Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

Chromatin Isolering af RNA Oprensning (chirp)

doi: 10.3791/3912 Published: March 25, 2012

Summary

Chirp er en hidtil ukendt og hurtig teknik til at kortlægge genomiske bindingssteder lange kodende RNA'er (lncRNAs). Metoden benytter sig af de særlige anti-sense-tagsten oligonukleotider at tillade optælling af lncRNA-bundne genomiske sites.

Abstract

Lange noncoding RNA er vigtige regulatorer af kromatin stater for vigtige biologiske processer såsom dosering kompensation, prægning, og udviklingsmæssige genekspression 1,2,3,4,5,6,7. Den nylige opdagelse af tusindvis af lncRNAs i samarbejde med specifikke kromatin ændring komplekser, såsom Polycomb Undertrykkende Complex 2 (PRC2), der medierer histon H3 lysin 27 trimethylation (H3K27me3), foreslår roller, for mange lncRNAs i forvaltningen af ​​kromatin stater i et gen-specifik mode 8,9. Mens nogle lncRNAs menes at virke i cis for tilstødende gener, andre lncRNAs arbejder i trans for at regulere fjernt beliggende gener. For eksempel er Drosophila lncRNAs roX1 og roX2 binder mange regioner på X-kromosomet af mandlige celler og kritisk for dosering erstatning 10,11. Imidlertid er de nøjagtige placeringer af deres bindingssteder ikke kendt med høj opløsning. Tilsvarende kan humant lncRNA HOTAIR påvirke PRC2 belægning på hundreds af gener genom-dækkende 3,12,13, men hvordan specificitet opnås, er uklart. LncRNAs kan også tjene som modulære stilladser at rekruttere samling af flere protein komplekser. Den klassiske trans-virkende RNA stillads er tert RNA, der tjener som template og stativ til telomerase komplekset 14, HOTAIR kan også tjene som et stillads til PRC2 og H3K4 demethylase kompleks 13.

Tidligere undersøgelser kortlægning RNA belægning på chromatin har afsløret væsentlige indsigt 15,16, men kun ved en enkelt genlocus ad gangen. De belægning steder fleste lncRNAs er ikke kendt, og de roller lncRNAs i kromatin forordning er blevet det meste udledes de indirekte effekter af lncRNA forstyrrelse. Ligesom kromatin immunofældning efterfulgt af microarray eller dyb sekventering (Chip-chip eller chip-seq, henholdsvis) har i høj grad forbedret vores forståelse af protein-DNA interaktioner på en genomisk skala, her viser vi en recently offentliggjort strategi for at kortlægge lange RNA belægning genom-dækkende i høj opløsning 17. Denne fremgangsmåde, chromatin Isolation af RNA Oprensning (chirp) (figur 1), er baseret på affiniteten indfangning af mål lncRNA: chromatin kompleks af fliser antisense-oligoer, der genererer derefter et kort over genomiske bindingssteder med en opløsning af flere hundrede baser med høj følsomhed og lav baggrund. Chirp er anvendelig til mange lncRNAs fordi udformningen af ​​affinitets-prober er ligetil givet RNA-sekvens og kræver ingen viden om RNA struktur eller funktionelle domæner.

Protocol

1. Sondedesign

Design anti-sense DNA fliseopsætning prober til selektiv udtagning af RNA-målet af chirp.

  1. Design anti-sense-oligo-sonder ved hjælp af online-sonden designer hos singlemoleculefish.com 18.
  2. Anvendes følgende parametre: antal prober = en probe / 100 bp af RNA længde, 2) Target GC% = 45, 3) oligonucleotid længde = 20, 4) afstand længde = 60-80. Break RNA ind i segmenter, hvis for længe for designeren. Udelade regioner gentagelser eller omfattende homologi.
  3. Ordens anti-sense DNA-prober med BiotinTEG ved 3-prime enden.
  4. Mærkeprober efter deres positioner langs RNA. Adskille dem i to puljer, således at "selv" pool indeholder alle prober nummerering 2, 4, 6, osv., og den "ulige" pulje indeholder prober nummerering 1, 3, 5 osv. fortyndes pulje af prober til 100 uM koncentration og Opbevar ved -20 ° C.
  5. Alle eksperimenter skal udføres ved hjælpbegge puljer, der tjener som interne kontroller for hinanden. Fast RNA-afhængige signal ville være til stede fra begge puljer, mens probe-specifikke støj vil være unikt for hver pulje. Dette gælder for både Chirp-qPCR og Chirp-ff.

2. Harvest Celler

Indsamle cellerne, der skal anvendes til chirp eksperiment.

  1. Dyrke celler i vævskulturplader eller-kolber til konfluens. Skylning med phosphatbufret saltvand (PBS) gang Trypsinisér. Dæmpning trypsin med> 2x volumen medier pipette op og ned for at fjerne celler og resuspenderes i en enkelt cellesuspension. Overfør alle medier og resuspenderede celler i 50 ml Falcon rør. 20 millioner celler er typisk tilstrækkelig til en chirp prøve.
  2. Spinde cellerne ved 800RCF i 4 minutter. Aspirer medier og resuspender 40 millioner celler i 40 ml PBS, kombinere rør om nødvendigt. Spinde cellerne ved 800RCF i 4 minutter. Dekanteres PBS forsigtigt aspireres i en vinkel den resterende væske.
  3. 3. Cross-link celler og indsamle cellebundfaldet

    Tværbinding opsamlet celler med glutaraldehyd for at bevare RNA-chromatin interaktioner og forberede cellepellet.

    1. Udfør alle trin ved stuetemperatur.
    2. Forbered 1% glutaraldehyd i stuetemperatur PBS. Fremstilling af 10 ml pr 10 millioner celler (0,4 ml 25% glutaraldehyd lager + 9,6 ml PBS). Glutaraldehyd skal anvendes frisk.
    3. Tryk bunden af ​​Falcon-rør til at løsne pellets. Resuspender cellepelleten i 1% glutaraldehyd, startende med et lille volumen for at undgå klumper, og derefter supplere op til fuld volumen. Invert at blande. Tværbinding af 10 min ved stuetemperatur på en ende-til-ende rysteapparat eller rotator.
    4. Standse tværbindingsreaktionen med 1/10th volumen 1,25 M glycin ved stuetemperatur i 5 min.
    5. Rotere med 2000RCF i 5 min. Aspirer supernatanten og vask pelleten med 20 ml afkølet PBS gang centrifugering ved 2000RCF i 5 min.
    6. Aspirer og resuspender wforaskede, tværbundet pellet med 1 ml afkølet PBS pr 20 millioner celler. Overfør hver ml til et Eppendorf-rør og centrifugering ved 2000RCF i 3 minutter ved 4 ° C. Fjern så meget PBS som muligt med pipettespidsen omhyggeligt.
    7. Lynfryser cellepellets i flydende nitrogen og opbevares ved -80 ° C på ubestemt tid.

    4. Cellelyse

    Lyse tværbundne celler til fremstilling af cellelysatet.

    1. Optø frosne cellepellets ved stuetemperatur. Tryk vanskeligt at fjerne og blande cellepelleten. Vågeblus pelleten ved 2000RCF i 3 minutter ved 4 ° C. Anvende en skarp 10 ul pipettespidsen at fjerne eventuel resterende PBS.
    2. På en elektronisk vægt (nøjagtighed på 1 mg) tara massen af ​​et tomt Eppendorf rør (vores rør vejer 1.060 gram meget konsekvent). Vejes hver pellet og registrere sin vægt. En fuld 15 cm skål af krydsbundne HeLa celler typisk vejer 100 mg.
    3. Supplement lyseringsbuffer (10X massen af ​​pelleten, fx 1 ml til 100 mg) med Fresh proteasehæmmer, PMSF og Superase-in (se vedlagte buffer liste). Bland godt.
    4. Tilsættes 10X volumen suppleret lyseringsbuffer til hvert rør og resuspender pelleten. For små pellets <25 mg, resuspenderes i 250 pi suppleret lysisbuffer. Suspension skal være glat. Hvis ikke, opdele suspension i 500 pi alikvoter og anvende en motoriseret pellet mixer til at bryde op klumper. Fortsæt straks til lydbehandling.

    5. Sonikering

    Forskydning DNA ved sonikering tværbundne cellelysater.

    1. Sonikeres cellelysat i Bioruptor i 15 ml Falcon-rør. Anvende <1,5 ml lysat i hvert rør, og for hurtigere sonikering, ikke mere end to rør sonikeres ad gangen.
    2. Sonikeres i et 4 ° C vandbad ved højeste indstilling med 30 sekunder på, 45 sekunder fra impulsintervaller. Se lysat hver 30 min. Fortsætter sonikering, indtil cellelysatet ikke længere uklar. Dette kan tage så lidt som 30 minutter og så mange som 4 timer. Antalletaf rør, vil det prøvevolumen, badtemperaturen, og perioden af ​​lydbehandling tid påvirker hvor lang tager. Rør vil sandsynligvis sonikeres ved forskellige hastigheder, så samle dem sammen hver 30 min og videredistribuere ind originale rør for at sikre homogenitet. Bemærk: glutaraldehyd-tværbundet celler tager betydeligt længere tid at sonikeres end formaldehyd ækvivalenter.
    3. Når lysatet bliver klar, overføres 5 pi lysat til en frisk Eppendorf-rør. Tilsættes 90 uL DNA Protease K (PK) puffer (se puffer liste) og 5 ul PK. Vortex at blande og spin ned kortvarigt. Inkuber i 45 minutter ved 50 ° C.
    4. Ekstrahere DNA med Qiagen PCR Purification Kit. Eluatet DNA i 30 uL Qiagen elueringsbuffer (EB) og kontrol DNA størrelse på 1% agarosegel. Hvis størstedelen af ​​DNA'et smear er 100-500 bp, sonikering er fuldstændig. Hvis ikke, fortsætter med at sonikeres.
    5. Centrifugeres sonikerede prøver ved 16100RCF i 10 minutter ved 4 ° C. Kombiner supernatanter og alikvote i 1 ml prøver og flash-frost i flydende nitrogen. Opbevares ved -80 ° C.

    6. Chirp

    Hybridisering af biotinylerede DNA-prober til RNA og isolere bundet kromatin.

    1. Tø rør af kromatin ved stuetemperatur.
    2. Forberede hybridiseringsbuffer (se puffer listen fremstilling af 2 ml per ml af kromatin). Vortex for at blande.
    3. For en typisk chirp prøve ved anvendelse af 1 ml af lysatet, fjernes 10 pi for RNA INPUT og 10 uL for DNA input og anbringes i Eppendorf-rør. Hold på is indtil videre brug.
    4. Overføre 1 ml chromatin til 15 ml Falcon-rør. Tilsættes 2 mL hybridiseringsbuffer til hvert rør. For samlede volumen <1,5 ml, skal du bruge Eppendorfrør.
    5. Tø prober ved stuetemperatur. Nanodrop sonder at kontrollere beløbet, hvis du ikke har brugt det i lang tid (100 uM sonder bør spec ~ 500-600 ng / ul anvendes enkelt DNA indstilling). Tilsættes passende rumfang af prober specifikke rør (100 pmol probe pr 1 ml chromatin, 1 pi 100 pmol / ul probe per 1 ml kromatin).Bland godt. Inkuber ved 37 ° C i 4 timer med rystning.
    6. Med 20 min resterende for hybridisering, fremstille C-1 magnetiske perler (opbevaret ved 4 ° C). Bruger 100 pi 100 pmol af prober. Vaskes med 1 ml usuppleret lyseringsbuffer tre gange med DynaMag-2 magnet strimmel til at adskille perlerne fra buffer.
    7. Resuspender perler i oprindelige volumen lysisbuffer, supplerer med frisk PMSF, PI og Superase-in. Efter 4 timer hybridisering reaktionen er fuldstændig, tilsættes 100 ul perler til hvert rør. Bland godt. Inkuber ved 37 ° C i 30 minutter under omrystning.
    8. Forberede Vaskebuffer (5 ml per prøve). Vortex for at blande. Præ-opvarmes til 37 ° C. Tilsættes PMSF før brug.
    9. Vaskes perlerne med 1 ml vaskebuffer fem gange. Den første vask, anvendes DynaMag-15 magnetisk strimmel til separate perler, dekanteres og resuspender i 1 ml vaskebuffer. Overfør volumen på 1,5 ml Eppendorf-rør. Inkuber ved 37 ° C under omrystning i 5 minutter.
    10. På de efterfølgende vaske, spin ned hvert rør på et minicentrifugeSatte prøve på DynaMag-2 magnetstribe til 1 min. Dekanteres, skal du aftørre eventuelle dryp med en Kimwipe, resuspender i 1 ml vaskebuffer. Inkuber ved 37 ° C under omrystning i 5 minutter. Gentag for fem i alt vaske.
    11. Endelig vask resuspenderes perlerne godt. Fjern 100 uL og der er afsat til RNA isolering. Reserve 900 uL for DNA-fraktionen. Læg alle rør på DynaMag-2 magnetstribe og fjern vaskebuffer. Spin alle rør ned kort, placere dem på magnet strimmel. Fjerne den sidste bit i vaskebuffer fuldstændigt med en skarp 10 pi pipettespids.

    7. RNA-isolerinq

    Ekstrahere RNA-fraktion fra Chirp prøver til kvantificering af QRT-PCR.

    1. Tag 100 ul perle prøver og 10 uL RNA INPUT prøve. Tilsættes 85 uL RNA PK-puffer pH 7,0 til RNA INPUT. Resuspender perlerne i 95 ul RNA PK pH 7,0. Tilsæt 5 uL Proteinease K og inkuber ved 50 ° C i 45 min med ende-til-ende rystning.
    2. Kort spin ned alle rør ogkoge prøver i 10 minutter på varmeblok ved 95 ° C.
    3. Chill prøver på is, tilsættes 500 ul TRIzol, vortex kraftigt i 10 sek. Inkuber ved stuetemperatur i 10 min. Opbevares ved -80 ° C eller fortsæt til trin 4.
    4. Tilsæt 100 pi chloroform TRIzol behandlede prøver. Vortex kraftigt i 10 sek. Rotere med 16100RCF på en bordcentrifuge i 15 minutter ved 4 ° C.
    5. Fjern ~ 400 uL vandig supernatant, undgå organisk og interface.
    6. Tilsæt 600 uL (1,5 volumen) 100% ethanol og bland godt. Spin prøven gennem MIRNeasy minisøjler. Vaskes 1 gang med rWT (MIRNeasy mini kit), 2x med RPE ifølge producentens protokol. Eluering med 30 ul nuclease-frit H2O (NFH H2O).
    7. Behandle RNA eluatet med DNA-fri ifølge producentens protokol. Efter at reaktionen er fuldstændig, opvarmes prøven i 15 minutter ved 65 ° C til fuldstændig inaktivering af eventuelt resterende DNase.
    8. Anvende 1 pi RNA isolering per brønd for QRT-PCR-analyse for at bekræfte lncRNAhentning. GAPDH er ofte anvendt som en negativ kontrol.

    8. DNA-isolering

    Ekstrahere DNA fraktion fra Chirp prøver til identifikation ved sekventering eller kvantificering af qPCR.

    1. Fremstille DNA elueringsbuffer (se puffer liste), 150 gl pr prøve, herunder DNA INPUT.
    2. Tilsættes en 0μL RNase A (10 mg / ml) og 10 pi RNase H (10 U / ul) per ml af DNA elueringspuffer og vortex at blande.
    3. Resuspendere hver prøve af perler i 150 pi DNA elueringsbuffer med RNaser. (Resuspender DNA INPUT i 140 uL) Inkuber ved 37 ° C i 30 minutter under omrystning.
    4. Separate perler og supernatanten på DynaMag-2 magnetisk strimmel. Fjerne supernatanten, og der tilsættes til mærkede rør.
    5. Fremstilling af en anden portion af DNA elueringsbuffer med 10 pi RNase A (10 mg / ml) og RNaseH (10 U / ul) nøjagtigt som det gøres i 8,2). Tilsæt 150 pi af hver prøve (herunder DNA INPUT), inkuber og fjern supernatanten. Saml alle supernatant (skuldred er ~ 300 uL).
    6. Tilsæt 15 uL PK til hver prøve. Inkuber ved 50 ° C i 45 minutter under omrystning.
    7. Pre-spin ned gule fase-lock gel-rør (5PRIME). Overføre DNA-prøver til faselåste gelrør, og der tilsættes 300 pi PhOH: chloroform: isoamylalkohol per prøve. Omrystes kraftigt i 10 minutter, og spin ned på en bordcentrifuge ved 16100RCF i 5 minutter ved 4 ° C. Tager vandig fra toppen (~ 300 uL). Tilsæt 3 uL GlycoBlue, 30 uL NaOAc, og 900 pi 100% EtOH. Bland godt og opbevares ved -20 ° C natten over.
    8. Spin prøver ved 16100RCF i 30 minutter ved 4 ° C.
    9. Dekanteres supernatanten omhyggeligt. Tilsæt 1 ml 70% EtOH og vortex at blande. Rotere med 16100RCF i 5 min. Fjerne supernatanten ved pipette. Lufttørre i 1min. Resuspender i 30 uL EB.
    10. DNA-prøver er klar til analyse af qPCR eller tilberedning af high-throughput sekventering biblioteker pr Illumina protokol.

    10. Repræsentative resultater

    Figur 1 Figur 2 viser berigelsen af human telomerase RNA (tert) fra HeLa-celler end GAPDH, en rigelig cellulært RNA, der tjener som en negativ kontrol. Størstedelen af ​​tert RNA'er (~ 88%) til stede i cellen, blev trukket ned ved at udføre chirp, hvorimod kun 0,46% af GAPDH-RNA blev udtaget, viser en berigelsesfaktor på ~ 200 fold. Uspecifikke prober såsom prober rettet LacZ-RNA, som ikke udtrykkes i mammale celler (figur 2), kan anvendes som yderligere negative kontroller.

    DNA-regioner forventes at binde målet lncRNA typisk beriget med negative regioner, når målt ved qPCR. Figur 3 viser qPCR validering af fire HOTAIR-bundne steder i primære humane forhudsfibroblaster, at vi bestemt ved at udføre Chirp-seq i den samme cellelinje, mens tert og GAPDH DNA sites selvRVE som negativ kontrol regioner. Både "selv" og "ulige" sonde sætter gav sammenlignelige berigelse af forventede HOTAIR-bundne steder end negative regioner, et adelsmærke for ægte lncRNA-bindingssteder.

    High-throughput sekventering af Chirp beriget DNA giver et globalt kort over lncRNA-bindingssteder. Drosophila lncRNA roX2 vides at interagere med X-kromosomet på en måde, der er nødvendig for dosering erstatning. Figur 4 viser roX2 binding profil over en del af X-kromosomet. Både "selv" og "mærkelige" prøver er blevet sekventeret og deres unikke lyde er blevet fjernet for at frembringe et spor af overlappende signaler. Hver "peak" her viser en kraftig sted roX2 binding. Den komplette spor og over roX2 målgener er blevet beskrevet i Chu et al. 2011 17.

    Figur 1.
    Figur 1. Rutediagram af chirp procedure. Chromatin tværbindes til lncRNA: proteinaddukter in vivo Biotinylerede flisebelægning prober hybridiseret til målsekvensen lncRNA og chromatin komplekser oprenses under anvendelse af magnetiske streptavidin-perler, efterfulgt af strenge vaske.. Vi eluerede lncRNA bundne DNA eller proteiner med en cocktail af RNase A og H. En formodet lncRNA bindingssekvens er skematiseret i orange. Tidligere offentliggjort i Chu et al. 2011. 17

    Figur 2.
    Figur 2. Chirp beriger for menneskers tert-RNA. Tert-asDNA prober hente ~ 88% af cellulær tert RNA og upåviselig GAPDH. LacZ-asDNA prober anvendes som negative kontroller og hente hverken RNA'er. Gennemsnit ± SD er vist. Tidligere offentliggjort i Chu et al. 2011. 17

    Figur 3.
    Figur 3. HOTAIR chirp-qPCR i primær human tilEskin fibroblaster. NFKBIA, HOXD3-4 SERINC5 og ABCA2 er områder, der interagerer med HOTAIR. tert og GAPDH tjente som negative kontroller. Gennemsnit ± SD er vist. Tidligere offentliggjort i Chu et al. 2011. 17

    Figur 4.
    Figur 4. Chirp-seq data for roX2 RNA i SL2 Drosophila-celler. "Selv" og "ulige" blev sekventeret separat, deres data fusionere kun afspejler fælles toppe i både. Den fusionerede spor vises. Tidligere offentliggjort i Chu et al. 2011. 17

Discussion

Her beskrev Chirp-ff, en metode til kortlægning in vivo lncRNA bindingssteder genom-dækkende. De vigtigste parametre for succes er delte puljer af fliser oligonukleotidproberne og glutaraldehyd tværbindings. Udformningen af ​​affinitets-prober er ligetil givet RNA-sekvens og ikke kræver forudgående kendskab til RNA struktur eller funktionelle domæner. Vores succes med roX2, tert, og HOTAIR - tre ret forskellige RNA i to arter - tyder på, at Chirp-seq sandsynligvis generaliseres til mange lncRNAs. Som med alle eksperimenter, der er pleje og korrekt kontrol forpligtet til at fortolke resultaterne. Forskellige lncRNA kan kræve titrering af betingelser, og velovervejet ændring af betingelser, såsom udvælgelse af forskellige affinitets-prober eller tværbindere, kan fremhæve de forskellige aspekter af RNA-chromatin interaktioner. Ligesom Chip-seq, er ikke alle bindende begivenheder nødvendigvis funktionelle, og kræver yderligere undersøgelser at fastslå de biologiske konsekvenser af RNA occupancy på kromatin. Ikke desto mindre forventer vi mange interessante anvendelser af denne teknologi for forskere fra andre kromatin-associerede lncRNAs, som nu nummer i tusindvis 8,9. Ligesom Chip-seq har åbnet døren for genom-dækkende undersøgelser af DNA-protein interaktioner, kan Chirp-seq undersøgelser af "RNA Interactome" afsløre mange nye veje i biologi.

Disclosures

C. Chu og HY Chang er navngivet som opfindere på en patentansøgning baseret på denne metode.

Acknowledgments

Vi takker T. Hung, MC. Tsai, O. Manor, E. Segal, M. Kuroda, T. Swigut, og I. Shestopalov for drøftelserne. Understøttet af agenturet for Videnskab, Teknologi og Forskning i Singapore (CC), NIH R01-CA118750 og R01-HG004361 (HYC), og California Institute for regenerativ medicin (HYC). HYC er en Early Career Scientist af Howard Hughes Medical Institute.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Buffer List:
Dissolve a pellet of complete protease inhibitor in 1 ml water as 50x stock. Make 100 mM PMSF in isopropanol (100x stock). Superase-in is used as 200x stock. Store all at -20 °C.
Lysis Buffer:
50 mM Tris-Cl pH 7.0
10 mM EDTA
1% SDS
Always add PMSF, P.I. and Superase-in fresh before use except when washing beads
Proteinase K Buffer (for DNA)
100 mM NaCl
10 mM TrisCl pH 8.0 (For RNA use pH 7.0)
1 mM EDTA
0.5% SDS
Add 5% by volume Proteainse K (Ambion AM2546 20 mg/ml) fresh before use
Hybridization Buffer
750 mM NaCl
1% SDS
50 mM Tris-Cl pH 7.0
1 mM EDTA
15% formamide (store in the dark at 4 °C)
Always add PMSF, P.I. and Superase-in fresh before use
Wash Buffer
2x NaCl and Sodium citrate (SSC) (diluted from 20x SSC Invitrogen stock)
0.5% SDS
Always add PMSF fresh before use
DNA elution Buffer
50 mM NaHCO3
1% SDS
Table of specific reagents and equipment:
Glutaraldehyde (EM grade) Sigma-Aldrich G5882-10x10ml
Motorized pellet mixer VWR international V8185-904
Protease inhibitor Roche Group 11873580001
PMSF Sigma-Aldrich 78830
Superase-in Ambion AM2696
Bioruptor Diagenode UCD-200
Falcon tubes (for sonication) Corning 430790
Proteinase K Ambion AM2546
PCR purification kit Qiagen 28106
C-1 magnetic beads Invitrogen 65002
PMSF Sigma-Aldrich P7626-25G
DynaMag-15 magnet Invitrogen 123-01D
DynaMag-2 magnet Invitrogen 123-21D
MIRNeasy mini kit Qiagen 217004
Rnase H Epicentre Biotechnologies R0601K
Rnase A Sigma-Aldrich R4875-100MG
Phase Lock Gel Heavy 5 PRIME 2302810
Trizol Invitrogen 15596-018
Phenol:chloroform:Isoamyl Invitrogen 15593-031
Chloroform Ricca RSOC0020-1C
GlycoBlue Ambion AM9515
Glycine JT Baker 4057-06
PBS, pH 7.4 Invitrogen 10010-049
Elution Buffer (EB) Qiagen 19086
20x SSC Invitrogen 15557-036
10% SDS Invitrogen 15553-027
DNA-free Ambion AM1906
Buffer kit Ambion AM9010
Formamide Invitrogen 15515-026

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Koziol, M. J., Rinn, J. L. RNA traffic control of chromatin complexes. Curr. Opin. Genet. Dev. 20, 142-148 (2010).
  2. Mercer, T. R., Dinger, M. E., Mattick, J. S. Long non-coding RNAs: insights into functions. Nat. Rev. Genet. 10, 155-159 (2009).
  3. Rinn, J. L. Functional demarcation of active and silent chromatin domains in human HOX loci by noncoding RNAs. Cell. 129, 1311-1323 (2007).
  4. Zhao, J., Sun, B. K., Erwin, J. A., Song, J. J., Lee, J. T. Polycomb proteins targeted by a short repeat RNA to the mouse X chromosome. Science. 322, 750-756 (2008).
  5. Kelley, R. L. Epigenetic spreading of the Drosophila dosage compensation complex from roX RNA genes into flanking chromatin. Cell. 98, 513-522 (1999).
  6. Pandey, R. R. Kcnq1ot1 antisense noncoding RNA mediates lineage-specific transcriptional silencing through chromatin-level regulation. Mol. Cell. 32, 232-246 (2008).
  7. Wang, K. C. A long noncoding RNA maintains active chromatin to coordinate homeotic gene expression. Nature. 472, 120-124 (2011).
  8. Khalil, A. M. Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 11667-11672 (2009).
  9. Zhao, J. Genome-wide identification of polycomb-associated RNAs by RIP-seq. Mol. Cell. 40, 939-953 (2010).
  10. Meller, V. H., Wu, K. H., Roman, G., Kuroda, M. I., Davis, R. L. roX1 RNA paints the X chromosome of male Drosophila and is regulated by the dosage compensation system. Cell. 88, 445-457 (1997).
  11. Franke, A., Baker, B. S. The rox1 and rox2 RNAs are essential components of the compensasome, which mediates dosage compensation in Drosophila. Mol. Cell. 4, 117-122 (1999).
  12. Gupta, R. A. Long non-coding RNA HOTAIR reprograms chromatin state to promote cancer metastasis. Nature. 464, 1071-1076 (2010).
  13. Tsai, M. C. Long noncoding RNA as modular scaffold of histone modification complexes. Science. 329, 689-693 (2010).
  14. Zappulla, D. C., Cech, T. R. RNA as a flexible scaffold for proteins: yeast telomerase and beyond. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol.. 71, 217-224 (2006).
  15. Nagano, T. The Air noncoding RNA epigenetically silences transcription by targeting G9a to chromatin. Science. 322, 1717-1720 (2008).
  16. Carter, D., Chakalova, L., Osborne, C. S., Dai, Y. F., Fraser, P. Long-range chromatin regulatory interactions in vivo. Nature. 32, 623-626 (2002).
  17. Chu, C., Qu, K., Zhong, F. L., Artandi, S. E., Chang, H. Y. Genomic Maps of Long Noncoding RNA Occupancy Reveal Principles of RNA-Chromatin Interactions. Mol. Cell. (2011).
  18. Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat. Methods. 5, 877-879 (2008).
Chromatin Isolering af RNA Oprensning (chirp)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chu, C., Quinn, J., Chang, H. Y. Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP). J. Vis. Exp. (61), e3912, doi:10.3791/3912 (2012).More

Chu, C., Quinn, J., Chang, H. Y. Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP). J. Vis. Exp. (61), e3912, doi:10.3791/3912 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter