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Medicine

Développement de la bronchiolite oblitérante dans un modèle murin de transplantation pulmonaire orthotopique

doi: 10.3791/3947 Published: July 10, 2012

Summary

Bronchiolite oblitérante est le principal obstacle à la survie à long terme des greffés du poumon et de l'absence d'un modèle robuste préclinique empêche l'examen immunopathogenèse bronchiolite oblitérante. Contrairement à d'autres transplantations d'organes solides, vascularisée de la souris la transplantation pulmonaire n'a été que récemment mis au point. Ici, nous montrons notre modèle développé indépendamment bronchiolite oblitérante après murin orthotopique simple transplantation pulmonaire.

Abstract

Transplantation pulmonaire orthotopique chez le rat a été d'abord rapporté par Asimacopoulos et collègues en 1971 1. Actuellement, cette méthode est bien acceptée et normalisée, non seulement pour l'étude d'allo-rejet, mais aussi entre les souches syngéniques pour examiner les mécanismes de l'ischémie-reperfusion après transplantation pulmonaire. Bien que l'application du rat et un autre modèle animal de grande taille 2 a contribué de manière significative à l'élucidation de ces études, la portée de ces enquêtes est limitée par la rareté des huitièmes de finale et les rats transgéniques. En raison de plus de traitements efficaces pour la bronchiolite oblitérante, la principale cause de décès chez les patients transplantés pulmonaires, il ya eu une recherche intensive de modèles pré-cliniques qui répliquent la bronchiolite oblitérante. Le modèle d'allogreffe trachéale est la plus largement utilisée et peut la reproduire quelques-unes des caractéristiques histopathologiques de la bronchiolite oblitérante 3. Toutefois, l'absence d'un vasculat intacteure sans aucun lien avec la conduite des voies respiratoires du destinataire, et incomplètes caractéristiques pathologiques de la bronchiolite oblitérante limiter l'utilité de ce modèle 4. Contrairement à la transplantation d'autres organes solides, des greffes vascularisées poumon de souris ont récemment été signalés par Okazaki et ses collègues pour la première fois en 2007 5. Appliquant les principes de base de la transplantation pulmonaire chez le rat, notre laboratoire a lancé le modèle en utilisant la bronchiolite oblitérante mineures histoincompatible antigènes murins orthotopiques transplantations pulmonaires unique gauche, qui permet l'étude plus approfondie de l'immunopathogenèse bronchiolite oblitérante 6.

Protocol

1. Procédure des donateurs

  1. Toutes les interventions chirurgicales ont été effectuées en utilisant une technique stérile. Pas d'antibiotiques sont donnés à la fois les donateurs et les souris receveuses.
  2. L'induction de l'anesthésie de la souris donneuse est initiée avec 5% isoflurane.
  3. La souris est orotracheally intubé avec un cathéter de calibre 20 par voie intraveineuse, puis placé sur un ventilateur de rongeurs, en utilisant 100% d'oxygène à un débit de 125 respirations par minute et environ 0,5 ml de volume de marée (2% de son poids corporel).
  4. L'anesthésie est maintenue avec l'isoflurane 1-2% par inhalation.
  5. La souris donneuse est placé dans une position couchée, préparée avec de l'alcool 70%.
  6. Laparosternotomy est effectuée comme une ligne médiane et incision transversale combinée.
  7. Héparine à 100 u / kg est injecté dans la veine cave inférieure (VCI), juste en dessous du foie.
  8. Le diaphragme est coupée le long de la côtière d'attache ventral vers la colonne vertébrale, et la cavité thoracique est exposée en coupant les deux côtés de la poitrinemur pour le cou.
  9. Après incision de la veine cave inférieure au niveau de la membrane, l'appendice auriculaire droit est coupé et les poumons rincée avec 2 ml de refroidissement (4 ° C) lactate de Ringer pour l'injection et 0,1 ml d'héparine par une incision transversale au niveau de la racine de l'artère pulmonaire ( PA) du tronc.
  10. Arrêter la ventilation moins les deux tiers de l'inflation en fin d'expiration, le bloc cœur-poumon est excisé et stocké sur de la glace (4 ° C).
  11. Le poumon gauche du donneur est préparé pour le destinataire par l'attachement des poignets. Le ligament pulmonaire est incisé jusqu'à la veine pulmonaire (PV). Le hile est mis en évidence en enlevant l'œsophage et l'aorte.
  12. Identifier l'Autorité palestinienne, situé à l'aspect le plus crânienne du hile, ainsi que les bronches principales ci-jointes (Br). Disséquer soigneusement l'Autorité palestinienne de la bronche.
  13. Manchette PA est faite à partir d'un de calibre 24 par voie intraveineuse (IV) du cathéter et couper à 0,5 mm de longueur avec une extension de 0,7 mm.
  14. Toute la surface de la manchette est ensuite abrasée pour faciliter anastomosetoxoplasmose.
  15. La manchette pour la bronche est dérivé d'un cathéter de calibre 20 IV, et couper une longueur de 1,0 mm avec une extension de 0,7 mm.
  16. En utilisant les mêmes matériaux, le brassard PV varie avec le poids de la souris donneuse. Plus précisément, pour les souris 24-27 grammes de la taille du brassard est de calibre 22, 0,7 mm de longueur avec une extension de 0,7 mm. Pour les souris pesant 27-32 grammes, les études ont utilisé un cathéter de calibre 20 qui est de 0,7 mm de longueur avec une extension de 0,7 mm.
  17. Les poignets sont insérées dans les extrémités distales de la PA, PV et Br et fixé avec un fil de suture 9-0.
  18. Le poumon d'un donneur est vidé et lavé avec une solution saline stérile avec de l'héparine stérile avant l'entreposage. Le poumon d'un donneur est ensuite enveloppé de gaze stérile trempée dans une solution saline stérile sur la glace (4 ° C), qui maintient le poumon très propre et stérile.
  19. Dispositif de serrage microvaisseaux est placé sur la bronche pour empêcher l'entrée lactate de Ringer dans les voies respiratoires.

2. Procédure bénéficiaire

  1. Induction de l'anesthésieanesthésie et de ventilation mécanique sont les mêmes que celles décrites ci-dessus pour le donateur.
  2. La paroi thoracique gauche est rasée et avec de l'alcool 70% et le champ opératoire est drapée.
  3. Une incision de thoracotomie est faite dans l'espace intercostal gauche troisième, qui s'étend de l'incision dorsale près de la colonne vertébrale, et une pince microvaisseaux placé sur les vaisseaux pulmonaires gauches et des bronches adjacentes au cœur. Vous pouvez voir PA à l'aspect du crâne, PV à l'extrémité caudale du hile et Br entre eux.
  4. En utilisant une légère traction sur la pince hémostatique de provoquer des tensions doux sur la PA, Br et PV, le poumon gauche est sorti de la cavité thoracique, tout en laissant les structures hilaires centrales serré.
  5. Le PA, PV et Br sont isolés par dissection suivie en plaçant un fil de suture 9-0 positionné de façon lâche autour du PA, PV et Br.
  6. Après dissection de la PA complètement de sa gaine adventice, une petite incision transversale d'environ un quart de la circonférence de la cuve estfaite dans la paroi antérieure, laissant la poursuite de la partie dorsale de l'artère intacte.
  7. Le poumon d'un donneur, enveloppé dans le froid, la gaze de coton imbibé de lactate de Ringer et préparé comme décrit ci-dessus, est ensuite placé dans la cavité thoracique, et les poignets inséré dans le récipient PA, PV et Br et sécurisé avec 9-0 suture.
  8. Le clampage hilaire est supprimé permettant de reperfusion et de ventilation.
  9. Après avoir positionné le poumon greffé de nouveau dans le thorax du destinataire, l'incision de thoracotomie est fermée à l'aide d'une suture 5-0.
  10. La souris est autorisé à remettre de l'anesthésie. La buprénorphine (de 0,05 à 0,15 mg / kg) est administré immédiatement après la chirurgie, et pour toutes les 8 heures pour 2-3 jours post-opératoires.

3. Les résultats représentatifs

Notre expérience nous a appris qu'il nécessite plusieurs mois de pratique répétée pour devenir compétent dans le modèle de transplantation de la souris du poumon. Après de compétence est atteint, nous achieved un taux de survie de 96% (96/100 chirurgies consécutives) périopératoire avec les décès survenus dans les sept jours après l'opération. Deux décès étaient dus à une hémorragie qui a commencé pendant l'opération, et pneumothraces étaient la cause du décès dans les deux autres souris. Pour toutes les procédures, le temps d'ischémie chaude était 14,32 ± 3,14 minutes, et le temps d'ischémie froide était 58,51 ± 18,06 minutes. Trois groupes de orthotopiques greffe de poumon ont été étudiés: isograft: C57BL / 6 → C57BL / 6, allogreffe: C57BL/10 → C57BL / 6 et C57BL / 6 → C57BL/10. Nous avons utilisé uniquement chez les souris mâles, mais notre technique peut aussi être appliqué à des souris femelles, car il n'y a pas de différence significative anatomique entre les sexes.

Classement de rejet autopsie n'a été pratiquée en aveugle en utilisant des critères standard pour la transplantation du poumon clinique 7 (Tableau 1). Alors que nous avons observé le rejet légère ou pas isograft (C57BL / 6 → C57BL / 6), les deux combinaisons d'allogreffes développé sociétésrable rejet aigu ou chronique (figure 1). En revanche, OB était significativement plus fréquente dans le C57BL/10 → C57BL / 6 que C57BL / 6 → C57BL/10 groupe par day28 (tableau 1).

C57BL / 6 →
C57BL / 6
C57BL/10 →
C57BL / 6
C57BL / 6 →
C57BL/10
Valeur de P
Rejet pathologie
"A" note au jour 28
0,67 ± 0,89 * 3,33 ± 0,82 * 3,29 ± 0,76 * P> 0,05
OB / souris au jour Total des 21 et 28 0/24 (0%) ** 14/34 (42,1%) ** 2/16 (12,5%) ** P <0,05

Tableau 1. Scores histologiques de rejet aigu et la prévalence de la greffe de la bronchiolite oblitérante après. Notation de rejet aigu ("A" Scores) par la norme crisetères, comme décrit dans les résultats représentatifs. Les données représentent la moyenne ± écart-type de "A" scores à la transplantation jours après 28. Les données représentent la quantité et le pourcentage de souris de chaque groupe qui se sont développées OB aux jours 21 et 28 suivant la transplantation.

Figure 1
Figure 1. Des résultats macroscopiques et histopathologiques à 28 jours la transplantation du poumon après. Groupe 1A représentent les résultats macroscopiques et H & E du poumon Isograft teinté et le poumon droit naïf. 1B et 1C Groupe représente H & E et de Masson trichrome teinté BL/10 allogreffe du poumon transplanté dans la souris destinataire BL / 6, qui a développé OB OB et non, respectivement. La flèche blanche dans 1B identifie des lésions de l'OB. 1D Groupe montre une allogreffe du poumon BL / 6 transplantées dans BL/10 destinataire de la souris.

Dépannage principale au cours de la procédure sont les suivantes.

  1. Trouble flux sanguin: poumon d'un donneur Flush jusqu'aula couleur devient de couleur blanche. L'utilisation de la pression excessive pourrait provoquer un œdème pulmonaire. Mais ne poussez pas trop pour éviter l'œdème après la transplantation.
  2. Difficulté d'insertion du brassard à la donneuse: S'assurer que le système vasculaire est d'une longueur suffisante et sans joints les tissus adipeux et conjonctif.
  3. Saignement au site anastomotique: Utiliser des embouts de Q à appliquer une pression au site affecté pendant environ 5 minutes.
  4. Destinataire PA obstruction d'écoulement du sang: Généralement provoquée par la torsion de la manchette au cours d'insertion. Si l'air est observée au sein de l'Autorité palestinienne, puis refaire de l'anastomose est nécessaire.
  5. Difficile anastomose PV: Membrane de PV est très mince et facilement des larmes. Sélectionnez la taille du brassard appropriée et insérez-le droit au PV du destinataire très doucement.
  6. Récipiendaire PV obstruction du débit sanguin: Assurez-vous que la position et la direction du brassard. Relâchez la compression de la coiffe des bronches.
  7. Pneumothorax: Cela peut être causé par la perforation bronchique soit en raison de manipulation des voies respiratoires, ou de perforation de la surface du poumon dû à un traumatisme associé à la procédure de transplantation. La première est traitée avec la fermeture chirurgicale du trou dans la paroi des voies aériennes, et ce dernier est traité par la fuite surjet sur la surface du poumon à l'aide 10-0 fil de nylon.

Discussion

Transplantation pulmonaire orthotopique chez la souris est difficile en raison des exigences microchirurgicales et de la fragilité extrême de tissus. Introduction de la technique du brassard a permis pour l'utilisation généralisée de la transplantation pulmonaire orthotopique chez le rat 8. Cela est devenu la base pour le développement du modèle de transplantation pulmonaire orthotopique chez la souris dans notre laboratoire. Chez les souris et les rats, contrairement aux humains, le poumon gauche contient un seul lobe et ne représente que 25% de la masse pulmonaire totale. Cela rend la transplantation pulmonaire gauche seule possible dans le modèle murin, sans la nécessité d'un système d'assistance circulatoire.

Nos interventions chirurgicales préliminaires ont révélé que la ventilation et la perfusion du poumon transplanté était fortement dépendante de la taille de PV anastomose. Spécifique taille PV brassard anastomotique ont été utilisés pour correspondre à des bailleurs de fonds et les bénéficiaires tel que rapporté 9. Manchette inapproprié dimensionnement a résulté en une atélectasie du poumon transplanté ou déhiscence de la ANAST PVomosis. Okazaki et al ont rapporté l'utilisation de ligature des vaisseaux combinée et la coupure de 5 bronches. Dans l'étude actuelle, nous utilisons un clip à anévrisme de toutes les structures hilaires, que nous proposons peut raccourcir le temps d'ischémie chaude. Une limitation de la greffe du poumon gauche orthotopique dans le modèle murin est que les animaux peuvent survivre après bénéficiaires allo-immune à médiation nécrose de leurs allogreffes 5. Par conséquent, les études de survie ne sont pas réalisables et d'évaluation du greffon dépend sur l'examen histologique du poumon transplanté 10.

En utilisant cette technique, nous avons développé un modèle préclinique de bronchiolite oblitérante chez la souris. Plus précisément, la souris donneuse est C57BL/10 et le destinataire est C57BL / 6. Ceci suggère le rôle d'un mineur, et non pas les grands, les antigènes d'histocompatibilité dans la pathogenèse bronchiolite oblitérante 6. En outre, nous avons rapporté la neutralisation de l'IL-17 empêche la bronchiolite oblitérante dans le modèle murin. Ce modeL représente un outil de recherche novateur pour l'examen de la transplantation pulmonaire et à la promotion des transplantations pulmonaires cliniques.

Disclosures

Pas de conflits d'intérêt déclarés.

Acknowledgments

Sources de financement: ce travail soutenu par les National Institutes of Health des subventions, des HL067177 HL096845 et P01AI084853 à DSW

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Zeiss Opmi 6SFC-1880 Prescott’s Inc PMZ014
Harvard Rodent Ventilator Harvard Apparatus 55-7058
20-gauge I.V. catheter Terumo Medical Corporation 100510D
22-gauge I.V. catheter Terumo Medical Corporation 081015S
24-gauge I.V. catheter Terumo Medical Corporation 100522A
9/0 Meth Blue Virgin Silk Ashaway Line Twine Mfg. CO MBVS-90
10-0 Alcon Surgical Suture Alcon Laboratories, Inc 8065-192101
Black Braided Silk 5-0/18inches Henry Schein M652630
Heparin Sodium 1000 units/ml APP Pharmaceuticals 407156
Betadine Solution Purdue Product 67618-150
Lactated Ringer's injection Hospira NDC 0409-7953-03
C57BL/10 Harlan Sprague-Dawley 8-12 weeks, 25-30g Male, Donor
C57BL/6 Harlan Sprague-Dawley 8-12 weeks, 25-30g Male, Donor or recipient

Table 2. Table of mice, specific reagents and equipment.

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References

  1. Asimacopoulos, P. J., Molokhia, F. A., Pegg, C. A., Norman, J. C. Lung transplantation in the rat. Transplant Proc. 3, 583-585 (1971).
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  6. Fan, L. Neutralizing IL-17 Prevents Obliterative Bronchiolitis in Murine Orthotopic Lung Transplantation. Am. J. Transplant. 11, 911-922 (2011).
  7. Stewart, S. Revision of the 1996 working formulation for the standardization of nomenclature in the diagnosis of lung rejection. J. Heart Lung Transplant. 26, 1229-1242 (2007).
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Cite this Article

Suzuki, H., Fan, L., Wilkes, D. S. Development of Obliterative Bronchiolitis in a Murine Model of Orthotopic Lung Transplantation. J. Vis. Exp. (65), e3947, doi:10.3791/3947 (2012).More

Suzuki, H., Fan, L., Wilkes, D. S. Development of Obliterative Bronchiolitis in a Murine Model of Orthotopic Lung Transplantation. J. Vis. Exp. (65), e3947, doi:10.3791/3947 (2012).

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