السقسقة هو تقنية جديدة وسريعة لرسم خريطة الجينوم مواقع الربط من RNAs noncoding طويلة (lncRNAs). طريقة يستفيد من خصوصية [أليغنوكليوتيد] تبليط المضادة للمعنى للسماح للتعداد من المواقع الجينومية lncRNA محدد.
RNAs وnoncoding الطويلة المنظمين الرئيسيين للدول لونين للعمليات البيولوجية الهامة مثل تعويض الجرعة، يطبع، والتنموية التعبير الجيني 1،2،3،4،5،6،7. الاكتشاف الأخير الآلاف من lncRNAs بالتعاون مع محددة مجمعات تعديل لونين، مثل مجمع القمعية Polycomb 2 (PRC2) التي تتوسط هيستون يسين H3 27 trimethylation (H3K27me3)، يشير إلى الأدوار واسعة للlncRNAs عديدة في إدارة الدول لونين في جينات محددة أزياء 8،9. في حين يعتقد بعض lncRNAs للعمل في رابطة الدول المستقلة على الجينات المجاورة، lncRNAs أخرى تعمل في العابرة لتنظيم الجينات على بعد. على سبيل المثال، ذبابة الفاكهة lncRNAs roX1 ومناطق ربط roX2 عديدة على الكروموزوم (اكس) من الخلايا الذكرية، وهي حيوية بالنسبة للتعويض جرعة 10،11. ومع ذلك، ليست معروفة على وجه التحديد المواقع من مواقعهم ملزم في ارتفاع القرار. وبالمثل، يمكن أن تؤثر على الإنسان lncRNA HOTAIR PRC2 الإشغال في حundreds من الجينات الوراثية على نطاق 3،12،13، ولكن كيف يتحقق التحديد غير واضحة. ويمكن أيضا أن تكون بمثابة LncRNAs السقالات وحدات لتوظيف جمعية مجمعات البروتين متعددة. الكلاسيكية عبر القائم بأعمال RNA سقالة هو الحمض النووي الريبي TERC التي هي بمثابة القالب وسقالة للتيلوميراز مجمع 14؛ HOTAIR يمكن أيضا أن تكون بمثابة سقالة لPRC2 وdemethylase H3K4 معقدة 13.
وكشفت دراسات سابقة رسم الإشغال في الحمض النووي الريبي لونين رؤى كبيرة 15،16، ولكن فقط في مكان جين واحد في وقت واحد. ليست معروفة في مواقع شغل معظم lncRNAs، وتم أدوار lncRNAs في تنظيم الكروماتين الاستدلال معظمها من الآثار غير المباشرة للاضطراب lncRNA. تماما كما لونين مناعي تليها ميكروأري أو تسلسل عميق (رقاقة رقاقة أو رقاقة وما يليها على التوالي) قد تحسنت بشكل كبير من فهمنا للبروتين تفاعلات الحمض النووي على نطاق الجينوم، ونحن هنا توضيح recenنشرت tly استراتيجية لرسم خريطة الحمض النووي الريبي طويل شغل الجينوم على نطاق بدقة عالية 17. ويستند هذا الأسلوب، عزل الكروماتين بواسطة تنقية الحمض النووي الريبي (السقسقة) (الشكل 1)، في القبض على تقارب من lncRNA الهدف: لونين من قبل مجمع بلاط العقاقير-oligos، الذي يولد ثم خريطة للمواقع الربط الجيني على قرار من قواعد عدة مئات مع حساسية عالية ومنخفضة في الخلفية. السقسقة ينطبق على العديد من lncRNAs لأن التصميم من الألفة، تحقيقات واضح ومباشر نظرا لتسلسل الحمض النووي الريبي ويتطلب أي معرفة بنية الحمض النووي الريبي أو المجالات الوظيفية.
وصفها هنا نحن السقسقة، وما يليها، وسيلة لرسم الخرائط في مواقع lncRNA فيفو ملزم الجينوم على نطاق. المعلمات الرئيسية للنجاح هي حمامات انقسام تبليط تحقيقات نيوكليوتيدات دقيقة ويشابك غلوتارالدهيد. تصميم تقارب-تحقيقات واضح ومباشر نظرا لتسلسل الحمض النووي الريبي ويتطلب أي علم مسبق بنية الحمض النووي الريبي أو المجالات الوظيفية. نجاحنا مع roX2، TERC، وHOTAIR – ثلاثة RNAs ومختلفة الى حد ما في نوعين – تشير إلى أن السقسقة، وما يليها هو تعميم من المرجح أن lncRNAs كثيرة. كما هو الحال مع كل التجارب، ومطلوبة من الرعاية والضوابط المناسبة لتفسير النتائج. lncRNA مختلفة قد تتطلب المعايرة من الظروف، وتغير حكيمة من الشروط، مثل اختيار تحقيقات تقارب مختلفة أو قد crosslinkers، تسليط الضوء على جوانب مختلفة من الحمض النووي الريبي، لونين التفاعلات. مثل رقاقة وما يليها، وليس كل الأحداث وظيفية ملزم بالضرورة، وثمة حاجة إلى دراسات إضافية للتأكد من العواقب البيولوجية من الحمض النووي الريبي سccupancy على لونين. ومع ذلك، فإننا نتوقع طلبات كثيرة مثيرة للاهتمام لهذه التكنولوجيا للباحثين من lncRNAs الكروماتين الأخرى المرتبطة بها، التي يبلغ عددها الآن بالآلاف 8،9. تماما كما رقاقة وما يليها قد فتح الباب لالجينوم على نطاق الاستكشافات من الحمض النووي من البروتين التفاعلات، قد السقسقة، وما يليها من دراسات "interactome الحمض النووي الريبي" تكشف عن سبل جديدة العديد من الاحياء.
The authors have nothing to disclose.
نشكر T. هونغ، MC. تساي، O. مانور، سيغال E.، كورودا م، Swigut ت، وأولا Shestopalov للمناقشات. بدعم من وكالة العلوم والتكنولوجيا والبحوث في سنغافورة (CC)، المعاهد الوطنية للصحة R01-R01 و CA118750 HG004361-(HYC)، ومعهد كاليفورنيا للطب التجديدي (HYC). HYC هو عالم الوظيفي في وقت مبكر من معهد هوارد هيوز الطبي.
Buffer List:
Dissolve a pellet of complete protease inhibitor in 1 ml water as 50x stock. Make 100 mM PMSF in isopropanol (100x stock). Superase-in is used as 200x stock. Store all at -20°C.
Lysis Buffer:
50 mM Tris-Cl pH 7.0
10 mM EDTA
1% SDS
Always add PMSF, P.I. and Superase-in fresh before use except when washing beads
Proteinase K Buffer (for DNA)
100 mM NaCl
10 mM TrisCl pH 8.0 (For RNA use pH 7.0)
1 mM EDTA
0.5% SDS
Add 5% by volume Proteainse K (Ambion AM2546 20 mg/ml) fresh before use
Hybridization Buffer
750 mM NaCl
1% SDS
50 mM Tris-Cl pH 7.0
1 mM EDTA
15% formamide (store in the dark at 4°C)
Always add PMSF, P.I. and Superase-in fresh before use
Wash Buffer
2x NaCl and Sodium citrate (SSC) (diluted from 20x SSC Invitrogen stock)
0.5% SDS
Always add PMSF fresh before use
DNA elution Buffer
50 mM NaHCO3
1% SDS
Table of specific reagents and equipment:
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Glutaraldehyde (EM grade) | Sigma Aldrich | G5882-10x10ml |
Motorized pellet mixer | VWR | V8185-904 |
Protease inhibitor | Roche | 11873580001 |
PMSF | Sigma Aldrich | 78830 |
Superase-in | Ambion | AM2696 |
Bioruptor | Diagenode | UCD-200 |
Falcon tubes (for sonication) | Corning | 430790 |
Proteinase K | Ambion | AM2546 |
PCR purification kit | Qiagen | 28106 |
C-1 magnetic beads | Invitrogen | 65002 |
PMSF | Sigma Aldrich | P7626-25G |
DynaMag-15 magnet | Invitrogen | 123-01D |
DynaMag-2 magnet | Invitrogen | 123-21D |
MIRNeasy mini kit | Qiagen | 217004 |
Rnase H | Epicentre | R0601K |
Rnase A | Sigma Aldrich | R4875-100MG |
Phase Lock Gel Heavy | 5 PRIME | 2302810 |
Trizol | Invitrogen | 15596-018 |
Phenol:chloroform:Isoamyl | Invitrogen | 15593-031 |
Chloroform | Ricca | RSOC0020-1C |
GlycoBlue | Ambion | AM9515 |
Glycine | J.T. Baker | 4057-06 |
PBS, pH 7.4 | Invitrogen | 10010-049 |
Elution Buffer (EB) | Qiagen | 19086 |
20x SSC | Invitrogen | 15557-036 |
10% SDS | Invitrogen | 15553-027 |
DNA-free | Ambion | AM1906 |
Buffer kit | Ambion | AM9010 |
Formamide | Invitrogen | 15515-026 |