Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

בידוד הכרומטין על ידי טיהור RNA (ציוץ)

doi: 10.3791/3912 Published: March 25, 2012

Summary

ציוץ הוא טכניקה חדשנית ומהירה למפות אתרי הקישור הגנומי של RNAs noncoding ארוכות (lncRNAs). השיטה מנצלת את הייחודיות של תחושת אנטי oligonucleotides ריצוף כדי לאפשר ספירה של lncRNA הנכנס אתרים הגנומי.

Abstract

RNAs noncoding ארוכים הם וסתים מרכזיים של הכרומטין מדינות תהליכים ביולוגיים חשובים כגון פיצוי המינון, החתמה, ועל ביטוי גנים התפתחותיים 1,2,3,4,5,6,7. התגלית האחרונה של אלפי lncRNAs בשיתוף עם ספציפיים שינוי מתחמי הכרומטין, כגון קומפלקס מדכא Polycomb 2 (PRC2) כי מתווך היסטון H3 ליזין 27 trimethylation (H3K27me3), מציע תפקידים רחבים עבור lncRNAs רבים בניהול מדינות הכרומטין של הגן הספציפי אופנה 8,9. בעוד כמה lncRNAs נחשבים לעבוד בחבר העמים על גנים סמוכים, lncRNAs אחרים לעבוד טרנס להסדיר גנים הממוקמים רחוק. למשל, תסיסנית lncRNAs roX1 ו roX2 לאגד באזורים רבים על כרומוזום X של תאים זכריים, הם קריטיים עבור פיצוי במינון 10,11. עם זאת, המיקומים המדויקים של אתרי הקישור שלהם אינם ידועים ברזולוציה גבוהה. באופן דומה, אדם lncRNA HOTAIR יכול להשפיע PRC2 תפוסה על Hundreds של גנים בגנום כולו 3,12,13, אבל איך הספציפיות מושגת אינו ברור. LncRNAs יכול גם לשמש פיגומים מודולריים לגייס את הרכבה של קומפלקסים חלבונים רבים. קלאסי חוצה משחק RNA הפיגום הוא RNA TERC המשמש תבנית ואת הפיגום על telomerase מורכב 14; HOTAIR יכול גם לשמש פיגום עבור PRC2 ו demethylase H3K4 מורכב 13.

מחקרים קודמים מיפוי תפוסה RNA על הכרומטין חשפו תובנות משמעותיות 15,16, אבל רק לוקוס גן יחיד בכל פעם. האתרים התפוסה של רוב lncRNAs אינם ידועים, וכן את התפקידים של lncRNAs בוויסות הכרומטין היה להסיק בעיקר את ההשפעות העקיפות של ההפרעות lncRNA. כשם immunoprecipitation הכרומטין ואחריו microarray או רצף עמוק (שבב שבב או שבב seq, בהתאמה) השתפר מאוד את הבנתנו-DNA חלבון אינטראקציות בקנה מידה גנומי, הנה אנחנו להמחיש recenפורסם tly האסטרטגיה למפות רב תפוסה RNA הגנום כולו ברזולוציה גבוהה 17. , שיטה זו בידוד הכרומטין על ידי טיהור RNA (ציוץ) (איור 1), מבוסס על לכידת הזיקה של יעד lncRNA: מורכב הכרומטין על ידי ריצוף antisense-oligos, אשר לאחר מכן יוצרת מפה של אתרי הקישור הגנומי ברזולוציה של מאות בסיסים שונים עם רגישות גבוה ונמוך רקע. ציוץ הוא ישים lncRNAs רבים בגלל העיצוב של זיקה הבדיקות, הוא פשוט נתן את רצף הרנ"א ואינה דורשת ידע על מבנה של RNA או תחומים פונקציונליים.

Protocol

1. החללית עיצוב

נגד חוש עיצוב ריצוף ה-DNA בדיקות לאחזור סלקטיבית של RNA המטרה על ידי ציוץ.

  1. נגד חוש עיצוב oligo בדיקות באמצעות מעצב בדיקה באינטרנט singlemoleculefish.com 18.
  2. השתמש פרמטרים: מספר בדיקות = 1 בדיקה / 100 נ"ב באורך RNA; 2) יעד GC% = 45, 3) אורך oligonucleotide = 20, 4) אורך מרווח = 60-80. לשבור RNA למקטעים אם יותר מדי זמן עבור מעצב. השמט אזורי חוזר או הומולוגיה נרחבת.
  3. נגד תחושת סדר בדיקות דנ"א עם BiotinTEG בסוף 3-הממשלה.
  4. תווית בדיקות על פי עמדותיהם לאורך RNA. להפריד אותם לשתי בריכות, כך הבריכה ", גם" מכיל את כל בדיקות מספור 2, 4, 6, וכו 'בריכת "מוזר" כולל בדיקות המונים 1, 3, 5 וכו' מדולל מאגר של בדיקות לריכוז 100 מיקרומטר ו החנות ב -20 ° C.
  5. כל הניסויים שיבוצעו באמצעותשתי בריכות, המהווים הבקרות הפנימיות זה לזה. אות אמיתי RNA תלוי יהיה נוכח מבריכות הצדדים, תוך בדיקה ספציפיים רעשים יהיה ייחודי כל מאגר. זה חל גם על ציוץ ו-QPCR ציוץ-seq.

2. קציר תאים

איסוף תאים שישמשו לניסוי ציוץ.

  1. לגדל תאים בתרבית רקמה צלחות או צלוחיות ל confluency. יש לשטוף עם פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) פעם אחת trypsinize. להרוות טריפסין עם נפח> 2x של התקשורת, פיפטה למעלה ולמטה כדי לסלק תאים resuspend אל ההשעיה תא בודד. להעביר את כל המדיה ותאי resuspended לתוך צינורות 50 מ"ל פלקון. 20 מיליון תאים הם בדרך כלל די מדגם ציוץ אחד.
  2. ספין תאים ב 800RCF דקות 4. התקשורת aspirate ו resuspend 40 מיליון תאים של 40 מ"ל של PBS, לשלב צינורות במידת הצורך. ספין תאים ב 800RCF דקות 4. למזוג PBS, לשאוב היטב על זווית את הנוזל הנותר.
  3. 3. חוצה קישור תאים איסוף Cell גלולה

    Crosslink אספו תאים עם glutaraldehyde לשמר RNA-הכרומטין אינטראקציות ולהכין תא גלולה.

    1. לבצע את כל הפעולות בטמפרטורת החדר.
    2. הכן glutaraldehyde 1% בטמפרטורת החדר PBS. הכן 10 מ"ל לכל 10 מיליון תאים (0.4 מ"ל glutaraldehyde המניה 25% + 9.6 מ"ל PBS). Glutaraldehyde יש להשתמש טרי.
    3. לחץ התחתון של צינורות פלקון כדי לסלק כדורי. Resuspend תא גלולה ב glutaraldehyde 1%, החל בנפח קטן, כדי למנוע גושים, ואחר כך למעלה עד נפח מלא. הפוך לערבב. Crosslink עבור 10min בטמפרטורת החדר על הקצה לקצה שייקר או הכתף.
    4. להרוות את התגובה cross-linking עם נפח 1/10th של 1.25 מ 'גליצין בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
    5. מסובבים 2000RCF דקות 5. Aspirate supernatant ולהתרחץ גלולה עם 20 מ"ל צינן PBS פעם אחת, מסתובב ב 2000RCF במשך 5 דקות.
    6. Aspirate ו resuspend Washed, צולבים גלולה עם 1 מ"ל PBS צונן לכל 20 מיליון תאים. להעביר את כל מ"ל למבחנה Eppendorf ו ספין על 2000RCF דקות 3 ב 4 ג הסר PBS ככל האפשר עם קצה פיפטה בזהירות.
    7. Flash-להקפיא את כדורי סלולריים בחנקן נוזלי חנות ב -80 ° C ללא הגבלת זמן.

    4. תא תמוגה

    Lyse תאים crosslinked להכין lysate התא.

    1. להפשיר כדורי סלולריים קפואים בטמפרטורת החדר. הקש קשה לעקור ומערבבים תא גלולה. ספין למטה גלולה ב 2000RCF דקות 3 ב 4 ° C. השתמש קצה חד פיפטה 10 μl להסיר כל PBS הנותרים.
    2. על יתרת אלקטרוני (ומדויק במינון של 1) טרה המונית של צינור Eppendorf ריק (צינורות שלנו שוקל 1.060 גרם מאוד עקבי). לשקול כל גלולה ולהקליט את משקלו. צלחת מלאה 15 ס"מ של תאים הלה crosslinked בדרך כלל שוקל 100 מ"ג.
    3. תמוגה מאגר מוסף (10X המוני של גלולה, 1 מ"ל למשל עבור 100 מ"ג) עם fresH פרוטאז מעכב, PMSF ו Superase-in (ראו רשימה חיץ המצורפת). מערבבים היטב.
    4. הוספת נפח 10X בתוספת מאגר תמוגה לצינור כל resuspend גלולה. עבור כדוריות קטנות <25 מ"ג, resuspend במאגר תמוגה μl 250 בתוספת. ההשעיה צריכה להיות חלקה. אם לא, לחלק את ההשעיה תוך 500 aliquots μl ולהשתמש גלולה ממונע מערבל להיפרד גושים. לפנות מיד sonication.

    5. Sonication

    ה-DNA על ידי גזירה sonicating lysates סלולריים crosslinked.

    1. Sonicate lysate תא Bioruptor ב -15 צינורות מ"ל פלקון. השתמש <1.5 lysate מ"ל בצינור אחד, ועל sonication מהר יותר, sonicate לא יותר מ 2 צינורות בכל פעם.
    2. Sonicate ב אמבטיה 4 C ° המים ההגדרה הגבוהה ביותר עם 30 שניות על, 45 שניות את מרווחי הדופק. בדוק lysate כל 30 דקות. המשך sonicating עד lysate התא לעכור עוד. זה עלול לקחת קצת כמו 30 דק 'ו רבים כמו 4 שעות. מספרשל צינורות, נפח דגימה, טמפרטורת אמבטיה, פרק הזמן sonication ישפיע כמה זמן טיפול כזה נמשך. סביר להניח צינורות sonicate בקצב שונה, כך בריכה אותם יחד כל 30 דקות להפיץ מחדש אל תוך צינורות המקוריים על מנת להבטיח אחידות. הערה: glutaraldehyde-crosslinked תאים לקחת זמן רב יותר באופן משמעותי מאשר sonicate ושווי פורמלדהיד.
    3. כאשר lysate הופכת ברורה, להעביר 5 lysate μL לצינור Eppendorf טרי. הוסף 90 μL פרוטאז ה-DNA K (PK) מאגר (ראה רשימת חיץ) ו 5 קי μL. מערבולת לערבב ומסובב את בקצרה. דגירה של 45 דק 'ב 50 ° C.
    4. תמצית ה-DNA עם ערכת טיהור PCR Qiagen. ה-DNA Elute במאגר 30 Qiagen μL elution (EB) וסמנו את גודל ה-DNA על 1% agarose ג'ל. אם עיקר למרוח את ה-DNA הוא 100-500 BP, sonication הושלמה. אם לא, ממשיכים sonicate.
    5. סרכזת דגימות sonicated ב 16100RCF במשך 10 דקות ב 4 ° C. שלב supernatants, aliquot אל 1 דוגמאות מ"ל ו-Flash הקפאת nitroge נוזליn. חנות ב -80 ° C.

    6. ציוץ

    להכליא בדיקות דנ"א biotinylated ל RNA ולבודד הכרומטין מאוגד.

    1. ההפשרה צינורות של הכרומטין בטמפרטורת החדר.
    2. הכינו מאגר הכלאה (ראה רשימת חיץ, להכין 2 מ"ל לכל מ"ל של הכרומטין). מערבולת לערבב.
    3. למדגם ציוץ טיפוסי באמצעות 1 מ"ל של lysate, להסיר 10 μL עבור קלט RNA ו 10 μL עבור קלט DNA ומניחים צינורות Eppendorf. שמור על הקרח עד לשימוש נוסף.
    4. מעבירים 1 הכרומטין מ"ל למבחנה 15 מ"ל פלקון. הוסף 2 מ"ל הכלאה מאגר לצינור אחד. עבור הנפח הכולל <1.5 מ"ל, השתמש צינורות Eppendorf.
    5. בדיקות להפשיר בטמפרטורת החדר. בדיקות Nanodrop כדי לבדוק כמות אם לא השתמשו בו זמן רב (100 מיקרומטר בדיקות צריך spec ~ 500-600 ng / μl באמצעות הגדרה אחת גדיל DNA). להוסיף נפח מתאים של בדיקות כדי צינורות ספציפיים (100 pmol בדיקה לכל 1 מ"ל הכרומטין, 1 μL של החללית pmol / μL 100 מ"ל לכל 1 הכרומטין).מערבבים היטב. דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות עם רעד.
    6. עם 20 דקות נותרו על ההכלאה, להכין את החרוזים C-1 (מגנטי המאוחסן ב 4 ° C). השתמש 100 μL לכל pmol 100 של בדיקות. לשטוף עם 1 מאגר unsupplemented תמוגה מ"ל שלוש פעמים, תוך שימוש ברצועת DynaMag-2 מגנט חרוזים נפרדים מן המאגר.
    7. חרוזים Resuspend בנפח המקורית של מאגר תמוגה, עם תוספת חדשה PMSF, PI ו Superase-in. לאחר 4 שעות הכלאה התגובה הושלמה, להוסיף 100 חרוזים μL לצינור אחד. מערבבים היטב. דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עם רעד.
    8. הכינו מאגר לשטוף (5 מ"ל לדגימה). מערבולת לערבב. טרום חמים 37 ° C. הוסף PMSF לפני השימוש.
    9. לשטוף עם חרוזים חיץ מ"ל 1 לשטוף חמש פעמים. על הכביסה הראשונה, השתמש DynaMag-15 פס מגנטי כדי חרוזים שונים, למזוג, ו resuspend במאגר 1 לשטוף מ"ל. להעביר את נפח צינור 1.5 Eppendorf מ"ל. דגירה על 37 מעלות צלזיוס עם רעד במשך 5 דקות.
    10. על שוטף לאחר מכן, ספין למטה כל צינור על minicentrifuge, עותק לדוגמה על רצועת DynaMag 2-המגנטי דקות 1. מדגם לערות, לנגב טיפות עם Kimwipe, resuspend במאגר מ"ל 1 הכביסה. דגירה על 37 מעלות צלזיוס עם רעד במשך 5 דקות. חזור על חמש שוטף הכל.
    11. על הכביסה האחרון, resuspend את החרוזים גם כן. הסרה של 100 μL ומניחים בצד על בידוד RNA. שמורת 900 μL עבור חלק ה-DNA. מניחים את כל צינורות על רצועת-2 DynaMag מגנטי ולהסיר חיץ כביסה. לסובב את כל צינורות למטה בקצרה, ומניחים אותם על רצועת מגנט. הסר את החלק האחרון של המאגר לשטוף לחלוטין עם קצה חד פיפטה 10 μl.

    7. בידוד RNA

    לחלץ חלק מ-RNA דגימות ציוץ כדי לכמת ידי qRT-PCR.

    1. קח 100 דגימות חרוזים μL ו 10 μL מדגם RNA תשומות. הוסף 85 μL RNA pH קי מאגר 7.0 ל RNA תשומות. חרוזים Resuspend ב 95 μL רנ"א ה-pH 7.0 קי מרימה יד המאגר. הוסף 5 K Proteinease דגירה μL ובו 50 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות עם מקצה לקצה רועד.
    2. בקצרה לסובב את כל הצינורות ולהרתיח דגימות של 10 דקות על גוש חום על 95 ° C.
    3. לצנן על דגימות קרח, להוסיף 500 מערבולת μL, TRIzol במרץ עבור 10 שניות. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. חנות ב -80 ° C או המשך לשלב 4.
    4. הוספת 100 כלורופורם μL קטעים שטופלו TRIzol. מערבולת במרץ עבור 10 שניות. מסובבים 16100RCF על צנטריפוגות benchtop במשך 15 דקות ב 4 ° C.
    5. הסר ~ 400 supernatant מימית μL, הימנעות אורגני ממשק.
    6. הוסף μL 600 (1.5 נפח) אתנול 100% ומערבבים היטב. ספין מדגם באמצעות עמודות מיני MIRNeasy. לשטוף עם RWT 1x (MIRNeasy מיני קיט), 2x עם הרשתית לכל פרוטוקול של היצרן. Elute עם 30 μL nuclease ללא H 2 O (nfH 2 O).
    7. לטיפול eluate RNA עם ה-DNA ללא לכל פרוטוקול של היצרן. לאחר התגובה הושלמה, לחמם את המדגם ל -15 דקות ב 65 מעלות צלזיוס כדי להשבית לחלוטין את כל DNase הנותרים.
    8. השתמש 1 RNA μL לבודד היטב לכל לניתוח qRT-PCR כדי לאשר lncRNAאחזור. GAPDH משמש לעתים קרובות בקרת שלילית.

    8. בידוד ה-DNA

    לחלץ חלק דגימות דנ"א כדי לזהות ציוץ ידי רצף או לכמת ידי QPCR.

    1. הכן elution מאגר ה-DNA (ראה רשימת חיץ), 150 μl לפי המדגם, כולל תשומות ה-DNA.
    2. הוסף 1 0μL RNase (10 מ"ג / מ"ל) ו - 10 μL RNase H (10 U / μl) לכל מ"ל של elution מאגר ה-DNA, ואת המערבולת לערבב.
    3. Resuspend כל דגימה של חרוזים ב μL 150 מתוך מאגר ה-DNA elution עם RNases. (קלט Resuspend-DNA μL 140) דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עם רעד.
    4. חרוזים נפרדים supernatant על רצועת DynaMag 2-מגנטיים. הסר supernatant ולהוסיף צינורות שכותרתו.
    5. הכן aliquot השני של מאגר ה-DNA elution עם 10 μL RNase (10 מ"ג / מ"ל) ו RNaseH (10 U / μL) בדיוק כפי שנעשה ב 8.2). הוספת 150 μL מדגם זה (כולל כניסה DNA), דגירה, ולהסיר supernatant. לאסוף את כל supernatant (shoulד להיות ~ 300 μL).
    6. הוסף 15 קי μL מדגם זה. דגירה על 50 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות עם רעד.
    7. טרום ספין למטה הצהובים בשלב נעילת צינורות ג'ל (5PRIME). העברת דגימות DNA לשלב נעילת צינורות ג 'ל, ולהוסיף 300 PhOH μL: כלורופורם: Isoamyl לדגימה. לנער במרץ ל 10 דקות, ומסובב על צנטריפוגות benchtop ב 16100RCF דקות 5 ב 4 ° C. קח מימית מלמעלה (~ 300 μL). הוסף 3 GlycoBlue μL, 30 NaOAc μL, ו 900 EtOH 100% μL. מערבבים היטב בחנות ב -20 מעלות למשך הלילה.
    8. ספין דגימות 16100RCF למשך 30 דקות ב 4 ° C.
    9. Supernatant למזוג בזהירות. הוסף 1 מ"ל EtOH 70% ו מערבולת לערבב. מסובבים 16100RCF דקות 5. הסר supernatant ידי פיפטה. אוויר יבש על 1min. Resuspend ב EB 30 μL.
    10. דגימות DNA מוכנים לניתוח על ידי QPCR או הכנה של תפוקה גבוהה ספריות רצף לכל פרוטוקול Illumina.

    10. נציג תוצאות

    איור 1 תרשים 2 מציג העשרת telomerase RNA אנושי (TERC) מתאי הלה על GAPDH,-RNA סלולריים בשפע המשמשת בקרת שלילית. רוב RNAs TERC (~ 88%) הנמצאים בתא נשלפו על ידי ביצוע ציוץ, ואילו רק 0.46% מכלל GAPDH RNA אוחזר, הוכחת גורם העשרה של פי 200 ~. בדיקות ספציפי כגון בדיקות מיקוד LacZ RNA, אשר לא באה לידי ביטוי בתאי יונקים (איור 2), יכול לשמש בקרות שליליות נוספות.

    אזורי דנ"א צפויות לאגד lncRNA היעד מועשרים בדרך כלל על פני אזורים שליליות כאשר נמדד על ידי QPCR. איור 3 מציג אימות QPCR ארבעה HOTAIR הנכנס האתרים העיקריים fibroblasts העורלה האדם שקבענו על ידי ביצוע ציוץ-SEQ בתור אותו התא, בעוד TERC ו GAPDH DNA אתרים SErve כאזורים שליטה שליליות. גם "אפילו" ו החללית "מוזר" קובע העשרה דומה הניב של HOTAIR הנכנס אתרים הצפויים על פני אזורים שליליים, סימן ההיכר של lncRNA מחייבים אתרי אמיתיים.

    תפוקה גבוהה של רצף ה-DNA ציוץ מועשר מניב המפה העולמית של lncRNA מחייבים אתרים. LncRNA תסיסנית roX2 ידועה אינטראקציה עם כרומוזום ה-X באופן נדרש פיצוי המינון. איור 4 מראה roX2 פרופיל מחייב על קטע של כרומוזום X. שניהם "ואפילו" ואת "מוזר" דגימות כבר רצף ורעשים הייחודיים שלהם נמחקו לייצר מסלול של אותות חופפים. כל "הפסגה" כאן מציין אתר חזק של roX2 מחייב. מסלול מלא רשימת roX2 גני מטרה תוארו צ et al. 2011 17.

    באיור 1.
    1. תרשים זרימה תרשים של proce ציוץדורה. הכרומטין הוא crosslinked כדי lncRNA: adducts חלבון in vivo בדיקות ריצוף Biotinylated הם הכלאה למקד lncRNA, ואת מתחמי הכרומטין הם מטוהרים באמצעות חרוזים streptavidin מגנטיים, ואחריו שוטף מחמירים.. אנחנו elute DNA lncRNA כבול או חלבונים עם קוקטייל של Rnase וה 'רצף המשוערת lncRNA מחייב הוא schematized בכתום. פורסם בעבר צ'ו et al. 2011. 17

    איור 2.
    2. איור ציוץ מעשירה עבור האדם TERC RNA. TERC-asDNA בדיקות לאחזר ~ 88% הסלולר TERC רנ"א GAPDH לגילוי. LacZ-asDNA בדיקות משמשים בקרות שליליות ולאחזר לא על RNAs. ממוצע + SD מוצגים. פורסם בעבר צ'ו et al. 2011. 17

    איור 3.
    איור 3. HOTAIR ציוץ-QPCR ב האדם העיקריfibroblasts אסקין. NFKBIA, HOXD3-4, SERINC5 ו ABCA2 הם אזורים כי אינטראקציה עם HOTAIR. TERC ו GAPDH שימש בקרות שליליות. ממוצע + SD מוצגים. פורסם בעבר צ'ו et al. 2011. 17

    באיור 4.
    איור 4. ציוץ-SEQ נתונים של roX2 RNA בתאים Sl2 תסיסנית. "אפילו" ו "מוזר" היו רצף בנפרד; הנתונים שלהם משקפים רק במיזוג פסגות הנפוצות הן. המסלול מוצג הממוזג. פורסם בעבר צ'ו et al. 2011. 17

Discussion

כאן תיארנו ציוץ-seq, שיטת מיפוי באתרים ב vivo lncRNA מחייב הגנום כולו. הפרמטרים העיקריים להצלחה הם בריכות מפוצלים של ריצוף בדיקות oligonucleotide ו crosslinking glutaraldehyde. העיצוב של זיקה הבדיקות, הוא פשוט נתן את רצף הרנ"א ואינה דורשת ידע מוקדם על מבנה של RNA או תחומים פונקציונליים. ההצלחה שלנו עם roX2, TERC, ו HOTAIR - שלושה RNAs שונות למדי בשני המינים - מצביע על כך ציוץ-seq היא להכליל צפוי lncRNAs רבים. כמו עם כל הניסויים, פקדי טיפול ונכון נדרשים לפרש את התוצאות. LncRNA שונים עשויים לדרוש טיטרציה של התנאים, ושינוי מושכל של תנאים, כגון מבחר של בדיקות קרבה או crosslinkers שונים, עשוי להדגיש היבטים שונים של RNA-הכרומטין אינטראקציות. כמו SEQ-Chip, לא כל האירועים המחייבים הינם פונקציונלי בהכרח, ועל מחקרים נוספים נדרשים כדי לברר את ההשלכות הביולוגיות של RNA Occupancy על הכרומטין. עם זאת, אנו צופים יישומים מעניינים של טכנולוגיה זו עבור חוקרים של הכרומטין הקשורים lncRNAs אחרים, אשר כעת מספר אלפי 8,9. בדיוק כמו שבב ואילך פתחה את הדלת הגנום כולו החקירות של אינטראקציות חלבון דנ"א, ציוץ-seq מחקרים של "RNA interactome" עשוי לחשוף אפיקים חדשים רבים של הביולוגיה.

Disclosures

ס צ 'ו ח.י. צ'אנג נקראים כמו ממציאים על יישום פטנט על שיטה זו.

Acknowledgments

אנו מודים ט האנג, MC. צאי, א 'מנור, א' סגל, מ 'קארודה, ט Swigut, ואני Shestopalov לדיונים. נתמך על ידי הסוכנות למדע, טכנולוגיה ומחקר של סינגפור (CC), NIH R01-R01 ו-CA118750 HG004361 (HYC), וקליפורניה המכון לרפואה הרגנרציה (HYC). HYC הוא המדען הקריירה המוקדמת של הווארד יוז רפואי במכון.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Buffer List:
Dissolve a pellet of complete protease inhibitor in 1 ml water as 50x stock. Make 100 mM PMSF in isopropanol (100x stock). Superase-in is used as 200x stock. Store all at -20 °C.
Lysis Buffer:
50 mM Tris-Cl pH 7.0
10 mM EDTA
1% SDS
Always add PMSF, P.I. and Superase-in fresh before use except when washing beads
Proteinase K Buffer (for DNA)
100 mM NaCl
10 mM TrisCl pH 8.0 (For RNA use pH 7.0)
1 mM EDTA
0.5% SDS
Add 5% by volume Proteainse K (Ambion AM2546 20 mg/ml) fresh before use
Hybridization Buffer
750 mM NaCl
1% SDS
50 mM Tris-Cl pH 7.0
1 mM EDTA
15% formamide (store in the dark at 4 °C)
Always add PMSF, P.I. and Superase-in fresh before use
Wash Buffer
2x NaCl and Sodium citrate (SSC) (diluted from 20x SSC Invitrogen stock)
0.5% SDS
Always add PMSF fresh before use
DNA elution Buffer
50 mM NaHCO3
1% SDS
Table of specific reagents and equipment:
Glutaraldehyde (EM grade) Sigma-Aldrich G5882-10x10ml
Motorized pellet mixer VWR international V8185-904
Protease inhibitor Roche Group 11873580001
PMSF Sigma-Aldrich 78830
Superase-in Ambion AM2696
Bioruptor Diagenode UCD-200
Falcon tubes (for sonication) Corning 430790
Proteinase K Ambion AM2546
PCR purification kit Qiagen 28106
C-1 magnetic beads Invitrogen 65002
PMSF Sigma-Aldrich P7626-25G
DynaMag-15 magnet Invitrogen 123-01D
DynaMag-2 magnet Invitrogen 123-21D
MIRNeasy mini kit Qiagen 217004
Rnase H Epicentre Biotechnologies R0601K
Rnase A Sigma-Aldrich R4875-100MG
Phase Lock Gel Heavy 5 PRIME 2302810
Trizol Invitrogen 15596-018
Phenol:chloroform:Isoamyl Invitrogen 15593-031
Chloroform Ricca RSOC0020-1C
GlycoBlue Ambion AM9515
Glycine JT Baker 4057-06
PBS, pH 7.4 Invitrogen 10010-049
Elution Buffer (EB) Qiagen 19086
20x SSC Invitrogen 15557-036
10% SDS Invitrogen 15553-027
DNA-free Ambion AM1906
Buffer kit Ambion AM9010
Formamide Invitrogen 15515-026

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Koziol, M. J., Rinn, J. L. RNA traffic control of chromatin complexes. Curr. Opin. Genet. Dev. 20, 142-148 (2010).
  2. Mercer, T. R., Dinger, M. E., Mattick, J. S. Long non-coding RNAs: insights into functions. Nat. Rev. Genet. 10, 155-159 (2009).
  3. Rinn, J. L. Functional demarcation of active and silent chromatin domains in human HOX loci by noncoding RNAs. Cell. 129, 1311-1323 (2007).
  4. Zhao, J., Sun, B. K., Erwin, J. A., Song, J. J., Lee, J. T. Polycomb proteins targeted by a short repeat RNA to the mouse X chromosome. Science. 322, 750-756 (2008).
  5. Kelley, R. L. Epigenetic spreading of the Drosophila dosage compensation complex from roX RNA genes into flanking chromatin. Cell. 98, 513-522 (1999).
  6. Pandey, R. R. Kcnq1ot1 antisense noncoding RNA mediates lineage-specific transcriptional silencing through chromatin-level regulation. Mol. Cell. 32, 232-246 (2008).
  7. Wang, K. C. A long noncoding RNA maintains active chromatin to coordinate homeotic gene expression. Nature. 472, 120-124 (2011).
  8. Khalil, A. M. Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 11667-11672 (2009).
  9. Zhao, J. Genome-wide identification of polycomb-associated RNAs by RIP-seq. Mol. Cell. 40, 939-953 (2010).
  10. Meller, V. H., Wu, K. H., Roman, G., Kuroda, M. I., Davis, R. L. roX1 RNA paints the X chromosome of male Drosophila and is regulated by the dosage compensation system. Cell. 88, 445-457 (1997).
  11. Franke, A., Baker, B. S. The rox1 and rox2 RNAs are essential components of the compensasome, which mediates dosage compensation in Drosophila. Mol. Cell. 4, 117-122 (1999).
  12. Gupta, R. A. Long non-coding RNA HOTAIR reprograms chromatin state to promote cancer metastasis. Nature. 464, 1071-1076 (2010).
  13. Tsai, M. C. Long noncoding RNA as modular scaffold of histone modification complexes. Science. 329, 689-693 (2010).
  14. Zappulla, D. C., Cech, T. R. RNA as a flexible scaffold for proteins: yeast telomerase and beyond. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol.. 71, 217-224 (2006).
  15. Nagano, T. The Air noncoding RNA epigenetically silences transcription by targeting G9a to chromatin. Science. 322, 1717-1720 (2008).
  16. Carter, D., Chakalova, L., Osborne, C. S., Dai, Y. F., Fraser, P. Long-range chromatin regulatory interactions in vivo. Nature. 32, 623-626 (2002).
  17. Chu, C., Qu, K., Zhong, F. L., Artandi, S. E., Chang, H. Y. Genomic Maps of Long Noncoding RNA Occupancy Reveal Principles of RNA-Chromatin Interactions. Mol. Cell. (2011).
  18. Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat. Methods. 5, 877-879 (2008).
בידוד הכרומטין על ידי טיהור RNA (ציוץ)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chu, C., Quinn, J., Chang, H. Y. Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP). J. Vis. Exp. (61), e3912, doi:10.3791/3912 (2012).More

Chu, C., Quinn, J., Chang, H. Y. Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP). J. Vis. Exp. (61), e3912, doi:10.3791/3912 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter