1. החללית עיצוב נגד חוש עיצוב ריצוף ה-DNA בדיקות לאחזור סלקטיבית של RNA המטרה על ידי ציוץ. נגד חוש עיצוב oligo בדיקות באמצעות מעצב בדיקה באינטרנט singlemoleculefish.com 18. השתמש פרמטרים: מספר בדיקות = 1 בדיקה / 100 נ"ב באורך RNA; 2) יעד GC% = 45, 3) אורך oligonucleotide = 20, 4) אורך מרווח = 60-80. לשבור RNA למקטעים אם יותר מדי זמן עבור מעצב. השמט אזורי חוזר או הומולוגיה נרחבת. נגד תחושת סדר בדיקות דנ"א עם BiotinTEG בסוף 3-הממשלה. תווית בדיקות על פי עמדותיהם לאורך RNA. להפריד אותם לשתי בריכות, כך הבריכה ", גם" מכיל את כל בדיקות מספור 2, 4, 6, וכו 'בריכת "מוזר" כולל בדיקות המונים 1, 3, 5 וכו' מדולל מאגר של בדיקות לריכוז 100 מיקרומטר ו החנות ב -20 ° C. כל הניסויים שיבוצעו באמצעותשתי בריכות, המהווים הבקרות הפנימיות זה לזה. אות אמיתי RNA תלוי יהיה נוכח מבריכות הצדדים, תוך בדיקה ספציפיים רעשים יהיה ייחודי כל מאגר. זה חל גם על ציוץ ו-QPCR ציוץ-seq. 2. קציר תאים איסוף תאים שישמשו לניסוי ציוץ. לגדל תאים בתרבית רקמה צלחות או צלוחיות ל confluency. יש לשטוף עם פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) פעם אחת trypsinize. להרוות טריפסין עם נפח> 2x של התקשורת, פיפטה למעלה ולמטה כדי לסלק תאים resuspend אל ההשעיה תא בודד. להעביר את כל המדיה ותאי resuspended לתוך צינורות 50 מ"ל פלקון. 20 מיליון תאים הם בדרך כלל די מדגם ציוץ אחד. ספין תאים ב 800RCF דקות 4. התקשורת aspirate ו resuspend 40 מיליון תאים של 40 מ"ל של PBS, לשלב צינורות במידת הצורך. ספין תאים ב 800RCF דקות 4. למזוג PBS, לשאוב היטב על זווית את הנוזל הנותר. </ol> 3. חוצה קישור תאים איסוף Cell גלולה Crosslink אספו תאים עם glutaraldehyde לשמר RNA-הכרומטין אינטראקציות ולהכין תא גלולה. לבצע את כל הפעולות בטמפרטורת החדר. הכן glutaraldehyde 1% בטמפרטורת החדר PBS. הכן 10 מ"ל לכל 10 מיליון תאים (0.4 מ"ל glutaraldehyde המניה 25% + 9.6 מ"ל PBS). Glutaraldehyde יש להשתמש טרי. לחץ התחתון של צינורות פלקון כדי לסלק כדורי. Resuspend תא גלולה ב glutaraldehyde 1%, החל בנפח קטן, כדי למנוע גושים, ואחר כך למעלה עד נפח מלא. הפוך לערבב. Crosslink עבור 10min בטמפרטורת החדר על הקצה לקצה שייקר או הכתף. להרוות את התגובה cross-linking עם נפח 1/10th של 1.25 מ 'גליצין בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. מסובבים 2000RCF דקות 5. Aspirate supernatant ולהתרחץ גלולה עם 20 מ"ל צינן PBS פעם אחת, מסתובב ב 2000RCF במשך 5 דקות. Aspirate ו resuspend Washed, צולבים גלולה עם 1 מ"ל PBS צונן לכל 20 מיליון תאים. להעביר את כל מ"ל למבחנה Eppendorf ו ספין על 2000RCF דקות 3 ב 4 ג הסר PBS ככל האפשר עם קצה פיפטה בזהירות. Flash-להקפיא את כדורי סלולריים בחנקן נוזלי חנות ב -80 ° C ללא הגבלת זמן. 4. תא תמוגה Lyse תאים crosslinked להכין lysate התא. להפשיר כדורי סלולריים קפואים בטמפרטורת החדר. הקש קשה לעקור ומערבבים תא גלולה. ספין למטה גלולה ב 2000RCF דקות 3 ב 4 ° C. השתמש קצה חד פיפטה 10 μl להסיר כל PBS הנותרים. על יתרת אלקטרוני (ומדויק במינון של 1) טרה המונית של צינור Eppendorf ריק (צינורות שלנו שוקל 1.060 גרם מאוד עקבי). לשקול כל גלולה ולהקליט את משקלו. צלחת מלאה 15 ס"מ של תאים הלה crosslinked בדרך כלל שוקל 100 מ"ג. תמוגה מאגר מוסף (10X המוני של גלולה, 1 מ"ל למשל עבור 100 מ"ג) עם fresH פרוטאז מעכב, PMSF ו Superase-in (ראו רשימה חיץ המצורפת). מערבבים היטב. הוספת נפח 10X בתוספת מאגר תמוגה לצינור כל resuspend גלולה. עבור כדוריות קטנות <25 מ"ג, resuspend במאגר תמוגה μl 250 בתוספת. ההשעיה צריכה להיות חלקה. אם לא, לחלק את ההשעיה תוך 500 aliquots μl ולהשתמש גלולה ממונע מערבל להיפרד גושים. לפנות מיד sonication. 5. Sonication ה-DNA על ידי גזירה sonicating lysates סלולריים crosslinked. Sonicate lysate תא Bioruptor ב -15 צינורות מ"ל פלקון. השתמש <1.5 lysate מ"ל בצינור אחד, ועל sonication מהר יותר, sonicate לא יותר מ 2 צינורות בכל פעם. Sonicate ב אמבטיה 4 C ° המים ההגדרה הגבוהה ביותר עם 30 שניות על, 45 שניות את מרווחי הדופק. בדוק lysate כל 30 דקות. המשך sonicating עד lysate התא לעכור עוד. זה עלול לקחת קצת כמו 30 דק 'ו רבים כמו 4 שעות. מספרשל צינורות, נפח דגימה, טמפרטורת אמבטיה, פרק הזמן sonication ישפיע כמה זמן טיפול כזה נמשך. סביר להניח צינורות sonicate בקצב שונה, כך בריכה אותם יחד כל 30 דקות להפיץ מחדש אל תוך צינורות המקוריים על מנת להבטיח אחידות. הערה: glutaraldehyde-crosslinked תאים לקחת זמן רב יותר באופן משמעותי מאשר sonicate ושווי פורמלדהיד. כאשר lysate הופכת ברורה, להעביר 5 lysate μL לצינור Eppendorf טרי. הוסף 90 μL פרוטאז ה-DNA K (PK) מאגר (ראה רשימת חיץ) ו 5 קי μL. מערבולת לערבב ומסובב את בקצרה. דגירה של 45 דק 'ב 50 ° C. תמצית ה-DNA עם ערכת טיהור PCR Qiagen. ה-DNA Elute במאגר 30 Qiagen μL elution (EB) וסמנו את גודל ה-DNA על 1% agarose ג'ל. אם עיקר למרוח את ה-DNA הוא 100-500 BP, sonication הושלמה. אם לא, ממשיכים sonicate. סרכזת דגימות sonicated ב 16100RCF במשך 10 דקות ב 4 ° C. שלב supernatants, aliquot אל 1 דוגמאות מ"ל ו-Flash הקפאת nitroge נוזליn. חנות ב -80 ° C. 6. ציוץ להכליא בדיקות דנ"א biotinylated ל RNA ולבודד הכרומטין מאוגד. ההפשרה צינורות של הכרומטין בטמפרטורת החדר. הכינו מאגר הכלאה (ראה רשימת חיץ, להכין 2 מ"ל לכל מ"ל של הכרומטין). מערבולת לערבב. למדגם ציוץ טיפוסי באמצעות 1 מ"ל של lysate, להסיר 10 μL עבור קלט RNA ו 10 μL עבור קלט DNA ומניחים צינורות Eppendorf. שמור על הקרח עד לשימוש נוסף. מעבירים 1 הכרומטין מ"ל למבחנה 15 מ"ל פלקון. הוסף 2 מ"ל הכלאה מאגר לצינור אחד. עבור הנפח הכולל <1.5 מ"ל, השתמש צינורות Eppendorf. בדיקות להפשיר בטמפרטורת החדר. בדיקות Nanodrop כדי לבדוק כמות אם לא השתמשו בו זמן רב (100 מיקרומטר בדיקות צריך spec ~ 500-600 ng / μl באמצעות הגדרה אחת גדיל DNA). להוסיף נפח מתאים של בדיקות כדי צינורות ספציפיים (100 pmol בדיקה לכל 1 מ"ל הכרומטין, 1 μL של החללית pmol / μL 100 מ"ל לכל 1 הכרומטין).מערבבים היטב. דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות עם רעד. עם 20 דקות נותרו על ההכלאה, להכין את החרוזים C-1 (מגנטי המאוחסן ב 4 ° C). השתמש 100 μL לכל pmol 100 של בדיקות. לשטוף עם 1 מאגר unsupplemented תמוגה מ"ל שלוש פעמים, תוך שימוש ברצועת DynaMag-2 מגנט חרוזים נפרדים מן המאגר. חרוזים Resuspend בנפח המקורית של מאגר תמוגה, עם תוספת חדשה PMSF, PI ו Superase-in. לאחר 4 שעות הכלאה התגובה הושלמה, להוסיף 100 חרוזים μL לצינור אחד. מערבבים היטב. דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עם רעד. הכינו מאגר לשטוף (5 מ"ל לדגימה). מערבולת לערבב. טרום חמים 37 ° C. הוסף PMSF לפני השימוש. לשטוף עם חרוזים חיץ מ"ל 1 לשטוף חמש פעמים. על הכביסה הראשונה, השתמש DynaMag-15 פס מגנטי כדי חרוזים שונים, למזוג, ו resuspend במאגר 1 לשטוף מ"ל. להעביר את נפח צינור 1.5 Eppendorf מ"ל. דגירה על 37 מעלות צלזיוס עם רעד במשך 5 דקות. על שוטף לאחר מכן, ספין למטה כל צינור על minicentrifuge, עותק לדוגמה על רצועת DynaMag 2-המגנטי דקות 1. מדגם לערות, לנגב טיפות עם Kimwipe, resuspend במאגר מ"ל 1 הכביסה. דגירה על 37 מעלות צלזיוס עם רעד במשך 5 דקות. חזור על חמש שוטף הכל. על הכביסה האחרון, resuspend את החרוזים גם כן. הסרה של 100 μL ומניחים בצד על בידוד RNA. שמורת 900 μL עבור חלק ה-DNA. מניחים את כל צינורות על רצועת-2 DynaMag מגנטי ולהסיר חיץ כביסה. לסובב את כל צינורות למטה בקצרה, ומניחים אותם על רצועת מגנט. הסר את החלק האחרון של המאגר לשטוף לחלוטין עם קצה חד פיפטה 10 μl. 7. בידוד RNA לחלץ חלק מ-RNA דגימות ציוץ כדי לכמת ידי qRT-PCR. קח 100 דגימות חרוזים μL ו 10 μL מדגם RNA תשומות. הוסף 85 μL RNA pH קי מאגר 7.0 ל RNA תשומות. חרוזים Resuspend ב 95 μL רנ"א ה-pH 7.0 קי מרימה יד המאגר. הוסף 5 K Proteinease דגירה μL ובו 50 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות עם מקצה לקצה רועד. בקצרה לסובב את כל הצינורות ולהרתיח דגימות של 10 דקות על גוש חום על 95 ° C. לצנן על דגימות קרח, להוסיף 500 מערבולת μL, TRIzol במרץ עבור 10 שניות. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. חנות ב -80 ° C או המשך לשלב 4. הוספת 100 כלורופורם μL קטעים שטופלו TRIzol. מערבולת במרץ עבור 10 שניות. מסובבים 16100RCF על צנטריפוגות benchtop במשך 15 דקות ב 4 ° C. הסר ~ 400 supernatant מימית μL, הימנעות אורגני ממשק. הוסף μL 600 (1.5 נפח) אתנול 100% ומערבבים היטב. ספין מדגם באמצעות עמודות מיני MIRNeasy. לשטוף עם RWT 1x (MIRNeasy מיני קיט), 2x עם הרשתית לכל פרוטוקול של היצרן. Elute עם 30 μL nuclease ללא H 2 O (nfH 2 O). לטיפול eluate RNA עם ה-DNA ללא לכל פרוטוקול של היצרן. לאחר התגובה הושלמה, לחמם את המדגם ל -15 דקות ב 65 מעלות צלזיוס כדי להשבית לחלוטין את כל DNase הנותרים. השתמש 1 RNA μL לבודד היטב לכל לניתוח qRT-PCR כדי לאשר lncRNAאחזור. GAPDH משמש לעתים קרובות בקרת שלילית. 8. בידוד ה-DNA לחלץ חלק דגימות דנ"א כדי לזהות ציוץ ידי רצף או לכמת ידי QPCR. הכן elution מאגר ה-DNA (ראה רשימת חיץ), 150 μl לפי המדגם, כולל תשומות ה-DNA. הוסף 1 0μL RNase (10 מ"ג / מ"ל) ו – 10 μL RNase H (10 U / μl) לכל מ"ל של elution מאגר ה-DNA, ואת המערבולת לערבב. Resuspend כל דגימה של חרוזים ב μL 150 מתוך מאגר ה-DNA elution עם RNases. (קלט Resuspend-DNA μL 140) דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עם רעד. חרוזים נפרדים supernatant על רצועת DynaMag 2-מגנטיים. הסר supernatant ולהוסיף צינורות שכותרתו. הכן aliquot השני של מאגר ה-DNA elution עם 10 μL RNase (10 מ"ג / מ"ל) ו RNaseH (10 U / μL) בדיוק כפי שנעשה ב 8.2). הוספת 150 μL מדגם זה (כולל כניסה DNA), דגירה, ולהסיר supernatant. לאסוף את כל supernatant (shoulד להיות ~ 300 μL). הוסף 15 קי μL מדגם זה. דגירה על 50 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות עם רעד. טרום ספין למטה הצהובים בשלב נעילת צינורות ג'ל (5PRIME). העברת דגימות DNA לשלב נעילת צינורות ג 'ל, ולהוסיף 300 PhOH μL: כלורופורם: Isoamyl לדגימה. לנער במרץ ל 10 דקות, ומסובב על צנטריפוגות benchtop ב 16100RCF דקות 5 ב 4 ° C. קח מימית מלמעלה (~ 300 μL). הוסף 3 GlycoBlue μL, 30 NaOAc μL, ו 900 EtOH 100% μL. מערבבים היטב בחנות ב -20 מעלות למשך הלילה. ספין דגימות 16100RCF למשך 30 דקות ב 4 ° C. Supernatant למזוג בזהירות. הוסף 1 מ"ל EtOH 70% ו מערבולת לערבב. מסובבים 16100RCF דקות 5. הסר supernatant ידי פיפטה. אוויר יבש על 1min. Resuspend ב EB 30 μL. דגימות DNA מוכנים לניתוח על ידי QPCR או הכנה של תפוקה גבוהה ספריות רצף לכל פרוטוקול Illumina. 10. נציג תוצאות איור 1 </strong> מתאר את זרימת העבודה ציוץ. הניסוי המוצלח בדרך כלל ציוץ מעשיר RNA היעד באופן משמעותי על שאינם ספציפיים RNAs. תרשים 2 מציג העשרת telomerase RNA אנושי (TERC) מתאי הלה על GAPDH,-RNA סלולריים בשפע המשמשת בקרת שלילית. רוב RNAs TERC (~ 88%) הנמצאים בתא נשלפו על ידי ביצוע ציוץ, ואילו רק 0.46% מכלל GAPDH RNA אוחזר, הוכחת גורם העשרה של פי 200 ~. בדיקות ספציפי כגון בדיקות מיקוד LacZ RNA, אשר לא באה לידי ביטוי בתאי יונקים (איור 2), יכול לשמש בקרות שליליות נוספות. אזורי דנ"א צפויות לאגד lncRNA היעד מועשרים בדרך כלל על פני אזורים שליליות כאשר נמדד על ידי QPCR. איור 3 מציג אימות QPCR ארבעה HOTAIR הנכנס האתרים העיקריים fibroblasts העורלה האדם שקבענו על ידי ביצוע ציוץ-SEQ בתור אותו התא, בעוד TERC ו GAPDH DNA אתרים SErve כאזורים שליטה שליליות. גם "אפילו" ו החללית "מוזר" קובע העשרה דומה הניב של HOTAIR הנכנס אתרים הצפויים על פני אזורים שליליים, סימן ההיכר של lncRNA מחייבים אתרי אמיתיים. תפוקה גבוהה של רצף ה-DNA ציוץ מועשר מניב המפה העולמית של lncRNA מחייבים אתרים. LncRNA תסיסנית roX2 ידועה אינטראקציה עם כרומוזום ה-X באופן נדרש פיצוי המינון. איור 4 מראה roX2 פרופיל מחייב על קטע של כרומוזום X. שניהם "ואפילו" ואת "מוזר" דגימות כבר רצף ורעשים הייחודיים שלהם נמחקו לייצר מסלול של אותות חופפים. כל "הפסגה" כאן מציין אתר חזק של roX2 מחייב. מסלול מלא רשימת roX2 גני מטרה תוארו צ et al. 2011 17. 1. תרשים זרימה תרשים של proce ציוץדורה. הכרומטין הוא crosslinked כדי lncRNA: adducts חלבון in vivo בדיקות ריצוף Biotinylated הם הכלאה למקד lncRNA, ואת מתחמי הכרומטין הם מטוהרים באמצעות חרוזים streptavidin מגנטיים, ואחריו שוטף מחמירים.. אנחנו elute DNA lncRNA כבול או חלבונים עם קוקטייל של Rnase וה 'רצף המשוערת lncRNA מחייב הוא schematized בכתום. פורסם בעבר צ'ו et al. 2011. 17 2. איור ציוץ מעשירה עבור האדם TERC RNA. TERC-asDNA בדיקות לאחזר ~ 88% הסלולר TERC רנ"א GAPDH לגילוי. LacZ-asDNA בדיקות משמשים בקרות שליליות ולאחזר לא על RNAs. ממוצע + SD מוצגים. פורסם בעבר צ'ו et al. 2011. 17 איור 3. HOTAIR ציוץ-QPCR ב האדם העיקריfibroblasts אסקין. NFKBIA, HOXD3-4, SERINC5 ו ABCA2 הם אזורים כי אינטראקציה עם HOTAIR. TERC ו GAPDH שימש בקרות שליליות. ממוצע + SD מוצגים. פורסם בעבר צ'ו et al. 2011. 17 איור 4. ציוץ-SEQ נתונים של roX2 RNA בתאים Sl2 תסיסנית. "אפילו" ו "מוזר" היו רצף בנפרד; הנתונים שלהם משקפים רק במיזוג פסגות הנפוצות הן. המסלול מוצג הממוזג. פורסם בעבר צ'ו et al. 2011. 17