для локализации EGFP-выражения и ГБ MPIO помечены трансплантатов BMSC-Luc/eGFP. (II) Высокая детализация увеличением (г). (III) иммунофлуоресцентного окрашивания на GFAP антигена, что указывает на развитие астроцитарных рубцовой ткани в окружении Гб MPIO помечены BMSC-Luc/eGFP. (VI) иммунофлуоресцентного окрашивания для МБА-1 антиген, что свидетельствует о вторжении и окружающих ГБ MPIO помечены BMSC-Luc/eGFP по микроглии.

Discussion

В этом докладе мы описываем оптимизированный протокол для комбинации из трех дополнительных методов визуализации (BLI, МРТ и гистология) подробные характеристики клеточных имплантантов в ЦНС иммунокомпетентных мышей. Сочетание гена-репортера маркировки клеток, основанный на генетической модификации с корреспондентом гена люциферазы светляков и EGFP и прямой маркировки ячейки с ГБ MPIO, приводит к точной оценке трансплантатов стволовых клеток в живом организме.

Для частиц маркировки СККМ, частица Гб MPIO размера (1.63μm) в сочетании с анионными поверхности (карбоксильных заменителей) предлагается облегчить внутриклеточных поглощение этих частиц не-фагоциты ^16-18. Тем не менее, необходимо отметить, что инкубационный период для получения высокой эффективности маркировки типа клеток зависит. Например, фагоцитирующих клеток (например, макрофаги и дендритные клетки) способны усвоить эти частицы быстрее (Инкубационный период от 0,5 - 1 час) по сравнению с не-phaghocytic типах клеток (например, СККМ или нервные стволовые клетки), которые нуждаются в инкубационный период от менее 16 часов для эффективной маркировки. Это необходимо учитывать при проведении экспериментов мечения клеток и эффективность маркировки всегда должны быть определены заранее с помощью флуоресцентной микроскопии и / или проточной цитометрии. Как маркировка клеточных популяций с ГБ MPIOs не влияет на жизнеспособность клеток, клеточной пролиферации или клеточный фенотип ^5, сочетание оксида железа и флуорофор в этих частицах, следовательно, создает идеальную возможность визуализировать их как МРТ и оптических изображений. Кроме того, из-за высокого содержания железа и большим размером частиц, MPIO частицы могут быть использованы для одной ячейки ^12,19,20 и одного изображения частиц ²¹ на МРТ. Это очень интересно, когда дело доходит до изучения миграции клеток, как отдельных клеток можно наблюдать. Тем не менее, высокое содержание железа использовались Гб MPIOчастиц также имеет определенные недостатки, когда мы стремимся, чтобы обозначить точный размер трансплантата сайта с помощью МРТ. Очень высокий содержанием железа MPIOs не только создает магнитные неоднородности в месте имплантации, но и в окружающих клеточного имплантанта, в результате завышения объема имплантата и менее точные различия между имплантировали клетки и окружающие ткани. Следовательно, тип частиц, необходимых для мечения клеток, будет зависеть от дизайна исследования. Когда с целью определения стволовых клеток, миграции, очень высокую чувствительность и, следовательно, высоким содержанием железа содержащих MPIOs будет необходимо. С другой стороны, когда стремится к точной локализации стволовых клеток трансплантата, меньше SPIOs с меньшим содержанием железа может быть предпочтительной альтернативой ^22. Кроме того, частицы железа вызывают отрицательные отличие введения еще одной проблемой, касающиеся различий между имплантированными клетками и кровотечение после пересадки клетки. Поэтому многие исследования будетна к использованию положительных контрастных агентов для мечения клеток. Рядом с частицей тип, тип последовательности используются для приобретения МРТ также зависит от цели исследования. При МРТ используется для разграничения имплантатов для получения точной информации о расположении имплантатов и имплантатов объемом, T2 последовательности (спиновое эхо) является благоприятным, поскольку он обеспечивает анатомическую информацию с высокой точностью. С другой стороны, T2 * последовательности (градиент эхо) представляет собой последовательность используется для изучения возможной миграции трансплантированных клеток, как эта последовательность учитывает все неоднородностей магнитного поля, оказание более высокую чувствительность к соединениям, влияющие на магнитное поле. Эта последовательность является абсолютно необходимым, когда речь идет об обнаружении небольшого количества клеток, которые могут мигрировать из имплантированных региона. Используя эту последовательность, мы смогли сделать вывод, что BMSC-Luc/eGFP клетки не мигрируют через полосатой имплантации в ЦНС мышей.

В то время какМРТ позволяет получать данные о ячейке локализации имплантата, дополнительный анализ BLI предоставляет данные о ячейке имплантата выживания ^2,4,11. Как ферментативной реакции люциферазы фермента и субстрата люциферин нуждается в присутствии O ₂ и СПС, это надежный способ изучить выживаемость клеток. Отмершие клетки не будут выражать люциферазы фермента и не O ₂ и СПС будет присутствовать. Более того, только клетки, экспрессирующие люциферазы фермента способны катализировать реакцию, в результате чего производство легких, который напоминает о высокой чувствительности метода. BLI могут быть выполнены в количественном выражении, так как количество производимого света пропорционально с количеством люциферазы экспрессирующих клеток. Тем не менее, важные соображения должны быть приняты во внимание при выполнении BLI количественно несколькими факторами, кроме количества клетки могут влиять на уровень экспрессии люциферазы или количество обнаруженных света. Например, anesthesiуровень может влиять на люциферазы фермента и / или наличие люциферин ²³ различных факторов и соединения могут влиять на доступность субстрата и / или поглощения ^24-26 или ^27-30 промоутер деятельности, в результате различий в выходной сигнал. Кроме того, использование BLI ограничивается мелкими животными, как метод ограничен низким уровнем проникновения ткани легких. Поэтому, когда с целью выполнения количественных BLI следить за выживание клеток после трансплантации, все параметры, влияющие возможно сигнал изменения должны быть сохранены как стандартные сроки. Например, имплантация глубине клеточного трансплантата, анестезия уровень и управление маршрут / количество субстрата вводить до приобретения BLI, правильное бритье кожи животного, и т.д.

Принимая во внимание описанные выше преимущества и недостатки молекулярной визуализации, полученные результаты всегда должны быть проверены на гистологический анализ. Настоящим варионам сотовой фенотипа и клеточных взаимодействий между различными типами клеток могут быть визуализированы с высокой чувствительностью после смерти. Несмотря на то, что этот метод проверки инструмент выбора, наличие фоновой флуоресценции созданные воспалительных клеток, окружающих и / или вторжения трансплантата сайт должен быть рассмотрен, так как это может привести к ложным положительным результатам. Тем не менее, использование двойной маркировки с люминесцентными гена-репортера, таких как EGFP и флуоресцентного зонда, такие, как GB MPIO, снижает возможность ошибочного (т.е. трансплантированных клеток должен отображать как конкретные флуоресценции, без отображения фоновой флуоресценции в свете не имеет значения каналов).

Подводя итоги, а BLI является уникальной техникой для контроля выживаемости клеток во времени в количественном выражении с очень высокой чувствительностью, но с низким разрешением, МРТ является методом выбора для преодоления низкого разрешения, полученных с BLI. Сочетание этих в естественных условиях техническивопрос оказывает достаточной информации о выживании и локализации трансплантированных клеток в естественных условиях в неинвазивным способом. Наконец, сотовые взаимодействия трансплантата с окружающими тканями и / или эндогенных воспалительных клеток может легко контролироваться после смерти использованием гистологии. Хотя, на данный момент, последняя все еще ​​должно быть сделано на гистологический анализ, основные задачи на будущее будет заключаться в улучшении существующих в естественных условиях молекулярной визуализации, чтобы в режиме реального времени оценить параметры с аналогичным разрешением и чувствительностью, полученные с помощью гистологический анализ.