1. Sonda di progettazione Design anti-senso DNA piastrellatura sonde per il recupero selettivo di RNA bersaglio CHIRP. Progettazione anti-senso sonde oligo con il progettista in linea sonda singlemoleculefish.com 18. Utilizzare questi parametri: numero di sonde sonda = 1/100 bp di lunghezza RNA, 2) sulla destinazione GC = 45; 3) la durata oligonucleotide = 20; 4) Lunghezza distanza = 60-80. Rompere RNA in segmenti, se troppo a lungo per il progettista. Omettere regioni di ripetizioni o di una ampia omologia. Ordina anti-senso sonde di DNA con BiotinTEG a 3-prime. Sonde etichetta secondo le loro posizioni lungo l'RNA. Separarli in due gruppi in modo che il pool di "anche" contiene tutte le sonde di numerazione 2, 4, 6, ecc e la piscina "dispari" contiene sonde di numerazione 1, 3, 5, ecc Diluire pool di sonde a 100 micrometri e la concentrazione conservare a -20 ° C. Tutti gli esperimenti devono essere eseguite usandoentrambe le piscine, che servono come controlli interni per l'altro. Reale RNA-dipendente segnale sarebbe presente da entrambe le piscine, mentre la sonda specifici rumori sarebbe unico per ogni pool. Questo vale sia per CHIRP-qPCR e CHIRP-seq. 2. Raccogliere cellule Raccogliere cellule che verranno utilizzati per l'esperimento CHIRP. Coltivare cellule in piastre di coltura di tessuto o di palloni confluenza. Risciacquo con tampone fosfato salino (PBS) e una volta Tripsinizzare. Quench tripsina con volume> 2x dei mezzi di comunicazione, pipetta su e giù per staccare le cellule e risospendere in sospensione singola cella. Trasferire tutti i media e le cellule risospese in 50 ml provette Falcon. 20 milioni di cellule sono in genere sufficienti per un campione CHIRP. Spin cellule a 800RCF per 4 min. Aspirare il terreno e risospendere 40 milioni di cellule in 40 ml di PBS, unire tubi se necessario. Spin cellule a 800RCF per 4 min. Decantare PBS, aspirare accuratamente in un angolo il liquido rimanente. </ol> 3. Cross-Link Cells e raccogliere pellet cellulare Crosslink raccolte le cellule con glutaraldeide per preservare le interazioni RNA-cromatina e preparare pellet di cellule. Eseguire tutti i passaggi a temperatura ambiente. Preparare glutaraldeide 1% in PBS temperatura ambiente. Preparare 10 ml per 10 milioni di cellule (0,4 mL magazzino glutaraldeide 25% + 9,6 mL PBS). Glutaraldeide deve essere usato fresco. Toccare fondo di tubi Falcon per rimuovere pellets. Risospendere il pellet cellulare in 1% glutaraldeide, a partire da un piccolo volume per evitare blocchi, poi ricaricare fino a tutto volume. Capovolgere. Crosslink per 10 minuti a temperatura ambiente su un end-to-end shaker o dei rotatori. Raffreddare bruscamente la reazione di reticolazione con volume 1/10th di 1,25 M glicina a temperatura ambiente per 5 min. Spin a 2000RCF per 5 min. Aspirare il surnatante e pellet lavaggio con 20 mL PBS volta raffreddato, filatura a 2000RCF per 5 min. Aspirare e risospendere il wincenerito, cross-linked pellet con 1 ml di PBS refrigerata per 20 milioni di cellule. Trasferire ogni ml di una provetta Eppendorf e centrifugare a 2000RCF per 3 min a 4 ° C. Rimuovere il più possibile con PBS punta della pipetta accuratamente. Flash-congelare i pellet cellulari in azoto liquido e conservare a -80 ° C a tempo indeterminato. 4. Lisi cellulare Lisare cellule reticolati per preparare lisato cellulare. Scongelare pellet cellulari surgelati a temperatura ambiente. Toccare difficili da rimuovere e miscelare il pellet di cellule. Rallenta il pellet a 2000RCF per 3 min a 4 ° C. Utilizzare una forte punta di 10 microlitri pipetta per rimuovere ogni residuo PBS. Su una bilancia elettronica (precisione di 1mg) tarare la massa di un tubo vuoto Eppendorf (i nostri tubi pesano 1.060 grammi molto coerente). Pesare ciascuna pellet e registrare il suo peso. Un piatto completo di 15 cm di cellule HeLa reticolati pesa in genere 100 mg. Supplemento Lysis Buffer (10 volte la massa di pellet, ad esempio, 1 ml per 100 mg) con Fresh inibitore della proteasi, PMSF e Superase-in (vedi elenco allegato buffer). Mescolare bene. Aggiungi 10X tampone di lisi del volume integrata in ogni provetta e risospendere il pellet. Per le piccole palline <25 mg, risospendere in 250 microlitri di buffer di lisi integrato. Sospensione deve essere liscia. In caso contrario, dividere la sospensione in 500 pl aliquote e utilizzare un mixer motorizzato pellet per rompere grumi. Procedere immediatamente a sonicazione. 5. Sonicazione Shear DNA da lisati cellulari sonicazione reticolati. Sonicare lisato cellulare in Bioruptor in 15 ml provette Falcon. Utilizzare <1,5 ml di lisato in ciascuna provetta, e per una più rapida sonicazione, sonicare non più di due tubi per volta. Sottoporre ad ultrasuoni in un bagno di acqua 4 ° C alla massima impostazione con 30 secondi, 45 secondi OFF intervalli di impulso. Controllare lisato ogni 30 min. Continuare sonicazione finché il lisato cellulare è più torbida. Questa operazione potrebbe richiedere un minimo di 30 min e fino a 4 ore. Il numerodi tubi, il volume del campione, la temperatura del bagno, e il periodo di tempo sonicazione che influenzano la durata del processo richiede. Tubi probabilmente ultrasuoni a velocità differenti, in modo da mettere in comune tra loro ogni 30 min e ridistribuire in tubi originali per assicurare l'omogeneità. Nota: glutaraldeide-reticolato cellule richiedere molto più tempo per sonicare equivalenti di formaldeide. Quando lisato diventa chiaro, cedere il 5 ul lisato in una nuova provetta Eppendorf. Aggiungere 90 ul DNA proteasi K (PK) Buffer (vedi elenco buffer) e 5 PK ul. Vortex per miscelare e centrifugare brevemente. Incubare per 45 min a 50 ° C. Estrarre DNA con il kit di purificazione PCR Qiagen. DNA Eluire in 30 microlitri Buffer Elution Qiagen (EB) e controllare le dimensioni del DNA su gel di agarosio 1%. Se massa della striscio DNA è 100-500 bp, sonicazione è completa. In caso contrario, continuano ad ultrasuoni. Centrifugare i campioni sonicati a 16100RCF per 10 minuti a 4 ° C. Combina surnatanti, le aliquote in 1 ml di campioni e flash-congelamento in azoto, liquidon. Conservare a -80 ° C. 6. CHIRP Ibridano sonde di DNA a RNA biotinilati e isolare cromatina legata. Scongelare i tubi della cromatina a temperatura ambiente. Preparare il tampone di ibridazione (vedi elenco buffer, preparare 2 ml per ml della cromatina). Vortex per mescolare. Per un esempio tipico CHIRP utilizzando 1 ml di lisato, 10 L per rimuovere INPUT RNA e 10 L per INPUT DNA e posto in provette Eppendorf. Tenere in ghiaccio fino al successivo utilizzo. Trasferire 1 cromatina mL a 15 mL provetta Falcon. Aggiungere 2 Tampone di ibridazione mL in ciascun tubo. Per volume totale <1,5 ml, utilizzare provette Eppendorf. Scongelare sonde a temperatura ambiente. NanoDrop sonde per controllare importo, se non lo avete utilizzato in un tempo lungo (100 sonde pM dovrebbe spec ~ 500-600 ng / ul utilizzando singola impostazione filamento di DNA). Aggiungere il volume appropriato di sonde per tubi specifici (sonda 100 pmol per 1 mL cromatina, 1 ml di 100 pmol / ul sonda per 1 mL cromatina).Mescolare bene. Incubare a 37 ° C per 4 ore con agitazione. Con 20 min rimanente per ibridazione, preparare le perline magnetiche C-1 (conservato a 4 ° C). Utilizzare 100 pl per 100 pmol di sonde. Lavare con 1 mL di tampone di lisi senza supplementi per tre volte, utilizzando il DynaMag-2 striscia magnetica di perline separate da buffer. Risospendere le sfere in volume originale di tampone di lisi e Supplemento fresca PMSF, PI e Superase-in. Dopo 4 ore reazione di ibridazione è completa, aggiungere 100 microlitri perline in ciascun tubo. Mescolare bene. Incubare a 37 ° C per 30 minuti con agitazione. Preparare il tampone di lavaggio (5 mL per campione). Vortex per mescolare. Pre-riscaldare a 37 ° C. Aggiungere PMSF prima dell'uso. Lavare perline con 1 mL di tampone di lavaggio cinque volte. Al primo lavaggio, utilizzare DynaMag-15 nastro magnetico a grani separati, decantare, e risospendere in 1 ml di tampone di lavaggio. Trasferire il volume di 1,5 ml provetta Eppendorf. Incubare a 37 ° C con agitazione per 5 min. Il lavaggi successivi, spin down ogni tubo su un minicentrifuge, Set di prova sulla DynaMag-2 striscia magnetica per 1 min. Campione di decantare, asciugare eventuali gocce con un Kimwipe, risospendere in 1 ml di tampone di lavaggio. Incubare a 37 ° C con agitazione per 5 min. Ripetere l'operazione per cinque lavaggi totali. In ultimo lavaggio, risospendere le sfere bene. Togliere 100 pl e mettere da parte per l'isolamento di RNA. Riserva 900 microlitri per frazione di DNA. Posizionare tutte le provette su DynaMag-2 banda magnetica e rimuovere il tampone di lavaggio. Centrifugare tutte le provette premuto brevemente, metterli su striscia magnetica. Rimuovere l'ultimo bit di tampone di lavaggio completamente con un netto 10 puntale ul. 7. RNA isolamento Estratto frazione di RNA da campioni CHIRP per quantificare da qRT-PCR. Prendete 100 campioni ul tallone e 10 L campione di input RNA. Aggiungere 85 ul RNA PK Buffer pH 7,0 a RNA INPUT. Risospendere le sfere in 95 microlitri di buffer pH 7,0 RNA PK. Aggiungere 5 K ul Proteinease e incubare a 50 ° C per 45 min con end-to-end agitazione. In breve lo spin-down tutti i tubi ecampioni bollire per 10 min in blocco di calore a 95 ° C. Raffreddare i campioni sul ghiaccio, aggiungere 500 microlitri TRIzol, mescolare vigorosamente nel vortex per 10 sec. Incubare a temperatura ambiente per 10 min. Conservare a -80 ° C o di procedere al punto 4. Aggiungere 100 ul al cloroformio Trizol campioni trattati. Energicamente per 10 sec. Spin a 16100RCF su una centrifuga da banco per 15 min a 4 ° C. Rimuovere ~ 400 microlitri surnatante acquoso, evitando organico e interfaccia. Aggiungere 600 microlitri (1,5 volume) 100% di etanolo e mescolare bene. Spin campione attraverso MIRNeasy colonne mini. Lavare 1x RWT (MIRNeasy mini kit), 2x con RPE al protocollo del produttore. Eluire con 30 microlitri priva di nucleasi H 2 O (NFH 2 O). Trattare l'eluato RNA con DNA-free per protocollo del produttore. Dopo la reazione è completa, riscaldare il campione per 15 minuti a 65 ° C per inattivare completamente qualsiasi residuo DNasi. Utilizzare 1 RNA ul isolato per bene per qRT-PCR per confermare lncRNArecupero. GAPDH viene spesso utilizzato come controllo negativo. 8. DNA Isolation Estratto frazione di DNA da campioni CHIRP mediante sequenziamento per identificare o quantificare da qPCR. Preparare il tampone di eluizione del DNA (vedi elenco buffer), 150 ml per campione, con ingresso DNA. Aggiungere 1 0μL RNasi A (10 mg / ml) e 10 L RNasi H (10 U / pl) per ml di tampone di eluizione DNA, e vortex per miscelare. Risospendere ogni campione di perle in 150 microlitri di tampone di eluizione del DNA con RNasi. (DNA INPUT risospendere in 140 pl) incubare a 37 ° C per 30 minuti con agitazione. Perle separate e il surnatante DynaMag-2 striscia magnetica. Rimuovere il surnatante e aggiungere ai tubi etichettati. Preparare una seconda aliquota di tampone di DNA eluizione con 10 L RNasi A (10 mg / mL) e RNaseH (10 U / mL) esattamente come fatto in 8,2). Aggiungere 150 ul di ogni campione (comprese INPUT DNA), incubare e rimuovere il surnatante. Raccogliere tutte le surnatante (spallad essere ~ 300 mL). Aggiungere 15 PK ul a ciascun campione. Incubare a 50 ° C per 45 minuti con agitazione. Pre-spin down giallo phase-lock tubi di gel (5PRIME). Trasferimento campioni di DNA di phase-lock tubi di gel, e aggiungere 300 ml PhOH: Cloroformio: isoamile per campione. Agitare vigorosamente per 10 min, e girare su una centrifuga da banco a 16100RCF per 5 min a 4 ° C. Prendere acquoso dalla parte superiore (~ 300 pl). Aggiungere 3 GlycoBlue uL, NaOAc 30 uL, e 900 microlitri EtOH 100%. Mescolare bene e conservare a -20 ° C per una notte. Spin campioni a 16100RCF per 30 minuti a 4 ° C. Decantare il surnatante con cura. Aggiungere 1 ml di EtOH 70% e vortex per miscelare. Spin a 16100RCF per 5 min. Rimuovere il surnatante con la pipetta. Lasciare asciugare all'aria per 1min. Risospendere in 30 ul EB. Campioni di DNA sono pronti per l'analisi mediante qPCR o nella preparazione di high-throughput sequencing librerie per protocollo Illumina. 10. Risultati rappresentativi Figura 1 </strong> descrive il flusso di lavoro CHIRP. Un esperimento CHIRP successo arricchisce tipicamente RNA bersaglio significativamente nel non-specifici RNA. Figura 2 mostra arricchimento della telomerasi RNA umano (TERC) da cellule HeLa oltre GAPDH, un RNA abbondanti cellulari che serve come controllo negativo. La maggior parte degli RNA TERC (~ 88%) presenti nella cellula sono state abbattute eseguendo CHIRP, mentre solo il 0,46% del GAPDH RNA è stato recuperato, dimostrando un fattore di arricchimento di circa 200 volte. Le sonde non specifici quali sonde di targeting LacZ RNA, che non è espressa in cellule di mammifero (Figura 2), può essere usato come addizionali controlli negativi. Regioni di DNA prevede di impegnare la lncRNA destinazione sono in genere arricchiti sulle regioni negativi quando misurata dal qPCR. La figura 3 mostra la convalida qPCR di quattro Hotair-bound siti primari fibroblasti del prepuzio umano che siamo determinati eseguendo CHIRP-seq nella linea stessa cella, mentre TERC e GAPDH DNA siti di sérve come regioni di controllo negativo. Sia "anche" e la sonda "dispari" imposta arricchimento prodotto comparabile attesi Hotair-bound siti su regioni negativi, un segno distintivo di veri lncRNA siti di legame. High-throughput sequenziamento del DNA CHIRP arricchito produce una mappa globale di lncRNA siti di legame. La Drosophila lncRNA roX2 è noto per interagire con il cromosoma X in un modo che è necessaria la compensazione del dosaggio. Figura 4 mostra roX2 profilo di legame su una sezione del cromosoma X. Sia "anche" e "dispari" i campioni sono stati sequenziati e le loro unici rumori sono stati eliminati per produrre una traccia di segnali sovrapposti. Ogni "picco" indica qui un sito di forte roX2 vincolante. La pista e la lista delle roX2 geni bersaglio sono stati descritti in Chu et al. 2011 17. Figura 1. Diagramma di flusso della procedura CHIRPdure. La cromatina è reticolata ad lncRNA: addotti proteici in vivo Biotinylated sonde piastrelle sono ibridate per indirizzare lncRNA e complessi della cromatina sono purificati utilizzando perline streptavidina magnetici, seguiti da lavaggi stringenti.. Noi eluire DNA legato lncRNA o proteine, con un cocktail di RNasi A e H. è schematizzata Una sequenza putativa lncRNA vincolante in arancione. Precedentemente pubblicato in Chu et al. 2011 17. Figura 2. Arricchisce CHIRP per l'uomo TERC RNA. TERC-asDNA sonde recuperare ~ 88% dei cellulari TERC RNA non rilevabile e GAPDH. LacZ-asDNA sonde vengono utilizzati come controlli negativi e recuperare né RNA. Media + sd vengono visualizzati. Precedentemente pubblicato in Chu et al. 2011 17. Figura 3. Hotair CHIRP-qPCR in umana primaria perfibroblasti Eskin. NFKBIA, HOXD3-4, SERINC5 e ABCA2 sono regioni che interagiscono con Hotair. TERC e GAPDH serviti come controlli negativi. Media + sd vengono visualizzati. Precedentemente pubblicato in Chu et al. 2011 17. Figura 4. CHIRP-seguenti dati di roX2 SL2 RNA in cellule di Drosophila. "Anche" e "dispari" sono stati sequenziati separatamente, i loro dati si fondono in modo da riflettere solo picchi comuni in entrambi. La pista è mostrato unito. Precedentemente pubblicato in Chu et al. 2011 17.