Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Orthotopic 폐 이식의 Murine 모델에 Obliterative Bronchiolitis의 개발

doi: 10.3791/3947 Published: July 10, 2012

Summary

Obliterative bronchiolitis는 폐 이식받는 사람의 장기 생존의 열쇠 장애와 강력한 잠복기 모델의 부족이다 obliterative bronchiolitis의 immunopathogenesis를 검토 걸로. 다른 고형 장기 이식과는 달리, vascularized 마우스 폐 이식이있다는 최근에 개발되었습니다. 여기 murine orthotopic 단일 폐 이식 후 당사 독자 개발한 obliterative bronchiolitis 모델을 보여줍니다.

Abstract

쥐의 Orthotopic 폐 이식 먼저 1971 1 Asimacopoulos 및 동료에 의해 ​​보도되었다. 현재이 방법을 잘 수용하고 all​​o-부결 연구뿐만 아니라 폐 이식 후 국소 빈혈 reperfusion - 부상의 메커니즘을 조사를위한 syngeneic 변종 사이뿐만 아니라 표준입니다. 쥐 및 다른 대형 동물 모델 2의 응용 프로그램이 이러한 연구의 해설에 크게 기여하고 있지만, 이러한 조사의 범위는 녹아웃 및 형질 전환 쥐의 부족에 의해 제한됩니다. obliterative bronchiolitis, 폐 이식 환자에서 사망의 주요 원인에 대한 효과적인 치료로 인해 obliterative bronchiolitis를 복제 사전 임상 모델에 대한 집중적인 수색이있었습니다. tracheal allograft 모델은 가장 널리 사용하고 obliterative bronchiolitis 3 histopathologic 일부 기능을 재현할 수있다. 그러나 그대로 vasculat의 부족받는 사람의 실시 항공 및 obliterative bronchiolitis의 불완전 pathologic 기능과는 아무 관계가있는 우레이 모델 4의 유틸리티를 제한합니다. 다른 고형 장기 이식과는 달리, vascularized 마우스 폐 이식은 최근 2007 5에서 처음으로 오카자키 및 동료에 의해보고되었습니다. 쥐의 폐 이식의 기본 원칙을 적용, 우리의 실험실 obliterative bronchiolitis의 immunopathogenesis 6 진학을 허용 사소한 histoincompatible 항원 murine orthotopic 단일 왼쪽 폐 이식을 사용 obliterative bronchiolitis 모델을 실시했습니다.

Protocol

1. 기증 절차

  1. 모든 수술 절차는 무균 기법을 활용하여 수행되었다. 어떤 항생제는 기증자와받는 생쥐 모두 부여하지 않습니다.
  2. 공여 마우스의 마취의 유도가 5퍼센트 Isoflurane과 함께 시작됩니다.
  3. 마우스는 orotracheally 20 게이지 정맥 카테터와 intubated 후 125 심호흡 / 분 약 0.5 ML 갯벌 볼륨 (는 체중의 2 %)의 비율로 100 % 산소를 사용하여 쥐 환풍기에 배치됩니다.
  4. 마취는 흡입된 1-2% Isoflurane으로 유지됩니다.
  5. 공여 마우스가 위로 향한 위치에 배치되며, 70 % 알코올로 준비.
  6. Laparosternotomy가 결합된 중간선과 가로 절개로 수행됩니다.
  7. 100 U / kg의 헤파린이 방금 간 아래에서 하부 대정 맥 (IVC)에 주입한다.
  8. 다이어프램은 척추쪽으로 복부 늑골 첨부 따라 절단되고, 흉강는 가슴 양쪽 절단에 의해 노출되는목에 벽.
  9. 다이어프램의 수준에서 IVC의 절개 후 오른쪽 심방 부위요는 냉각의 2 ML로 잘라 폐가 플러시합니다 (4 ℃) 폐동맥의 루트 (시 가로 절개를 통해 Lactated에 울리는의 주입과 헤파린의 0.1 ML PA) 트렁크.
  10. 최종 갯벌 인플레의 3 분의 2에서 환기를 체포, 심장 - 폐 블록 excised 얼음 (4 ° C)에 저장됩니다.
  11. 기증자 왼쪽의 폐암은 수갑을 풀러 첨부하여받는 사람을 위해 준비가되어 있습니다. 폐 인대는 폐 정맥 (PV)까지 베인있다. hilum은 식도와 대동맥을 제거하여 내신됩니다.
  12. hilum의 가장 두개골 측면에 위치한 PA,뿐만 아니라 첨부된 주요 기관지 (BR)를 식별합니다. 기관지에서 PA를 조심스럽게 해부.
  13. PA의 커프스는 24 게이지 정맥 주사 (IV) 카테 테르로 만든 0.7 mm의 확장자의 길이는 0.5 mm로 절단됩니다.
  14. 끝단의 전체 표면은 다음 anasto을 촉진하기 abraded합니다mosis.
  15. 기관지에 대한 커프스는 20 게이지 정맥 주사 카테터에서 파생하고, 0.7 mm의 확장자가 1.0 mm의 길이로 절단됩니다.
  16. 동일한 자료를 사용하여 PV의 끝단은 기증자 마우스의 무게에 따라 다릅니다. 특히 생쥐에 대한 즉석 크기 24~27g은 22 게이지, 0.7 밀리미터 확장자의 길이는 0.7 mm이다. 27~32g 무게 생쥐의 경우 연구가 0.7 밀리미터 확장자의 길이는 0.7 mm입니다 20 게이지 카테터를 활용.
  17. 수갑은 PA, PV와 BR의 말초 끝에 삽입하고 9-0 봉합사로 고정됩니다.
  18. 공여 폐이 붉어지는 및 저장하기 전에 멸균 헤파린과 멸균 식염수에 씻어있다. 공여 폐 그러면 폐 매우 깨끗하고 무균 유지 빙판에 무균 식염수에 배어 멸균 거즈 (4 ° C)로 싸여있다.
  19. microvessel 클램프는기도로 Lactated 울리는 엔트리를 방지하기 위해 기관지에 배치됩니다.

2. 받는 절차

  1. anes의 유도위 기증자에 대해 설명하는 것처럼 thesia 및 기계적 환기은 동일합니다.
  2. 왼쪽 가슴 벽은 면도와 70 %의 알코올과 수술 부위가 draped되어 함께 준비하고 있습니다.
  3. thoracotomy 절개는 척추에 dorsally 가까이 절개하고 심장에 인접한 좌측 폐동맥 혈관과 기관지에 게재 microvessel 클램프를 확대, 왼쪽 세번째 늑간 공간에서 이루어집니다. 당신은 PV 그들 사이 hilum과 BR의 꼬리 끝에, 두개골 측면에서 PA를 볼 수 있습니다.
  4. 중앙 hilar 구조 채워 떠나는 동안 PA, BR 및 PV에 가벼운 긴장을 일으키는 것으로 hemostat에 부드러운 견인을 사용하여 왼쪽 폐는 흉강에서 꺼냈어요됩니다.
  5. PA, PV와 BR은 PA, PV와 BR 주위에 느슨하게 위치 9-0 봉합사를 삽입하여 다음 무딘 절개에 의해 분리된다.
  6. 그 adventitial 칼집, 혈관 주위의 약 네번째 작은 가로 절개에서 완전히 PA을 해부 후니다동맥의 지느러미 부분의 연속은 그대로두고, 앞부분은 벽에 설치했다.
  7. 감기, Lactated 닮은 - 젖은 솜 거즈에 싸서하고 위에서 설명한 준비 기증자 폐암은 다음 흉강에 위치하고, 수갑이받는 PA, PV와 BR에 삽입하고 9-0 봉합사로 고정됩니다.
  8. hilar 교차 클램프는 reperfusion 및 통풍을위한있게 제거됩니다.
  9. 받는 흉부로 다시 이식된 폐를 배치한 후, thoracotomy 절개는 5-0 봉합사를 사용하여 닫힙니다.
  10. 마우스가 마취에서 회복하기 위해 허용됩니다. Buprenorphine은 (0.05-0.15 밀리그램 / ㎏) 수술 후 즉시 시행, 후 2-3 일 후 수술을 매 8 시간됩니다.

3. 대표 결과

우리의 경험은 반복 연습을 몇 개월 마우스 폐 이식 모델에서 실력되기 위해 필요한 우리에게 가르쳐 왔습니다. 숙련도가 획득되면, 우리죽음 operatively 7 일 포스트 내에 발생하는있는 96% (1백분의 96 연속 수술) perioperative 생존율을 chieved. 두 죽음은 intraoperatively 시작된 그 출혈로 인해 였는데, pneumothraces는 다른 두 생쥐의 사망 원인이 있었다. 모든 절차를 보려면 따뜻한 국소 빈혈 시간은 ± 3.14 분 14.32이었고, 차가운 국소 빈혈 시간은 58.51 ± 18.06 분이었다. 세 orthotopic 폐 이식 그룹이 연구되었습니다 isograft : 6 / C57BL → C57BL / 6, allograft : C57BL/10 → C57BL / 6와 C57BL / 6 → C57BL/10. 우리는 수컷 생쥐를 사용하지만, 남녀 사이에는 상당한 해부 학적 차이가 없기 때문에 우리의 기술은 또한 암컷 생쥐에 적용할 수 있습니다.

거절 병리학의 등급은 임상 폐 이식 7 (표 1)에 대한 표준 기준을 활용 멀게 방식으로 실시되었다. 우리가 isograft (C57BL / 6 → C57BL / 6)에 온화한 없거나 전혀 거절을 관찰 반면, 두 allograft 조합은 안돼요 개발rable 급성 또는 만성 거부 (그림 1). 반대로, OB는 C57BL/10에서 훨씬 더 자주이었다 day28 (표 1)에 의한 C57BL / 6 → C57BL/10 단체보다 → C57BL / 6.

C57BL / 6 →
C57BL / 6
C57BL/10 →
C57BL / 6
C57BL / 6 →
C57BL/10
P-값
거절 병리
일 28에서 "A"점수
0.67 ± 0.89 * 3.33 ± 0.82 * 3.29 ± 0.76 * P> 0.05
산부인과 / 일 21, 28시 총 생쥐 0 / 24 (0 %) ** 34분의 14 (42.1 %) ** 16분의 2 (12.5 %) ** P <0.05

표 1. 급성 거부 반응과 obliterative bronchiolitis 포스트 이식의 유행의 Histological 점수. 표준 cri에 의한 급성 거부 반응의 채점 ( ""점수)teria는 대표적인 결과에 설명했다. 데이터는 28 일 게시물 이식에서 ""점수의 평균 ± SD를 나타냅니다. 데이터 일 21 28 사후 이식에서 OB를 개발하는 각 그룹의 생쥐의 수량과 백분율을 나타냅니다.

그림 1
그림 1. 28일 포스트 폐 이식의 매크로 연구 결과와 조직 병리학. 패널 1A는 매크로 발견하고 H & E 스테인드 Isograft의 폐 바로 순진 폐를 나타냅니다. 패널 1B와 1C는 H & E와 각각 산부인과와 비 OB를 개발 BL / 6 마​​우스 수신자로 이식 Masson의 Trichrome 스테인드 BL/10 폐 allograft를 나타냅니다. 1B에 흰색 화살표가 OB의 병변을 식별합니다. 패널 1D는 BL/10 마우스받는 사람에 이식 BL / 6 폐 allograft를 보여줍니다.

절차 중에 주요 문제 해결은 다음과 같이 있었다.

  1. 혈액 흐름 장애 : 플러쉬 공여 폐까지색깔은 색깔이 흰색이된다. 과도한 압력의 이용은 폐의 부종을 유발 수 있습니다. 그러나 이식 후 부종을 방지하기 위해 너무 많이 밀어 내지 않습니다.
  2. 기증자에 즉석 삽입의 난이도 : vasculature는 충분한 길이와 연결된 지방과 결합 조직 무료입니다 그걸 확인할.
  3. anastomotic 사이트에서 출혈하면 : 약 5 분 동안 해당 사이트에 압력을 적용하는 Q 도움말을 사용하십시오.
  4. 받는 사람 PA 혈액 흐름 방해 : 주로 즉석 삽입시의 비틀림으로 인한. 공기 PA 내에서 관찰되는 경우 문합가 필요로 누른 다음 다시해야.
  5. 곤란 PV 교합 (anastomosis) : PV의 분리막은 매우 얇고 쉽게 눈물이다. 적절한 커프스 크기를 선택하고 매우 부드럽게받는 사람의 PV로 바로 삽입합니다.
  6. 받는 사람 PV 혈액 흐름 방해 : 끝단의 위치와 방향을 확인하십시오. 기관지 끝단에서 압축을 풀어주고있다.
  7. Pneumothorax : 이것은 manipulatio으로 인해 중 기관지 천공으로 인해 발생할 수 있습니다기도, 또는 이식 절차와 관련된 외상에 의한 폐 표면의 천공의 N. 전직은기도 벽 내의 구멍 수술 폐쇄로 치료하며, 후자는 10-0 나일론 봉합사를 사용하여 폐 표면의 누설을 oversewing에 의해 처리됩니다.

Discussion

생쥐의 Orthotopic 폐 이식은 microsurgical 요구와 조직의 극단적인 취약성으로 인해 도전한다. 커프스 기법의 도입은 쥐 8 orthotopic 폐 이식의 광범위한 사용을 허용했다. 이것은 우리 실험실의 생쥐에 orthotopic 폐 이식 모델의 개발을위한 기초가되었다. 생쥐와 쥐에서 인간과 달리 왼쪽 폐 하나 밖에 엽을 포함하며 전체 폐 질량의 25 %를 만듭니다. 이것은 왼쪽 단일 폐 이식 순환계 지원 시스템에 대한 필요성없이 murine 모델에서 가능합니다.

우리 예비 수술은 이식된 폐의 환기 및 관류는 PV 문합의 크기에 크게 의존이라고 밝혔다. 특정 PV anastomotic을 재는 완 크기는 기증자에 맞게 활용하고 수신자가 같은 9를보고했다. 부적 절한 커프스 사이징은 PV anast의 이식된 폐 또는 dehiscence 중 무기폐 결과omosis. 오카자키 외가 결합된 선박 결합의 사용을보고하고 기관지 5 클리핑. 현재의 연구에서는 우리가 따뜻한 허혈성 시간을 단축 있습니다 제안해 모든 hilar 구조의 동맥류 클립을 사용합니다. murine 모델에서 orthotopic 왼쪽 폐 이식 중 하나는 제한받는 동물들이 allografts 5 alloimmune-매개 괴사 후에도 살아남을 수있다는 것입니다. 따라서 생존 연구가 가능하지 않습니다와 그라 프트 평가는 이식된 폐 10 histological 검사에 따라 달라집니다.

이 기법을 사용하여, 우리는 생쥐에 잠복기 obliterative bronchiolitis 모델을 개발했습니다. 특히, 기증자 마우스 C57BL/10이고받는 사람은 C57BL / 6입니다. 이것은 미성년자의 역할, 그리고 obliterative bronchiolitis의 pathogenesis 6의 주요 histocompatibility의 항원을 제안합니다. 더욱이, 우리는 IL-17은 murine 모델 obliterative bronchiolitis을 방지 중화보고했습니다. 이 모드는전 폐 이식의 시험 및 임상 폐 이식의 발전을위한 새로운 연구 도구를 나타냅니다.

Disclosures

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

Acknowledgments

자금 출처 : 건강 보조금 HL067177, HL096845 국립 연구소의 지원으로이 작품과 DSW에 P01AI084853

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Zeiss Opmi 6SFC-1880 Prescott’s Inc PMZ014
Harvard Rodent Ventilator Harvard Apparatus 55-7058
20-gauge I.V. catheter Terumo Medical Corporation 100510D
22-gauge I.V. catheter Terumo Medical Corporation 081015S
24-gauge I.V. catheter Terumo Medical Corporation 100522A
9/0 Meth Blue Virgin Silk Ashaway Line Twine Mfg. CO MBVS-90
10-0 Alcon Surgical Suture Alcon Laboratories, Inc 8065-192101
Black Braided Silk 5-0/18inches Henry Schein M652630
Heparin Sodium 1000 units/ml APP Pharmaceuticals 407156
Betadine Solution Purdue Product 67618-150
Lactated Ringer's injection Hospira NDC 0409-7953-03
C57BL/10 Harlan Sprague-Dawley 8-12 weeks, 25-30g Male, Donor
C57BL/6 Harlan Sprague-Dawley 8-12 weeks, 25-30g Male, Donor or recipient

Table 2. Table of mice, specific reagents and equipment.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Asimacopoulos, P. J., Molokhia, F. A., Pegg, C. A., Norman, J. C. Lung transplantation in the rat. Transplant Proc. 3, 583-585 (1971).
  2. Yoshida, S. Surgical technique of experimental lung transplantation in rabbits. Ann. Thorac. Cardiovasc. Surg. 11, 7-11 (2005).
  3. McDyer, J. F. Human and murine obliterative bronchiolitis in transplant. Proc. Am. Thorac. Soc. 4, 37-43 (2007).
  4. Sato, M., Keshavjee, S., Liu, M. Translational research: animal models of obliterative bronchiolitis after lung transplantation. Am. J. Transplant. 9, 1981-1987 (2009).
  5. Okazaki, M. A mouse model of orthotopic vascularized aerated lung transplantation. Am. J. Transplant. 7, 1672-1679 (2007).
  6. Fan, L. Neutralizing IL-17 Prevents Obliterative Bronchiolitis in Murine Orthotopic Lung Transplantation. Am. J. Transplant. 11, 911-922 (2011).
  7. Stewart, S. Revision of the 1996 working formulation for the standardization of nomenclature in the diagnosis of lung rejection. J. Heart Lung Transplant. 26, 1229-1242 (2007).
  8. Mizuta, T., Kawaguchi, A., Nakahara, K., Kawashima, Y. Simplified rat lung transplantation using a cuff technique. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 97, 578-581 (1989).
  9. Jungraithmayr, W. M., Korom, S., Hillinger, S., Weder, W. A mouse model of orthotopic, single-lung transplantation. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 137, 486-491 (2009).
  10. Li, W. Orthotopic vascularized right lung transplantation in the mouse. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. (2010).
Orthotopic 폐 이식의 Murine 모델에 Obliterative Bronchiolitis의 개발
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Suzuki, H., Fan, L., Wilkes, D. S. Development of Obliterative Bronchiolitis in a Murine Model of Orthotopic Lung Transplantation. J. Vis. Exp. (65), e3947, doi:10.3791/3947 (2012).More

Suzuki, H., Fan, L., Wilkes, D. S. Development of Obliterative Bronchiolitis in a Murine Model of Orthotopic Lung Transplantation. J. Vis. Exp. (65), e3947, doi:10.3791/3947 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter