בזמן אמת הדמיה דיגיטלית של אינטראקציה ליקוציט-אנדותל של פגיעה איסכמיה reperfusion (IRI) של השריר Cremaster עכברוש

Summary

מיקרוסקופ דיגיטלי intravital epifluorescence של venules postcapillary ב microcirculation cremasteric היא שיטה נוחה להבנה טובה של אינטראקציה ליקוציט-אנדותל

Abstract

איסכמיה reperfusion פציעה (IRI) היה מעורב במגוון גדול של מצבים פתולוגיים כגון שבץ מוחי, אוטם שריר הלב, איסכמיה במעי, כמו גם בעקבות reperfusion השתלת ניתוח לב וכלי דם ^1. של רקמה איסכמית בעבר, בעוד חיוני למניעת בלתי הפיך רקמת פציעה, מעורר דלקת מופרזת של רקמת המושפעת. סמוך הייצור של מינים החמצן מגיב, הפעלה של מערכת המשלים והגדילה את חדירות כלי הדם, את ההפעלה של leukocytes הוא אחד השחקנים עיקרון מפל פתולוגית של נזק לרקמה הדלקתית במהלך reperfusion. ^{2, 3} הפעלת ליקוציט הוא תהליך רב שלבי הכולל של גלגול, הדבקה איתן גלגול, והוא מתווך על ידי פעילות גומלין בין מולקולות הדבקה בתגובה chemoattractants כגון גורמים משלימים, כמוקינים, או טסיות דם, הפעלת גורם. ⁴

<p class = "jove_content"> בעוד מתגלגל ליקוציט ב venules postcapillary מתווכת בעיקר עם ligands מרשם שלהם, הדבקה של חברת leukocytes כדי האנדותל הוא selectin מבוקר באמצעות כבילת מולקולות הדבקה אינטר (ICAM) וכלי דם הסלולר על ידי האינטראקציה של selectins ⁵ מולקולות הדבקה (VCAM). ^{6, 7}

תקן הזהב עבור בהתבוננות vivo של אינטראקציה ליקוציט-האנדותל היא טכניקה של מיקרוסקופיה intravital, תוארה לראשונה בשנת 1968. ⁸

אף על פי מודלים שונים של IRI (איסכמיה reperfusion פציעה) תוארו של איברים שונים, ^9-12 רק מעטים מתאימים להדמיה ישירה של גיוס ליקוציט במיטה כלי הדם ברמה גבוהה של איכות התמונה. ⁸

אנחנו כאן לקדם את מיקרוסקופיה דיגיטלית epifluorescence intravital של ורדיד postcapillary ב microcirculation cremastericשל חולדה ¹³ כשיטה נוחה איכותית וכמותית לנתח גיוס ליקוציט לחקר-IRI ברקמת השריר מפוספס ולספק מדריך מפורט עבור להשיג את הטכניקה. בנוסף, אנו מדגימים ממכשולים נפוצים ולספק עצות שימושיות אשר צריך לאפשר לקורא להעריך באמת, ובטוח לבצע את השיטה.

בשלב ידי פרוטוקול צעד שאנו מתארים כיצד להתחיל עם הרדמה הנשימה מבוקרת תחת פיקוח מספיק כדי לשמור על בעל החיים מורדם היטב במשך תקופות זמן ארוכות יותר. לאחר מכן, אנו מתארים את הכנת cremasteric כסיד שטוח דק של רזולוציה אופטית יוצאת מן הכלל ולספק פרוטוקול הדמיה ליקוציט ב IRI כי כבר נקבעה גם במעבדות שלנו.

Protocol

1. הרדמה וניטור

1. אתיקה לאומיים ומוסדיים מתאימים צריך להיות במקום לפני ביצוע ניסויים בבעלי חיים. בעקבות אישור ועדת האתיקה להרדים חולדות ממין זכר ספרג Dawley עם משקל גוף 120-180 גרם. לספק 2-3% בנפח isoflurane לתיבת פרספקס דרך מאדה isoflurane ומניחים בתוך עכברוש.
2. ברגע רמה מתאימה של ההרדמה מושגת (חוסר תגובה הבוהן או קמצוץ הזנב) חולדה משוקלל והתגלח על אזור צוואר הרחם הגחון.
3. מניחים את עכבר שכיבה הגב על משטח חימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף על 37 מעלות צלזיוס וליישם isoflurane ב כרך 2% באמצעות מסיכת סיליקון.

הצעדים הבאים הם הכנה הטובה ביותר להשיג באמצעות מיקרוסקופ כירורגי.

4. להכנת קנה הנשימה, העורק הראשי ואת וריד הצוואר, מבצעים חתך אופקי 2 ס"מ העור באזור OF חריץ suprasternal ולגייס את בלוטות הרוק רוחבית.
5. כעת להתמודד עם שרירי הצוואר הגחון. בזהירות להפריד אותם קו האמצע ולמצוא את קנה הנשימה. לחשוף 1 - 2 ס"מ של קנה הנשימה ומקום מלקחיים מיקרו מתחתיה על מנת להעלות את זה.
6. עכשיו לחתוך בערך באמצע בצד הגחון של קנה הנשימה. שימו לב לא לחתוך עד הסוף, אם כן, את הקצוות של קנה הנשימה יגלוש לתוך החזה להיות מאוד קשה לעבוד איתו.
7. הכנס צינור Abbocath (14 גר) משמש צינור קנה הנשימה לתוך החלק התחתון של קנה הנשימה, אשר בעבר היה מחובר למכונת הנשמה חיה. טיפ: קיבעון המשרד על מהדק מגנט וכן תפירת של קנה הנשימה סביב הצינור הוא חיוני כדי לשמור על צינור קנה הנשימה במקום. בדרך כלל אנו משתמשים הטרילין 5/0 תפר, תפר חומר דומה אך ניתן להשתמש בו.
8. הנשימה יכול להיות מבוקר נפח (תדירות, 35 - 45 נשימות לדקה, נפח גאות, 4.5-5 מ"ל; FiO ₂ 14 Atelectasis ניתן למנוע על ידי שמירה על חיובי סוף הנשיפה הלחץ של 5 עד 10 מ"מ של H ₂ א ^'15
9. עבור canulation הראש, השרירים sternohyoid הזכות מופרד על ידי דיסקציה קהה כדי לאתר את העורק הראשי.
10. להפריד את העצב התועה בקפידה מתוך עורק הצוואר ו הר העורק על כ מלקחיים מיקרו בזווית לעצור זרימת הדם מהלב.
11. עוברים שתי חתיכות באורך שווה של תפר מתחת בעורק הראש. בהתייחסו לב, תפר דיסטלי יותר קשור בחוזקה לחסום זרימת הדם מאזור הראש בעוד תפר הפרוקסימלי קשורה ברפיון סביב עורק הצוואר.
12. באמצעות מספריים מיקרו חתך קטן נעשה לתוך עורק הצוואר בין שתי ליגטורות.
13. הכנס קטטר פוליאתילן (0.28 מ"מ קוטר פנימי) מלא תמיסת מלח רגיל המחובר מתמר הלחץ.
14. ראםאובה את מלקחיים מיקרו נושא קטטר יותר לתוך העורק. ואז להדק את הקשירה סביב הפרוקסימלי בעורק ו קטטר. טיפ: יישום תפר הפרוקסימלי 2 מונע דימום לאחר הסרת מלקחיים מיקרו.
15. לקשור את המיתר דיסטלי סביב הראש ואת קטטר לעגינת נוסף.
16. מעקב אחר הרדמה ברציפות בשיעור ניטור הלב לחץ הדם. בצע לסירוגין העורקים גז דם ניתוחים באמצעות גז Analyzer דם. ¹⁶ קצב הלב נמוך יותר מאשר 300 BPM או עולה על 360 פעימות לדקה, כמו גם לחץ הדם הממוצע יורד מתחת 80 מ"מ כספית עבור יותר מ 5 דקות הם הקריטריונים הדרה. ^{17, 18} שמור על הדם pH בגבולות פיזיולוגיים (7.35-7.45). במקרה ניסוי צריך להסתיים בשל שיעורי ניטור תקינות, לשרוט את בעל החיים על ידי נקע בצוואר או exanguation.

עבור היישום תוך ורידי של צבעי ניאון או סמים אחרים הועניין f, לבצע את הפעולות הבאות:

17. להתמקד באזור של וריד הצוואר השמאלי באמצעות מיקרוסקופ כירורגי.
18. עם מלקחיים בכל יד, לקרוע את fascia דקה כדי לחשוף את וריד הצוואר. הר וריד על כ מלקחיים מיקרו בזווית. זרימת הדם לאחר מכן להפסיק.
19. באמצעות מלקחיים, שתי חתיכות באורך שווה של תפר מועברים תחת וריד הצוואר תואמים את canulation הראש. לקשור את תפר דיסטלי בחוזקה תפר הפרוקסימלי באופן רופף סביב וריד הצוואר.
20. לעשות חתך קטן לווריד הצוואר ולהכניס קטטר פוליאתילן (0.28 מ"מ קוטר פנימי) כי כבר סמוקות עם מי מלח. סמן את החתך ואת canulation יכול להיות תובעני יותר זמן רב יותר מזה של הראש.
21. חוט קטטר אל הלב להדק את המיתר הכי קרוב ללב סביב הוריד את הקטטר.
22. לאחר patency conforming, לקשור ליגטורה דיסטלי סביב הקטטר. טיפ: קיבוע נוסף של בוצנתרים ה עם סרט עשוי למנוע dislodgment.
23. יש לשטוף צנתרים לעתים קרובות כדי למנוע קרישת intraluminal.

2. הכנת שריר Cremaster

1. אנו משתמשים בשלב אלומיניום של 1.5-2 ס"מ עובי הדמיה cremasteric. בשלב במהירות מאמצת את הטמפרטורה הרצויה של כרית חימום ובכך להקל על בקרת החום של רקמת cremasteric. זה חיוני ללימודים דלקת. לחלופין פלטפורמת פרספקס ניתן להשתמש על פי תקנה של הטמפרטורה cremasteric קשה יותר. מכניסים את שק האשכים במרכז הבמה.
2. החתך הראשוני נעשה העור fascia הזרע חיצוני מעל שק האשכים בסופו של דבר דיסטלי מאוד ואחריו הרחבה זהירה של שטח subdermal באמצעות מספריים עדינים. אל תיגע הרקמה הבסיסית עם המכשירים.
3. ברגע רקמה חשופה היא טבולה מראש מחוממת (37 ° C) פוספט שנאגרו פתרון Wi מלוחיםה סידן ומגנזיום. החל פתרון קבוע לרקמת כל חשוף.
4. רקמת החיבור בין fascia הזרע חיצוני שריר cremaster מוסרת בזהירות כדי לשחרר את השרירים cremaster מן הרקמה הסובבת.
5. המשטח החיצוני של השריר cremaster מכן הוא פונה בזהירות של רקמת חיבור. Superfusion רציף במהלך הנתיחה הידרטים רקמת החיבור, להקל על ניראות ההסרה.
6. לתפור את הקצה הדיסטלי של שק cremaster להחזיק ומעט להרחיב את סוף השקית.
7. לחתוך את הקצה הדיסטלי של שק על ההיבט הגחון וכן להאריך את החתך proximally באמצעות מספריים מיקרו. בזהירות לצרוב כלי דם בנוסח חתך ניצול כויה תרמית. למנוע צריבה מיותרת להגביל גירויים דלקתיות נוספות. טיפ:. זרימת הדם דינמיקה ליד בפריפריה ההכנה משתנים לפי הנזק לרקמות ¹⁹ לכן, כדי למזער אתSE משפיע על איסוף נתונים, כלי דם ליד מרכז הכנה אמור לשמש עבור דימות.
8. Cremaster פתוח שוכב על כן אלומיניום אבל עדיין מחובר באמצעות רצועה דקה יותרת האשך מתחת האשך. המשקף את האשך לצד אחד חושפת את הרצועה כולל עורק וריד קטן אשר מתחבר יותרת האשך. השתמש כויה לאטום את כלי ולהעסיק את המספריים מיקרו לקצץ את הרצועה המחברת בין האשך ורקמות cremasteric.
9. דחף בעדינות בחזרה אשך בודד לתוך תעלת מפשעתי. מחברים אחרים לכרות האשך לאחר ליגטורה פרוקסימלי (orchiectomy) יחד עם פנקס אופנה הקשורים מפשעתי. ²⁰ במודל רגיש ההפעלה הנגרמת IRI ליקוציט אנחנו מנסים למנוע את כל הגירויים כירורגיות נוספות, ולכן אנו נמנעים resecting testis, שהיא בדרך כלל לא צריך לקבל חשיפה מספקת של השריר cremaster.
10. בנוסף 1תפר קיבעון ארבע קצוות של רקמה (2 בכל צד) ולצרף את החוטים כדי הקלטות בזהירות להפיץ את רקמת cremasteric רדיאלית על הבמה אלומיניום. השארת הפער בין הבמה אלומיניום הכניסה החיצוני של תעלת מפשעתי מפשט חיתוך cremasteric לאחר מכן על איסכמיה.
11. מקום שני הקצוות של קטטר פוליאתילן (0.28 מ"מ קוטר פנימי) קרוב רקמות cremasteric להתקנה superfusion. ודא לומן ללא אוויר, כדי למנוע בועות אוויר בתא נוזל בסופו של דבר.
12. למתוח קו של וזלין (וזלין) סביב השריר cremaster באמצעות מזרק. הקו צריך להאריך את גודל פיסת כיסוי המשמש כיסוי.
13. כדי ליצור תא נוזל, במקום להחליק מכסה מרובע (32 × 32 מ"מ) על רקמות cremasteric ובתקיפות לחבר את הקצוות לקו וזלין.
14. במקרה רקמות cremasteric לא superfused בתרופה מסוימת, החלפת מתמשך של השפעת הסביבהid היא חיונית. בקשה אחת של פוספט שנאגרו תמיסת מלח עם סידן ומגנזיום לתוך תא שנוצר עשוי אז להיות מספיק. גירוי מקומי עם תרופות עם זאת יש לבצע ברציפות בשיעור של 3 מ"ל לשעה באמצעות משאבת מיקרו זלוף.
15. רקמת cremasteric מוכן כעת הדמיה מיקרוסקופית.

3. Intravital ההתקנה

ההגדרה הבסיסית intravital עשוי להשתנות. הדמיה epifluorescence הניסויים צריך להתבצע בחדר חשוך.

1. בעלי חיים מועבר בשלב של המיקרוסקופ epifluorescence intravital מצויד 470 ננומטר הוביל מקור האור הזוהר של EPI-תאורה. השתמש טבילה במים אובייקטיבי (20 × / 1.0) כדי להשיג הגדלה של כ × 800. שיא תצפיות באמצעות מצלמה ברזולוציה גבוהה דיגיטלית רשומות חנות במחשב אישי להערכת מחובר.
2. תיוג ליקוציט, להזריק rhodamine6G באמצעות קטטר לווריד הצוואר בריכוזים של משקל מ"ג / ק"ג 0.4 הגוף.
3. בחר ורדיד postcapillary לצורך השגחה. גודל כלי השיט צריך לנוע בין 20-60 מיקרומטר וזרימת הדם אמור להיות מספיק. כדי למזער את ההשפעה של הפעלה מראש של רקמה, כלי בלבד, שבו הוא מתגלגל ליקוציט <20 cells/30 שניות את מספר התאים חסיד <10 cells/200μm של האנדותל venular עשוי להיות מנוצל לניתוח נוסף.
4. במידת האפשר, עד 3 venules postcapillary ניתן להשתמש לצורך השגחה, אך הם צריכים להיות ממוקם בחלק המקביל רקמות cremasteric כדי למנוע בלבול כלי בנקודות זמן שונות.

4. איסכמיה reperfusion פגיעה (IIR)

1. בואו רקמות לייצב במשך 30 דקות.
2. לבצע הקלטה של ​​30 שניות לקבוע ערכי הבסיס של גלגול דבקות ליקוציט ו. באופן אידיאלי, ליצור בשלושה הקלטות בסך הכל הבסיס לאמת את התאמספרים ולקבל סטיות תקן.
3. בעדינות למקם קליפ כלי Biemer בסביבות סוף בקרבה גדולה של רקמת cremasteric נחשף באמצעות מלקחיים יישומים. קיפאון צריך להתרחש מיד ניתן דמיינו ידי מיקרוסקופ epifluorescence בסעיף כלי הנצפה.
4. מגוון רחב של קורסים הזמן יכול להיות מנוצל בהתאם לרמת הנזק הנדרש. אנחנו מיישמים את 30 דקות של זמן איסכמיה כפי שתואר על ידי מחברים אחרים. ^21-23 הסר מהדק כלי לאחר מכן. אפשר להזרים דם כדי לייצב עוד 15 דקות.
5. ההקלטות הבאות של משך 30 שניות יכול להתבצע לאורך כל התקופה reperfusion (למשל 30 שניות כל 15 דקות). להציל את ההקלטות באופן דיגיטלי לצורך ניתוח לא מקוון.
6. על סיום הניסוי, עכברוש הוא מורדמים על ידי פריקה צוואר הרחם בהרדמה מספיק על ידי לחיצה על מכשיר קהה, כמו קצה של להב קהה מספריים בבסיס הגולגולת. עם זאתיד, בבסיס הזנב נמשך במהירות, גורם הפרדת חוליות צוואר הרחם מהגולגולת.

5. וידאו מנותק פלייבק ניתוח

1. לניתוח וידאו מחובר השמעה כדאי להשתמש בתוכנה המאפשרת מבחר של תמונות שונות ותצפית של רצף וידאו בהילוך איטי. התאם את הניגודיות והבהירות באופן הולם. אנו משתמשים בתוכנה המסופקת על ידי היצרן של מיקרוסקופ המאפשר מדידות אורך הגדלה דיגיטלית.
2. כימות של גלגול ליקוציט, הגדרת קו וירטואלי שחוצה כלי אנכית העולה בקנה אחד בכל הרישומים. ספירת כדוריות דם לבנות מתגלגל שעוברים את הקו תוך 30 שניות ידני.
3. כימות של leukocytes חסיד, הגדר 200 כלי מיקרומטר סעיף העולה בקנה אחד ברשומות כל ²³ ספירת לויקוציטים הנראים בבירור להישאר סטטית במהלך 30 שניות -. ובכך definאד חסיד בשם. ²⁴

6. נציג תוצאות

IRI של שריר cremaster אין כל השפעה על לחץ הדם הממוצע (MAP), קצב הלב ואת רמת החומציות בדם

באמצעות התקנה הנ"ל (איור 1), חקרנו microcirculation ב IRI על פרוטוקול 2 שעות, אולם זמן תצפית הרבה יותר זמן עד 6 שעות אפשרי. כפי שניתן לראות בתרשים 2, IRI של שריר cremaster אין השפעה משמעותית על מחזור הדם macrohemodynamic עכברוש כמו לחץ הדם וקצב הלב אומר להישאר יציב לאורך כל תקופת החקירה. יתר על כן אנו במעקב הומאוסטזיס על ידי מדידות תכופות של עורקי הדם pH זה נע בגבולות פיזיולוגיים משמעותיים לא הראו הבדלים בין קבוצות.

IRI גורם מתגלגל ליקוציט במחזור cremasteric

האינטראקציה האנדותל ליקוציט הוא מפתחאירוע דלקת חריפה. באמצעות מיקרוסקופ intravital מצאנו עלייה של הזמן תלוי במספר leukocytes מתגלגלים IRI של שריר cremaster (איור 3 א) תואמים לנתונים קודמים ^{21, 25.} רולינג רכוב לאורך זמן 2 שעות תצפית מרבי של 137.63 ± 22.55% מערך הבסיס לאחר 120 דקות של זמן reperfusion והגיע אז מובהקות סטטיסטית בהשוואה לחיות הדמה החדשות המופעלים (137.63 ± 22.55 לעומת 99.43 ± 14.04% מערך הבסיס).

IRI גורם הידבקות ליקוציט במחזור cremasteric

לצורך הערכה נוספת של אינטראקציה ליקוציט-האנדותל ניתחנו הידבקות ליקוציט ב סעיף 200 כלי מיקרומטר. IRI גרמו לעלייה במספר כדוריות דם לבנות חסיד באופן משמעותי חריגה ערכי דמה פעלו בעלי חיים לאחר 60 דקות (118.33 ± 6.83 לעומת 96.27 ± 5.78% מערך הבסיס) ו ASCE נוסףnded ידי 120 דקות של reperfusion (איור 3 ב).

לסיכום שתואר במודל vivo מספקת נתונים עקביים של הפעלת ליקוציט חריפה בהישרדות תוך חיים IRI ויציבות מחזור הדם היא מוצדקת.

באיור 1. תרשים זרימה א 'לביצוע intravital מיקרוסקופיה epifluorescence לפגיעה reperfusion איסכמיה של שריר cremaster עכברוש. בעקבות ההכנות הדרושות הרדמה וניטור, שרירים cremaster חולדה נחשפת הדמיה. רשומות של הפעלת ליקוציט נלקחים לפני ואחרי איסכמיה רקמות. ניתוח וידאו לאחר מבוצע הטוב ביותר מקוון. ב ' דמות סכמטית על ההתקנה intravital המוצע. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה .

<p class = "jove_content" FO: keep-together.within עמודים = "תמיד">
איור 2. IRI של שריר cremaster אין כל השפעה על לחץ הדם הממוצע (MAP), קצב הלב ואת רמת החומציות בדם. ממוצע לחץ הדם () וקצב לב (ב) היו במעקב כל 30 דקות במהלך הניסוי באמצעות מתמר הלחץ לאחר canulation של זכות עורק התרדמה. מדידת ה-pH בדם העורקי (ג) בוצעה לאחר 0, 60, 120 דקות. הערכים הם ממוצע ± SEM של 6 חולדות שונות נע על רמות פיזיולוגיות ללא הבדלים משמעותיים בין קבוצות. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה .

איור 3. IRI עולה ליקוציטאנדותל, אינטראקציה במחזור cremasteric. אחרי תיוג של leukocytes עם rhodamine 6G (0.4 מ"ג / ק"ג משקל גוף) מיקרוסקופיה epifluorescence intravital שימש כדי לקבוע ליקוציט-האנדותל אינטראקציה לפגיעה reperfusion על פרוטוקול 120 דקות אחרי 30 דקות של איסכמיה רקמות. רשומות צולמו בהגדלה של כ × 800. א IRI מגביר באופן משמעותי את מספר כדוריות דם לבנות מתגלגלים venules postcapillary של שריר cremaster ידי 120 דקות של reperfusion בעוד מתגלגל ליקוציט נשאר יציב לאורך כל הניסוי ברקמות cremasteric כי לא עבר איסכמיה. ערכים ממוצע ± SEM של 6 חולדות ציין. # P <0.05 באמצעות מבחן t מזווג. ב 'מספר leukocytes חסיד הוא גדל באופן משמעותי בסעיף כלי 200μm שנבחרו באקראי postcapillary לאחר 30 דקות של איסכמיה cremasteric ואחרי 60 דקות של reperfusion רקמות. תוצאות לקבל גם מומחדש בולטת לאחר תקופה שעות 2 reperfusion. ערכים ממוצע ± SEM של 6 חולדות ציין. # P <0.05 באמצעות מבחן t מזווג. תמונות ג נציג של ורדיד postcapillary לפני איסכמיה (משמאל) ו -120 דקות לאחר IRI (מימין). לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה .

Discussion

ליקוציט-האנדותל אינטראקציה, הייצור של מינים החמצן מגיב והפעלה של מערכת המשלים הם התכונות העיקריות של תפקוד לקוי של IRI הנגרמת לרקמה. ²⁶ microcirculation הרקמה הפגועה נחשב כאתר נפרד עבור הופעת דלקת. מלבד הניסויים ב vivo לשעבר כגון קאמרית מבחני הזרימה ^{27, 28} זה חובה לספק מבוססים מודלים של הדמיה intravital כדי להעריך עוד יותר את in vivo הרלוונטיות. למרות IRI היה מעורב מערכות איברים שונים, אנחנו כאן לתאר את השיטה באופן שיטתי לבחון ליקוציט-האנדותל אינטראקציה לפגיעה reperfusion של רקמת שריר מפוספס כי תוארה לראשונה על ידי באאז ואח' ^13, ולכן רלוונטית במיוחד בכירורגיה דש (איור 1). ²⁹ כאשר ההנחה היא שלאחר איסכמי פגיעה ברקמות של איברים אחרים כולל מנגנוני דלקת אותם, מודל המתואר יכול לשמש גיאנ עקרון תובנות מנגנוני פתופיזיולוגיים של IRI, בתנאים הרלבנטיים, כגון אוטם שריר הלב, שבץ מוחי או איסכמיה במעי.

בעלי חיים המשמשים

המודל המוצג כאן הוא מתאים לרוב מכרסמים כולל חולדות ועכברים. במשך תקופה ארוכה של הדמיה כי יש צורך במודל זה אנו מעדיפים בדרך כלל חולדות כמו ניתוח בקנה הנשימה נפח הנשימה מבוקרת שניתן לבצע בקלות. בשילוב עם הדמיה הלב וכלי הדם דרך העורקים canulation, חולדות אפשר לשמור הדם ויציב homeostatically שעות (איור 2). רקמת cremasteric יתר על כן הוא נרחב יותר אצל חולדות מאשר אצל עכברים משאיר יותר אפשרויות הדמיה postcapillary. למרות הכנת הרקמה עשוי להיות קל יותר מתבצעות בחולדות בירה, יש לשקול כי רקמת cremasteric ובמיוחד fascia cremasteric הוא דק יותר בחולדות צעירות (100 -150 גר ') ובכך מקטין את הקרינה הרקע כיסוי של additiרקמת fascial onal. עם זאת היתרון של שימוש בעכברים עבור במיקרוסקופ intravital הוא הזמינות של בעלי חיים מהונדס, שלא יסולא בפז כדי להבהיר את תפקידם של גנים בודדים באירועים microcirculatory ויסות.

סוגי רקמות

מאז תוארה לראשונה, מיקרוסקופיה intravital נעשה שימוש במגוון רחב של תכשירים microcirculatory כולל נרתיק האב לחי, אוזן ארנב, לפדר מכרסם, ו cremaster. אחד החיסרון העיקרי קשור רוב ההכנות האלה היא הפעלת הפוטנציאל של התאים על ידי מניפולציה כירורגית מלווה עם עלייה זמנית של leukocytes מתגלגלת חסיד כי תוארה היטב לפדר. ³⁰ הכנת Cremasteric יש אפוא להתבצע בזהירות רבה. הניסיון שלנו, לחת תכופים של רקמה חשוף צריבה מגבילה, כמו גם רקמות מספקת ייצוב תקופה של לפחות 30 דקות מסייע למנוע או להפחית ליקוציטגירוי.

היתרון העיקרי של הדמיה cremasteric על הדמיה mesenteric הוא נגישות קלה כי חוסך פתיחת חלל הבטן. טראומה כירורגית הכוללת מצטמצם גובר על אחד כמה פרספקס צפייה הבמה תאורה, לשדר או מנוצל כמו פרוטוקול שלנו, פלטפורמת אלומיניום תרמית מבוקרת של EPI-illumintaion מתבצע בקלות. יתר על כן, שומן שאוסף סביב venules postcapillary אצל בעלי חיים מבוגרים הגבלת הדמיה mesenteric התאור סביב רקמת cremasteric.

ליקוציט תיוג

חומרים כימיים כמו rhodamine 6G ^31, acridine כתום או אדום acridine אשר גרעינים כתם ו / או אברונים תאיים שאינם נמצאים בתאי דם אדומים מצטברים סלקטיבי leukocytes (ובמידה מסוימת של טסיות ותאי אנדותל). ³² אנחנו מעדיפים להשתמש 6G rhodamine לגילוי ליקוציט בריכוזים של משקל מ"ג / ק"ג 0.4 הגוף, שיש לו יחסי ציבורeviously הוכח אין השפעה משמעותית על הפעלת נויטרופילים. הראה ³³ Acridine כתום ברקע הרבה יותר phototoxicity הכתם באמצעות vasoconstriction arteriolar תצפיות (שלא פורסמו). ניצול של נוריות עבור הקרינה הדמיה מספק ספקטרום עירור מדויק ומאפשר יישומים מורכבים יותר כמו שילוב של אורכי גל שונים כגון לצורך זיהוי של הפעלת ליקוציט ו דליפת נימי בעת ובעונה אחת ולכן יש את שיטת הבחירה בעתיד ב vivo הדמיה.

IRI ברקמות cremasteric

יישום איסכמיה לשריר cremaster ניתן לבצע בקלות לחלוטין משקף את תנאי רלוונטיות קלינית כגון ניתוח דש חינם. יתר על כן, שינויים כגון איסכמיה קר, חם או איסכמיה superfusion cremasteric עם חומרים המשפיעים על דלקת ניתן ליישם בקלות. הזרקת Intrascrotal אולי את שיטת צ'וילספירה כאשר הטיפול של רקמה cremasteric צורך שעות או ימים לפני ההקלטה.

מגוון רחב של קורסים הזמן עבור IRI יכול להיות מנוצל בהתאם לרמת הנזק הנדרש. כאן אנו מתארים מודל של איסכמיה 30 דקות כדי לייצר רמות משמעותיות של גלגול אחרי שעתיים של reperfusion (איור 3) על ידי ספירת כדוריות הדם הלבנות העוברים נקודה קבועה על פני כלי השיט. כמו עלייה מתגלגל מתון זה משאיר מספיק פוטנציאל לעורר leukocytes ב IRI באמצעות תרופות אחרות של עניין. עם זאת, מגוון רחב של קורסים הזמן יכול להיות מנוצל בהתאם לרמת ההפעלה ליקוציט נדרש ^{21, 25} הידבקות ליקוציט נמדדת בדרך כלל על ידי ספירת תאים הנראים היטב בדפנות כלי הדם ב - 100. 200 מיקרומטר מתיחה שנותרו נייח של 30 s , אם כי זה יכול להשתנות בין מעבדות. ראינו גידול ניכר במספר leukocytes חסיד של IRI כי יש משמעותי לאחר 60 דקות.

לסיכום מיקרוסקופיה epifluorescence intravital ב IRI של רקמת שריר מפוספס יכול להתבצע גם ברקמות עכברוש cremasteric כפי שהיא מספקת נתונים לשחזור של בהפעלת ליקוציט vivo למחקר דלקת.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the equipment:	Company:	Catalogue No.:	Comments:
Forene 100% (V/V)	Abbot	B506	API isoflurane
Terylene Suture	Serag Weissner	OC108000
Portex Fine Bore Polythene Tubing	Smiths Medical	800/100/100	0.28 mm inner Diameter
0,9% saline solution	Fresinus Kabi	808771
Change-A-tip deluxe cautery kit	Bovie Medical	DEL1
Abbocath -T 14G	Venisystems	G713 - A01	used as lens tube
Servo Ventilator 900C	Maquet		used as animal ventialtor
Logical pressure transducer	Smiths Medical	MX1960
Sirecust 404 Monitor	Siemens
ABL 700 Benchtop Analyzer	Radiometer		for blood gas measurement
Heating pad	Effenberger	8319
Aluminum stage	Alfun	AW7022
Surgical microscope OPMI 6-SDFC	Carl Zeiss
Microsurgical instruments lab set	S&T	767
Biemer vessel clip	Diener	64.562
Applying forceps	Diener	64.568	for Biemer vessel clip
Rhodamine 6G	Sigma-Aldrich	R4127
Vaseline white DAB	Winthrop	2726853
Cover glasses			32x32 mm
Intravital setup
Zeis Axio Scope A-1 MAT	Carl Zeis	490036	epifluorescence microscope
470 nm LED	Carl Zeis	423052	fluorescence light source
Colibri 2 System	Carl Zeis	423052
W Plan-Apochromat 20x/1,0 DIC	Carl Zeis	421452	water immersion objective
AxioCam MRm Rev. 3 FireWire	Carl Zeis	426509	high resolution digital camera
Axio vision LE software	Carl Zeis	410130	use for offline analysis