Summary
Digital intravital epifluorescens-mikroskopi af postkapillære venuler i den cremasteric mikrocirkulation er en bekvem metode til at få indblik i leukocyt-endotel-interaktion
Abstract
Iskæmi-reperfusionsskade (IRI) har været impliceret i en lang række patologiske tilstande, såsom cerebralt slagtilfælde, myocardieinfarkt, intestinal iskæmi såvel som efter transplantationen og kardiovaskulær kirurgi. En Reperfusion af tidligere iskæmisk væv, mens afgørende for forebyggelse af irreversibel vævsskade, fremkalder overdreven inflammation af det påvirkede væv. Tilgrænsende til produktion af reaktive oxygenarter, aktivering af komplementsystemet og forøget mikrovaskulær permeabilitet, aktivering af leukocytter er en af de vigtigste aktører i patologiske kaskade af inflammatorisk vævsbeskadigelse under reperfusion. 2, 3 leukocytaktivering er en flertrinsproces, der består rullende, faste adhæsion og transmigration og er medieret af et komplekst samspil mellem adhæsionsmolekyler som reaktion på kemoattraktanter såsom komplementfaktorer, kemokiner eller blodplade-aktiverende faktor. 4
<p class = "jove_content"> Mens leukocyt rulning i postkapillare venuler hovedsageligt medieres ved interaktion af selectiner 5 med deres modparter ligander, faste adhæsion af leukocytter til endotelet, er selectin-styret via binding til intercellulære adhæsionsmolekyler (ICAM) og vaskulær cellulære adhæsionsmolekyler (VCAM). 6, 7Guldstandarden til in vivo observation af leukocyt-endotel-interaktion er en teknik intravital mikroskopi, først beskrevet i 1968. 8
Selvom forskellige modeller af IRI (iskæmi-reperfusionsbeskadigelse), er blevet beskrevet til forskellige organer, 9-12 kun få er egnede til direkte visualisering af leukocytrekruttering i mikrovaskulære leje på et højt niveau af billedkvaliteten. 8
Vi her fremme den digitale intravital epifluorescens-mikroskopi af postkapillære venulen i cremasteric mikrocirkulationaf rotte 13 som en bekvem metode til kvalitativt og kvantitativt at analysere leukocytrekruttering for IRI-forskning i tværstribet muskelvæv og giver en detaljeret manual for udførelse af teknikken. Vi yderligere at belyse almindelige faldgruber og give nyttige tips, der skal gøre det muligt for læseren at virkelig værdsætte, og sikkert udføre metoden.
I en trinvis protokol, som vi skildrer, hvordan du kommer i gang med åndedræt kontrolleret anæstesi under tilstrækkelig overvågning til at holde dyret fast bedøvet i længere perioder. Vi så beskriver cremasteric præparatet som en tynd flad plade for fremragende optisk opløsning og giver en protokol for leukocyt billeddannelse i IRI, der er blevet veletableret i vores laboratorier.
Protocol
1. Anæstesi og overvågning
- Passende nationale og institutionelle etik skal være på plads, før du udfører dyreforsøg. Efter godkendelse fra den etiske komité bedøver Sprague Dawley rotter med en kropsvægt fra 120 til 180 g. Lever 2 til 3 vol% isofluran til en plexiglas kasse via isofluran fordamper og placere rotten inde.
- Så snart det passende niveau af anæstesi er opnået (manglende reaktion på tåen eller hale knibe) rotte vægtes og barberedes på den ventrale cervikale område.
- Placere rotte liggende på ryggen på en varmepude til at opretholde kroppens temperatur på 37 ° C og anvendelse isofluran på 2 vol% under anvendelse af en silicone maske.
De følgende fremstillingstrin bedst opnås ved anvendelse af en kirurgisk mikroskop.
- Til fremstilling af luftrøret, carotidarterien og halsvenen udføre en 2 cm horisontalt hudincision i området of incisura suprasternalis og mobilisere de spytkirtler sideværts.
- Du står nu over for de ventrale nakkemusklerne. Omhyggeligt adskille dem i midterlinien og finde trachea. Bring 1 - 2 cm i luftrøret og anbring en mikro pincet under den, så at hæve den op.
- Nu udskærer halvvejs gennem den ventrale side af trachea. Vær omhyggelig med ikke at skære hele vejen igennem, hvis du gør, vil den nye beskårne ende af luftrøret glide tilbage i brystet og være meget vanskeligt at arbejde med.
- Indsætte en Abbocath rør (14g) som trachealtube ind i den nedre del af luftrøret, som tidligere er blevet forbundet til et dyr ventilator. Tip: Fast fiksering på magnet-klemmer samt sutur af trachea omkring røret er vigtigt at holde det trakeale rør på plads. Generelt har vi bruger terylene 5/0 suturen kan imidlertid lignende suturmateriale anvendes.
- Respiration kan derefter være volumen kontrolleret (frekvens, 35 - 45 vejrtrækninger / minut, tidalvolumen, 4,5 - 5 ml; Fio 2 14 Atelektase kan forhindres ved at opretholde et positivt slut-eksspiratorisk tryk på 5 til 10 mm H2O 15
- For carotis canulation er ret sternohyoid musklen adskilt ved stump dissektion for at lokalisere carotidarterien.
- Adskil vagus nerve forsigtigt fra halspulsåren og monter arterien på et vinklet mikro pincet for at stoppe blodet flyder fra hjertet.
- Passere to stykker af samme længde sutur under carotidarterien. Under henvisning til hjertet, er den mere distale suturen bundet stramt at okkludere blodet, der strømmer fra hovedet region mens den proksimale suturen er bundet løst omkring carotidarterien.
- Ved hjælp af mikro saks et lille snit foretages i carotidarterien mellem de to ligaturer.
- Indsætte et polyethylenkateter (0,28 mm indre diameter) fyldt med saltvandsopløsning, der er forbundet til en tryktransducer.
- Remove mikro tangen og tråd kateteret yderligere ind i arterien. Stram derefter den proksimale ligatur omkring arterie og kateter. Tip: Anvendelse af en anden proksimal sutur forhindrer blødning efter fjernelse af mikro pincet.
- Bind distale ligatur omkring carotis og kateteret for yderligere forankring.
- Overvåge anæstesi kontinuerligt ved monitorering af hjertefrekvens og blodtryk. Udfør intermitterende arterielle blod gas analyser ved hjælp af en blod-gas analysator. 16 A pulsen er lavere end 300 bpm eller mere end 360 bpm samt et middel arterielle tryk falder under 80 mmHg i mere end 5 minutter er kriterierne for udelukkelse. 17, 18 Vedligehold blod pH inden for fysiologiske grænser (7,35-7,45). I tilfælde af forsøget skal afsluttes på grund af unormale overvågning satser, scarify dyret ved halsen dislokation eller exanguation.
Til intravenøs anvendelse af fluorescerende farvestoffer eller andre stoffer of interesse, udføre følgende:
- Fokusere område af den venstre halsvene med kirurgisk mikroskop.
- Med pincet i hver hånd, rive den tynde fascia for at afsløre halsvenen. Monter vene på et vinklet mikro pincet. Blood flow vil derefter stoppe.
- Ved hjælp af pincetter, to stykker af samme længde sutur passeret under halsvenen overensstemmende med carotid canulation. Binde distale suturen stramt og den proximale suturen løst omkring halsvenen.
- Lave et lille snit i halsvenen og indsætte et polyethylenkateter (0,28 mm indre diameter), der er skyllet med saltvand. Markere, at snit og canulation kan være mere krævende og tidskrævende end carotis.
- Før kateteret mod hjertet og stram ligatur nærmest kernen omkring venen og kateteret.
- Efter konforme passage, binde distale ligatur omkring kateteret. Tip: Yderligere fiksering af Both katetre med tape kan forhindre flytter sig.
- Skylning katetre ofte for at hindre intraluminal størkning.
2. Forberedelse af Cremaster Muscle
- Vi anvender et aluminium trin på 1,5 - 2 cm tykkelse cremasteric billeddannelse. Den fase hurtigt indfører den ønskede temperatur af den varme puden således lette termisk styring af cremasteric væv. Dette er afgørende for betændelse undersøgelser. Alternativt kan en plexiglas platform kan anvendes om regulering af cremasteric temperatur er vanskeligere. Placere pungen i midten af scenen.
- Den indledende incision i huden og ydre spermatic fascia ovenfor pungen i det distale ende efterfulgt af forsigtig dilatation af subdermal rummet ved hjælp af fine sakse. Undgå at røre ved det underliggende væv med instrumenterne.
- Så snart vævet udsættes det fugtes med forvarmet (37 ° C) phosphatpufret saltopløsning with calcium og magnesium. Anvende løsningen regelmæssigt til en eksponeret væv.
- Bindevæv mellem den ydre spermatic fascia og cremaster musklen fjernes omhyggeligt for at frigøre cremaster muskel fra omgivende væv.
- Den ydre overflade af cremaster musklen er derefter forsigtigt fjernet af bindevæv. Kontinuerlig superfusionssystem under dissektion hydrater bindevævet, lette synlighed og fjernelse.
- Suturere den distale ende af cremaster sækken at holde og let udvide ende af sækken.
- Incise den distale ende af sækken på den ventrale aspekt og langstrakte incisionen proximalt ved hjælp af mikro saks. Omhyggeligt ætse blødning fartøjer langs indsnit linier under anvendelse af en termisk kauterisation. Undgå unødig cauterization at begrænse yderligere inflammatoriske stimuli. Spids. Blood strømningsdynamik nær periferien af præparatet ændres ved denne vævsskade 19. Derfor, for at minimerese virkninger på indsamling, bør blodkar nær midten af præparatet kan anvendes til billeddannelse.
- Den åbne cremaster ligger fladt på aluminium soklen men stadig er forbundet med en tynd ligament til epididymis under testikel. Som følge af den testikel til den ene side udsætter dette ligament herunder en lille arterie og vene, som forbinder til bitestiklen. Brug kautering at forsegle de fartøjer og anvender mikro saks til at klippe det bindevæv ligament mellem testikel og cremasteric væv.
- Skub forsigtigt tilbage isolerede testikel i lyskekanalen. Andre forfattere resect testikel efter proksimale ligatur (orkiektomi) sammen med den tilhørende lyskelymfekirtel fad pad. 20 I en følsom model, som IRI induceret leukocytaktiveringssyndromet vi forsøger at undgå at alle yderligere kirurgiske stimuli, vi derfor afstå fra resektion testiklerne, hvilket er normalt ikke nødvendigt for at få tilstrækkelig eksponering af cremaster musklen.
- Ud over den førstefiksering sutur fire kanter af væv (to på hver side) og fastgør tråde til bånd til forsigtigt at sprede cremasteric vævet radialt på aluminium scenen. Forlader en kløft mellem aluminium scenen og den eksterne indgangen til lyskekanalen simplificerer efterfølgende cremasteric klipning for iskæmi.
- Sted to ender af polyethylenkateter (0,28 mm indre diameter) tæt på cremasteric væv for superfusionssystem opsætning. Kontroller, at hulrummet er fri for luft for at undgå luftbobler i den endelige væskekammeret.
- Tegne en linie af vaseline (Vaseline) omkring cremaster musklen under anvendelse af en sprøjte. Linien skal udvide størrelsen af dækglasset, der anvendes til dækning.
- Hvis du vil oprette en væske kammer, placere en firkantet dæksel slip (32 × 32 mm) over cremasteric væv og fast lægger kanterne til vaseline linjen.
- I tilfælde af cremasteric væv ikke superfusioneret med et specifikt lægemiddel, kontinuerlig udskiftning af den omgivende influenzaid er unødvendig. En enkelt applikation af phosphatpufret saltopløsning med calcium og magnesium i den oprettede kammeret kan derefter være tilstrækkelig. Lokal stimulering med lægemidler imidlertid bør udføres kontinuerligt via mikro-perfusion ved en hastighed på 3 ml per time.
- Den cremasteric væv er nu klar til mikroskopisk billeddannelse.
3. Intravital Setup
Den grundlæggende intravital setup kan variere. For epifluorescens billedbehandling forsøgene skal udføres i et mørkt rum.
- Dyret overføres til trin i en intravital epifluorescens mikroskop udstyret med et 470 nm LED lyskilde til epi-belysning. Brug en nedsænkning i vand objektiv (20 × / 1,0) for at opnå forstørrelse på ca 800 ×. Optag observationer ved hjælp af en høj opløsning digitalt kamera og gemme journaler på en personlig computer til offline evaluering.
- For leukocyt mærkning, injicere rhodamine6G intravenøst via den jugulare kateteret ved koncentrationer på 0,4 mg / kg legemsvægt.
- Vælg et postkapillare vener til observation. Fartøjernes størrelse bør ligge mellem 20-60 um og blodgennemstrømning skulle være tilstrækkeligt. At minimere indflydelsen af præ-aktivering af væv, kan der kun beholdere, hvor leukocytter rullende er <20 celler/30 sekunder, og antallet af adhærente celler <10 cells/200μm af venular endothelium anvendes til yderligere analyse.
- Hvis det er muligt, kan op til tre postkapillare venuler anvendes til observation, men de bør være placeret i en tilsvarende del af cremasteric vævet for at undgå sammenblanding beholderne på forskellige tidspunkter.
4. Iskæmi-reperfusionsskade (IIR)
- Lad væv stabilisere i 30 minutter.
- Udfør en optagelse på 30 sekunder til at etablere basale værdier for leukocyt rullende og overholdelse. Ideelt generere i alt tre basale optagelse at verificere celletal og at opnå standardafvigelser.
- Anbring forsigtigt en Biemer beholder klemme omkring det proximale ende af den eksponerede cremasteric væv ved hjælp af anvendelse pincet. Stasis bør forekomme straks og kan visualiseres ved epifluorescens-mikroskopi i den observerede karafsnit.
- En række tidsforløbene kan anvendes afhængigt af niveauet af påkrævet beskadigelse. Vi anvender 30 minutters iskæmi tid som beskrevet af andre forfattere. 21-23 Fjern skibet klemme bagefter. Tillade blodet at stabilisere i yderligere 15 minutter.
- Efterfølgende optagelser af 30 sekunders varighed kan fremstilles i hele reperfusionsperioden (f.eks 30 sekunder hvert 15 minut). Gem dine optagelser digitalt til offline analyse.
- Til afslutning af forsøget, er rotten aflivet ved cervikal dislokation under tilstrækkelig bedøvelse ved at trykke på et stumpt instrument, såsom mat kanten af en saks blad ved bunden af skallen. Med den andenside er haleroden hurtigt trukket, hvilket adskillelse af halshvirvlerne fra kraniet.
5. Offline Videoafspilning Analyse
- For offline videoafspilning analyse er det nyttigt at bruge software, der giver mulighed for valg af forskellige billeder og observation af videosekvensen i slow motion. Juster kontrast og lysstyrke passende. Vi bruger software leveret af producenten af mikroskop, der gør det muligt for længdemål og digital forstørrelse.
- Til kvantificering af leukocyt rullende, definerer en virtuel linje, der skærer skibet lodret, der er konsekvent i alle poster. Tæl antallet af rullende leukocytter, der passerer den linje inden for 30 sekunder manuelt.
- Til kvantificering af adhærerende leukocytter, definerer en 200 um fartøj sektion, som er konsekvent i alle poster 23 Tæl antallet af klart synlige leukocytter, der forbliver statisk i løbet af 30 sekunder -. Dermed uigenkaldelige bilateraleed som klæbende. 24
6. Repræsentative resultater
IRI af cremaster musklen har nogen virkning på gennemsnitligt arterietryk (MAP), hjertefrekvens og blod-pH
Ved hjælp af ovennævnte konfiguration (fig. 1), undersøgte vi mikrocirkulation i IRI over to timer protokol, men en meget længere observation på op til 6 timer, er mulig. Som vist i figur 2, IRI af cremaster musklen har ingen signifikante macrohemodynamic virkninger på rotter omsætning gennemsnitlige arterielle blodtryk og hjertefrekvensen forbliver stabile under hele undersøgelsesperioden. Derudover har vi overvåget homeostase af hyppige målinger af det arterielle blod-pH, der varierede inden for fysiologiske grænser og viste ingen signifikante inter-gruppe forskelle.
IRI inducerer leukocyt rullende i cremasteric omløb
Leukocyt endotel interaktion er en vigtigbegivenhed i den akutte inflammation. Ved hjælp af intravital mikroskopi fandt vi en tidsafhængig stigning i antallet af ruller leukocytter i IRI af cremaster musklen (figur 3A) overensstemmende med tidligere data 21, 25. Rolling monteret over to timer observation tid til et maksimum på 137,63 ± 22,55% af baseline værdi efter 120 minutters reperfusion tid og derefter nåede statistisk signifikans sammenlignet med skinopererede dyr (137,63 ± 22,55 vs 99,43 ± 14,04% af baseline værdi).
IRI inducerer leukocytadhæsion i cremasteric cirkulation
For yderligere evaluering af leukocyt-endothelial interaktion vi analyseret leukocytadhæsion i en 200 um fartøj sektion. IRI inducerede en stigning i antallet af adhærente leukocytter, der væsentligt overskrider værdier skinopererede dyr efter 60 minutter (118,33 ± 6,83 vs 96,27 ± 5,78% af basisværdien) og yderligere ASCEnded ved 120 minutters reperfusion (figur 3B).
Sammenfattende den beskrevne in vivo-model leverer konsistente data for akut leukocytaktiveringssyndromet i IRI, mens dyr overlevelse og cirkulation stabilitet er berettiget.
Figur 1. A. Rutediagram for intravital epifluorescens mikroskopi ydeevne i iskæmi-reperfusionsskade af rotten cremaster musklen. Efter nødvendige forberedelser til anæstesi og overvågning, er rotten cremaster muskel udsættes for billeddannelse. Registreringer af leukocytaktivering tages før og efter vævsiskæmi. Efterfølgende video analyse bedst udføres offline. B. Skematisk tal på den foreslåede intravital setup. Klik her for at se større figur .
Figur 2. IRI af cremaster musklen har nogen virkning på gennemsnitligt arterietryk (MAP), hjertefrekvens og blod-pH. Gennemsnitligt arterietryk (A) og hjertefrekvens (B) blev overvåget hvert 30. minut under hele forsøget via tryktransduceren efter canulation af højre carotidarterie. Måling af arterielt blod-pH (C) blev udført efter 0, 60 og 120 minutter. Værdier er middelværdi ± SEM af 6 forskellige rotter og varierede på fysiologiske niveauer uden væsentlige inter-gruppe forskelle. Klik her for at se større figur .
Figur 3. IRI øger leukocyt-Endotheliale interaktion i cremasteric cirkulation. Efter mærkning af leukocytter med rhodamin 6G (0,4 mg / kg legemsvægt) intravital epifluorescens-mikroskopi blev benyttet til at bestemme leukocyt-endotel interaktion reperfusionsskade over 120 minutter protokol efter 30 minutters vævsiskæmi. Optegnelser blev taget ved en forstørrelse på ca × 800. A. IRI øger antallet af ruller leukocytter i postkapillare venuler i cremaster muskel ved 120 minutters reperfusion henviser leukocyt rullende forbliver stabil under hele forsøget i cremasteric væv, der ikke undergår iskæmi. Værdier er middelværdi ± SEM for 6 observerede rotter. # P <0,05 under anvendelse af uparret t-test. B. Antallet af adhærente leukocytter er signifikant forøget i en tilfældigt udvalgt 200 um postkapillære karafsnit efter 30 minutters cremasteric iskæmi og efterfølgende 60 minutter væv reperfusion. Resultater bliver endnu more udtalt efter to timer reperfusionsperioden. Værdier er middelværdi ± SEM for 6 observerede rotter. # P <0,05 ved hjælp af uparret t-test. C. Repræsentative billeder af en postkapillare venulen forud for iskæmi (venstre) og 120 minutter efter IRI (til højre). Klik her for at se større figur .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Leukocyt-endothelial interaktion, produktion af reaktive ilt arter og aktivering af komplementsystemet er de vigtigste funktioner i IRI-induceret væv dysfunktion. 26 mikrocirkulationen af det angrebne væv betragtes som integralet stedet for den inflammatoriske debut. Bortset fra ex vivo eksperimenter såsom flow kammer analyser 27, 28 er det obligatorisk at give veletablerede modeller for intravital billedbehandling til yderligere at evaluere in vivo relevans. Selvom IRI er blevet impliceret i forskellige organsystemer, vi her beskriver en fremgangsmåde til systematisk undersøgelse leukocyt-endotel interaktion reperfusionsbeskadigelse af tværstribet muskelvæv, der først blev beskrevet af Baez et al 13, således særlig relevant flap operation (fig. 1). 29 Da det antages, at post-iskæmisk vævsbeskadigelse af andre organer omfatter de samme inflammatoriske mekanismer, kan den beskrevne model kan anvendes til at gain princippet indsigt i patofysiologiske mekanismer af IRI, relevante i forhold såsom myokardieinfarkt, cerebral slagtilfælde eller intestinal iskæmi.
Anvendte dyr
Modellen præsenteret her er egnet til de fleste gnavere, herunder rotter og mus. I den lange periode, billeddannelse, der er nødvendig i denne model vi generelt foretrækker rotter som tracheotomi og volumen kontrolleret respiration kan let udføres. I kombination med kardiovaskulære billeddannelse via arteriel canulation kan rotter holdes kredsløbssystemet og homeostatically stabil i flere timer (fig. 2). Desuden cremasteric væv er mere omfattende i rotter end det er i mus forlader flere muligheder for postkapillare billeddannelse. Selv vævspræparatet kan være lettere præformet af pilsner rotter, bør man mene, at cremasteric væv og især cremasteric fascia er tyndere i unge rotter (100 -150 g), hvilket reducerer baggrundsfluorescens og overlejring af additibørstes fascial væv. Imidlertid en fordel ved anvendelse af mus intravital mikroskopi er tilgængeligheden af transgene dyr, uvurderlig at belyse rollen af individuelle gener i modulering mikrocirkulatoriske begivenheder.
Vævstyper
Idet først beskrevne, er intravital mikroskopi blevet anvendt i en række mikrocirkulatoriske præparater, herunder master kindposen, kaninøret, gnaver mesenteriet, og cremaster. En vigtigste ulempe forbundet med de fleste af disse præparater er den potentielle aktiveringen af celler af kirurgisk manipulation ledsaget af en forbigående stigning i valsning og adhærente leukocytter, der er blevet godt beskrevet for mesenteriet. 30 Cremasteric præparat er derfor udføres med stor forsigtighed. Vores erfaring, hjælper hyppig befugtning af det eksponerede væv og restriktive kauterisering samt et tilstrækkeligt væv stabiliseringsperiode på mindst 30 minutter for at undgå eller reducere leukocytstimulering.
En væsentlig fordel ved cremasteric billeddannelse i mesenteriske billeddannelse er den nemme tilgængelighed, sparer åbning af bughulen. Samlet kirurgiske traume reduceres, og montering på enten en plexiglas set scenen for transmitteret belysning eller, som anvendes vores protokol, et termisk kontrolleret aluminium platform for epi-illumintaion let udføres. Desuden fedt, der samler omkring postkapillare venuler i ældre dyr begrænser mesenterial billeddannelse er fraværende omkring cremasteric væv.
Leukocyt mærkning
Reagenser, såsom rhodamin 6G 31, acridinorange eller acridin rød, der farves kerner og / eller intracellulære organeller, der ikke findes i røde blodlegemer akkumulerer selektivt i leukocytter (og i nogen grad i blodplader og endotelceller) 32. Det foretrækkes anvendelse rhodamin 6G for leukocyt-detektion ved koncentrationer på 0,4 mg / kg legemsvægt, som har previously vist at have nogen signifikant virkning på aktivering af neutrofiler. 33 acridinorange viste meget mere baggrund pletter og fototoksicitet ved arteriolær vasokonstriktion (upublicerede observationer). Anvendelsen af lysdioder til fluorescens billedbehandling giver præcis excitationsspektrer og giver mere komplekse applikationer såsom kombinationen af forskellige bølgelængder bl.a. til påvisning af leukocyt aktivering og kapillær lækage på samme tid, og bør derfor være den foretrukne metode i fremtiden i vivo billeddannelse.
IRI i cremasteric væv
Anvendelse iskæmi til cremaster musklen kan let udføres, og fuldstændig afspejler klinisk relevante betingelser såsom fri flap kirurgi. Desuden kan modifikationer såsom koldt iskæmi, varm iskæmi eller cremasteric superfusionssystem med stoffer påvirker inflammation let anvendes. Intrascrotal injektion kan være fremgangsmåden ifølge Choice, når behandling af cremasteric væv der er behov for timer eller dage før optagelse.
En række af tidsforløbene for IRI kan anvendes afhængigt af niveauet af påkrævet beskadigelse. Vi her beskriver en model af 30 minutter iskæmi at producere betydelige niveauer af rullende efter to timers reperfusion (figur 3) ved at tælle hvide blodlegemer, der passerer et fast punkt på tværs af beholderen. Som stigning i rullende er moderate det efterlader nok potentiale til at stimulere leukocytter i IRI gennem andre lægemidler af interesse. Imidlertid kan en række forskellige tidsforløb anvendes afhængigt af niveauet af leukocyt kræves aktivering 21, 25 leukocytadhæsion oftest måles ved at tælle celler klart synlige i karvæggen i en 100 -. 200 um elastisk, der forbliver stationær i 30 s , skønt dette kan variere mellem laboratorier. Vi observeret en markant stigning i antallet af adhærente leukocytter i IRI der fik signifikant efter 60 minutter.
Som konklusion intravital epifluorescens mikroskopi i IRI af tværstribet muskelvæv kan godt udføres i rotter cremasteric væv, da det giver reproducerbare data for in vivo leukocytaktiveringssyndromet for inflammation forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af en bevilling af "Deutsche Forschungsgemeinschaft" til SU Eisenhardt (EI 866/1-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of the equipment: | Company: | Catalogue No.: | Comments: |
| Forene 100% (V/V) | Abbot | B506 | API isoflurane |
| Terylene Suture | Serag Weissner | OC108000 | |
| Portex Fine Bore Polythene Tubing | Smiths Medical | 800/100/100 | 0.28 mm inner Diameter |
| 0,9% saline solution | Fresinus Kabi | 808771 | |
| Change-A-tip deluxe cautery kit | Bovie Medical | DEL1 | |
| Abbocath -T 14G | Venisystems | G713 - A01 | used as lens tube |
| Servo Ventilator 900C | Maquet | used as animal ventialtor | |
| Logical pressure transducer | Smiths Medical | MX1960 | |
| Sirecust 404 Monitor | Siemens | ||
| ABL 700 Benchtop Analyzer | Radiometer | for blood gas measurement | |
| Heating pad | Effenberger | 8319 | |
| Aluminum stage | Alfun | AW7022 | |
| Surgical microscope OPMI 6-SDFC | Carl Zeiss | ||
| Microsurgical instruments lab set | S&T | 767 | |
| Biemer vessel clip | Diener | 64.562 | |
| Applying forceps | Diener | 64.568 | for Biemer vessel clip |
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich | R4127 | |
| Vaseline white DAB | Winthrop | 2726853 | |
| Cover glasses | 32x32 mm | ||
| Intravital setup | |||
| Zeis Axio Scope A-1 MAT | Carl Zeis | 490036 | epifluorescence microscope |
| 470 nm LED | Carl Zeis | 423052 | fluorescence light source |
| Colibri 2 System | Carl Zeis | 423052 | |
| W Plan-Apochromat 20x/1,0 DIC | Carl Zeis | 421452 | water immersion objective |
| AxioCam MRm Rev. 3 FireWire | Carl Zeis | 426509 | high resolution digital camera |
| Axio vision LE software | Carl Zeis | 410130 | use for offline analysis |
References
- Cetin, C. Protective effect of fucoidin (a neutrophil rolling inhibitor) on ischemia reperfusion injury: experimental study in rat epigastric island flaps. Ann. Plast. Surg. 47, 540-546 (2001).
- Granger, D. N. Role of xanthine oxidase and granulocytes in ischemia-reperfusion injury. Am. J. Physiol. 255, H1269-H1275 (1988).
- Lazarus, B. The role of mast cells in ischaemia-reperfusion injury in murine skeletal muscle. J Pathol. 191, 443-448 (2000).
- van den Heuvel, M. G. Review: Ischaemia-reperfusion injury in flap surgery. J. Plast. Reconstr. Aesthet. Surg. 62, 721-726 (2009).
- Rosen, S. D. Cell surface lectins in the immune system. Semin. Immunol. 5, 237-247 (1993).
- van der Flier, A., Sonnenberg, A. Function and interactions of integrins. Cell Tissue Res. 305, 285-298 (2001).
- Panes, J., Perry, M., Granger, D. N. Leukocyte-endothelial cell adhesion: avenues for therapeutic intervention. Br. J. Pharmacol. 126, 537-550 (1999).
- Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).
- Sutton, T. A. Injury of the renal microvascular endothelium alters barrier function after ischemia. Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 285, 191-198 (2003).
- Serracino-Inglott, F. Differential nitric oxide synthase expression during hepatic ischemia-reperfusion. Am. J. Surg. 185, 589-595 (2003).
- Eppinger, M. J. Mediators of ischemia-reperfusion injury of rat lung. Am J Pathol. 150, 1773-1784 (1997).
- Dumont, E. A. Real-time imaging of apoptotic cell-membrane changes at the single-cell level in the beating murine heart. Nat Med. 7, 1352-1355 (2001).
- Baez, S. An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy. Microvasc Res. 5, 384-394 (1973).
- Woeste, G. Octreotide attenuates impaired microcirculation in postischemic pancreatitis when administered before induction of ischemia. Transplantation. 86, 961-967 (2008).
- Schultz, J. E., Hsu, A. K., Gross, G. J. Morphine mimics the cardioprotective effect of ischemic preconditioning via a glibenclamide-sensitive mechanism in the rat heart. Circ. Res. 78, 1100-1104 (1996).
- Dobschuetz, E. von Dynamic intravital fluorescence microscopy--a novel method for the assessment of microvascular permeability in acute pancreatitis. Microvasc Res. 67, 55-63 (2004).
- Vutskits, L. Adverse effects of methylene blue on the central nervous system. Anesthesiology. 108, 684-692 (2008).
- Takasu, A. Improved survival time with combined early blood transfusion and fluid administration in uncontrolled hemorrhagic shock in rats. J. Trauma. 8, 312-316 (2010).
- Proctor, K. G., Busija, D. W. Relationships among arteriolar, regional, and whole organ blood flow in cremaster muscle. Am. J. Physiol. 249, 34-41 (1985).
- Bagher, P., Segal, S. S. The Mouse Cremaster Muscle Preparation for Intravital Imaging of the Microcirculation. J. Vis. Exp. (52), e2874 (2011).
- Kanwar, S., Hickey, M. J., Kubes, P. Postischemic inflammation: a role for mast cells in intestine but not in skeletal muscle. Am. J. Physiol. 275, 212-218 (1998).
- Leoni, G. Inflamed phenotype of the mesenteric microcirculation of melanocortin type 3 receptor-null mice after ischemia-reperfusion. FASEB J. 22, 4228-4238 (2008).
- Simoncini, T. Interaction of oestrogen receptor with the regulatory subunit of phosphatidylinositol-3-OH kinase. Nature. 407, 538-541 (2000).
- Woollard, K. J. Pathophysiological levels of soluble P-selectin mediate adhesion of leukocytes to the endothelium through Mac-1 activation. Circ. Res. 103, 1128-1138 (2008).
- Mori, N. Ischemia-reperfusion induced microvascular responses in LDL-receptor -/- mice. Am. J. Physiol. 276, H1647-H1654 (1999).
- Eisenhardt, S. U. Monitoring Molecular Changes Induced by Ischemia/Reperfusion in Human Free Muscle Flap Tissue Samples. Ann. Plast. Surg. , (2011).
- Eisenhardt, S. U. Generation of activation-specific human anti-{alpha}M{beta}2 single-chain antibodies as potential diagnostic tools and therapeutic agents. Blood. 109, 3521-3528 (2007).
- Eisenhardt, S. U. Dissociation of pentameric to monomeric C-reactive protein on activated platelets localizes inflammation to atherosclerotic plaques. Circ Res. 105, 128-137 (2009).
- Eisenhardt, S. U. C-reactive protein: how conformational changes influence inflammatory properties. Cell Cycle. 8, 3885-3892 (2009).
- Granger, D. N. Physiology and pathophysiology of leukocyte adhesion. , Oxford University Press. New York. 520 (1995).
- Baatz, H. Kinetics of white blood cell staining by intravascular administration of rhodamine 6G. Int. J. Microcirc. Clin. Exp. 15, 85-91 (1995).
- Mempel, T. R. In vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues. Curr. Opin. Immunol. 16, 406-417 (2004).
- Abbitt, K. B., Rainger, G. E., Nash, G. B. Effects of fluorescent dyes on selectin and integrin-mediated stages of adhesion and migration of flowing leukocytes. J. Immunol. Methods. 239, 109-119 (2000).
