Summary
We beschrijven een werkwijze voor het lokaliseren van fluorescent gemerkte eiwitten in electronenmicroscoop. Fluorescentie wordt eerst gelokaliseerd met foto-geactiveerde lokalisatie microscopie op ultradunne secties. Deze beelden worden dan uitgelijnd op elektronenmicrofoto's van dezelfde sectie.
Abstract
Kaart brengen van de verdeling van eiwitten is essentieel voor het begrijpen van de functie van eiwitten in een cel. Fluorescentie microscopie wordt veelvuldig gebruikt voor eiwit lokalisatie, maar subcellulaire is vaak afwezig in fluorescentie beelden. Immuno-elektron microscopie, anderzijds, kunnen lokaliseren eiwitten, maar de techniek is beperkt door een gebrek aan verenigbare antilichamen slecht behoud van de morfologie en omdat de meeste antigenen niet zijn blootgesteld aan het preparaatoppervlak. Correlatieve benaderingen kunnen verwerven van de fluorescentie beeld van een hele cel eerste, hetzij van immuno-fluorescentie of genetisch gemerkte eiwitten. Het monster wordt vervolgens gefixeerd en ingebed voor elektronenmicroscopie, en de beelden worden gecorreleerd 1-3. Echter, de lage resolutie fluorescentie beeld en het gebrek van de vaste markeringen de weg aan de precieze lokalisatie van eiwitten.
Als alternatief kan fluorescentie beeldvorming worden gedaan na het behoud van het model in kunststof. Indeze benadering het blok is verdeeld, en fluorescentiebeelden en elektronenmicrofoto's van dezelfde sectie gecorreleerd 4-7. De diffractielimiet van licht in de overeenkomende afbeelding verbergt de locaties van individuele moleculen en de fluorescentie vaak uitstrekt voorbij de grens van de cel.
Nano-resolutie fluorescentie elektronenmicroscopie (nano-FEM) is ontworpen voor het lokaliseren van eiwitten op nano-schaal door beeldvorming die zelfde delen met behulp van foto-geactiveerde lokalisatie microscopie (PALM) en elektronenmicroscopie. PALM overwint de diffractiegrens door beeldvorming individuele fluorescerende eiwitten en vervolgens de kaart brengen zwaartepunt van elk fluorescerende vlek 8-10.
We schetsen de nano-FEM techniek in vijf stappen. Eerst wordt het monster gefixeerd en ingebed onder omstandigheden die de fluorescentie van gelabelde eiwitten behouden. Anderzijds het hars blokken ultradunne coupes in segmenten (70-80 nm) die gemonteerdeen dekglas. Ten derde wordt de fluorescentie afgebeeld in deze gebieden af met de Zeiss PALM microscoop. Ten vierde zijn electron dichte structuren afgebeeld in dezelfde profielen met een scanning elektronenmicroscoop. Vijfde, de fluorescentie en electronenmicroscoop uitgelijnd met gouddeeltjes als markers vertrouwenspunt. Samengevat kunnen de subcellulaire lokalisatie van fluorescent gemerkte eiwitten worden bepaald nanometerresolutie in ongeveer een week.
Protocol
1. Hoge druk Vriezen
- Bereid de cryo-beschermer door toevoegen van 0,2 g BSA in 1 ml van een geschikt medium voor specimen (bijvoorbeeld kweekmedium voor celkweek M9 C. elegans). Incubeer de buis in een 37 ° C waterbad totdat BSA opgelost.
- Voorafgaand aan het bevriezen, vul de geautomatiseerde vries-substitutie-apparaat (Leica AFS) met vloeibare stikstof
- Stel de AFS-programma: -90 ° C gedurende 5-30 uur *, 5 ° C / hr tot -60 ° C, -60 ° C gedurende 2 uur (of selecteer "pauze" optie als u gebruik maakt van Leica AFS 2), 5 ° C / hr tot -30 ° C en -30 ° C gedurende 72 uur. Indien de AFS machine is in staat van het hebben van meer dan vijf stappen, moet de -30 ° C stap worden vervangen door een "pauze" optie ingesteld op 0 uur, en twee verdere stappen moeten worden toegevoegd: 10 ° C / uur tot -20 ° C en 24 uur bij -20 ° C. Als de machine is beperkt tot vijf stappen opgerichte ander programma in een ander geheugen slot als volgt: 10 ° C / hr tot -20 ° C en 24 hr bij -20 ° C.
* De tijd hier kan worden aangepast, zodat de -60 ° C stap begint in de vroege ochtend. - Bereid 1% osmiumtetroxide voorraadoplossing door mengen 0,1 g osmiumtetroxide kristallen (EMS, RT19134) met 10 ml watervrij aceton (EMS, # RT10016). Bereid de fixeermiddelen in een 50 ml conische buis als volgt. Voeg eerst 1 ml milliQ water en los daarin 0,02 g kaliumpermanganaat (EMS, RT20200). Voeg 19 ml aceton en goed mengen. Voeg tenslotte 20 pi 1% osmium stockoplossing in de buis. Aceton is een vrije radicalen en voorkomt zo 11 polymerisatie van plastic, maar het gebruik van aceton als freeze-substitutie medium nodig is voor het behoud morfologie vanwege de interactie met lipiden. Aceton wordt gesubstitueerd met ethanol voorafgaand aan plastic infiltratie. Aliquot 1 ml aan elke Cryovial en houden de fixeermiddelen bevroren door het opslaan van pijpen in vloeibare stikstof.
- Vul een monsterdrager met 20% BSA of bacteriën.Beide 20% BSA en bacteriën dienen als cryo-beschermers. De keuze voor het type van de monsterdrager afhankelijk van de specimen. Voor C. elegans, goed gebruik maken van een 100 um.
- Plaats het monster in de drager en bevriezen met een hoge druk vriezer.
- Na het invriezen en onder vloeibare stikstof, Het analysemonster overbrengen in het cryotube met fixeermiddelen. Zorg ervoor dat het monster blijft onder de vloeistof zijn.
- Herhaal 1,5) - 1,7) totdat alle monsters worden bevroren.
- Breng alle cryobuizen in de AFS-eenheid, en hervat het programma.
2. Freeze-substitutie
- Wanneer de -60 ° C bereikt, place flesjes met 20 ml 95% aceton in de AFS.
- Wanneer de temperatuur -50 ° C bereikt, vervangt de fixeermiddelen met 95% aceton zes keer over de periode van 2 uur.
- Plaats een flacon met 20 ml 0,1% uranylacetaat (Polysciences, # 21447 tot 25) in 95% aceton in de kamer enpre-cool aan -50 ° C.
- Aan het eind van de wasstap, voeg ~ 1 ml uranylacetaat oplossing aan elk flesje. Hervatten van het programma indien nodig.
- Wanneer de temperatuur -30 ° C bereikt, vervangen uranylacetaat met 95% ethanol zes keer over de periode van 2 uur.
- Inmiddels maken 97% glycolmethacrylaat hars (GMA, SPI Supplies / Structure Probe, Inc # 02630-AA) door mengen 22,3 ml GMA, 10 ml n-butylmethacrylaat, 1 ml milliQ water en 0,2 g benzoyl peroxide (katalysator). Bewaar het in glazen flesjes (EMS, # 72632) en de voorbereiding van 30% GMA door het te mengen met 95% ethanol. Niet GMA media op te slaan in plastic buizen omdat de kwaliteit van polymerisatie degradeert met de lange-termijn opslag in polyethyleen-gebaseerde plastics. Pre-cool de GMA oplossing tot -30 ° C.
Traditionele epoxyharsen zoals Epon Araldite en kan niet worden gebruikt in het protocol omdat ze watervrij zuur en die lest fluorescerende eiwitten. Acrylharsen zoals LR White, cEen tolereren een kleine hoeveelheid water en kan het fluorescerende eiwit behouden, maar de zure pH de neiging om de fluorofoor blussen 12. GMA tolereert in feite vereist een kleine hoeveelheid water en alkalisch (pH 8) 12. GMA is helaas een beetje bros. Bovendien GMA geen kruisverbinding met weefsels zoals de traditionele epoxyharsen doen. Deze kenmerken van GMA oorzaak inconsistentie in het snijden van de kwaliteit vooral wanneer doorsnede dunner dan 80 nm.
Hoewel de houdbaarheid van GMA is ongeveer een jaar, dient GMA worden gebruikt binnen 3 maanden na de aankoop om de kwaliteit te waarborgen.
3. Infiltratie en Polymerisatie
Stappen 3.1-3.3 worden uitgevoerd in dezelfde cryovials voor freeze-substitutie. Infiltratie en polymerisatie wordt uitgevoerd bij -30 ° C in de AFS de fluorescerende eiwit behouden.
- Bereid infiltratie media door mengen GMA stock oplossing met 95% ethanol. Incubeer monstersin 30% GMA gedurende 3-5 uur.
- Incubeer monsters in 70% GMA voor 4-6 uur.
- 'S nachts Incubeer monsters bij 97% GMA.
- Op de volgende dag, make-up verse 97% GMA.
- Breng de monsters naar een inbedding schimmel (EBSciences, # TC). Maak een schijf van ACLAR film (EMS, # 50425 tot 10) met behulp van een 3/8 "DISC Punch (Ted Pella Inc) en plaats de schijf in de bodem van de BEEM capsule.
- Exchange de 97% GMA driemaal over 6 uur bij -30 ° C.
- Na de derde uitwisseling, voeg de initiator N, N-dimethyl-p-toluidine (Sigma-Aldrich, # D9912) om GMA in een concentratie van 1,5 ul / 1 ml GMA en breng deze oplossing elk monster matrijs. Onmiddellijk positioneren het model in de inbedding schimmel in de AFS.
Merk op dat benzoyl peroxide is de katalysator en is bij alle stappen zodat infiltratie roeren niet noodzakelijk is. Benzoylperoxide niet polymeriseren de plastic totdat het wordt blootgesteld aan de chemische initiator N, N,-dimethyl-p-toluidine. De initiatiefnemer activeert polymerization onmiddellijk en polymeriseren de hars ook in weefsels binnen 1 uur. Niettemin kan weefsel dropouts tot diepe weefsels het onvolledige polymerisatie. Bovendien heeft GMA niet verknopen het monster en het blok goed, dus het monster te scheiden van de cryoprotectant door te tikken op de matrix van bacteriën.
Als polymerisatie wordt uitgevoerd buiten een AFS moet de inbedding mal bedekt zijn met een Aclar disk blootstelling aan zuurstof blokkeren. GMA niet volledig polymeriseren bij blootstelling aan zuurstof. - Laat de plastic om 's nachts te genezen, hoewel het polymeriseert binnen 1 uur.
- Bewaar het monster in een stikstof gas gevulde vacuümzak (Ziploc) in de vriezer (-20 ° C) tot verdere verwerking zodat fluorescerende eiwitten niet worden blootgesteld aan zuurstof.
4. Snijden
- Opdeling van GMA-ingebedde monsters kan worden uitgevoerd op een wijze die vergelijkbaar is met epon-ingebedde monsters. Extra voorzichtigheid dient te nemenn niet te snijden oppervlak nat is omdat GMA zeer hydrofiel en de linten worden gedreven in het waterbad als zij bevochtigd aan beide zijden.
- Verzamel linten secties (50-80 nm) op een glazen dekglas als een TIRF microscoop wordt gebruikt voor lokalisatie. Gebruik anders een rooster gemaakt voor transmissie elektronenmicroscopie. De snijsnelheid moet worden ingesteld at1.6 mm / s of hoger. Anders kan een lint niet vormen.
- Bewaren secties bij -20 ° C als ze niet onmiddellijk afgebeeld. Bescherm de fluoroforen tegen UV-licht door afdekprofiel houders met aluminiumfolie.
5. PALM Imaging
- Stel de PALM microscoop volgens aanbevelingen van de fabrikant. De temperatuur van een EMCCD camera moet worden ingesteld op -70 ° C of lager.
- Toepassing gouddeeltjes (# 790122-010 - 2x geconcentreerd microsferen-nanospheres.com) in oplossing (ongeveer 50 ui) verdund te beelden. Laat de oplossing gedurende 30 seconden zitten op de coverslip terwijl onder een zwarte geval van de dekking.
- De goudkleurige oplossing blazen naar de rand van het dekglaasje en op te nemen met een Kimwipe.
- Plaats het dekglaasje in een cirkelvormig dekglaasje houder. Indien nodig, van toepassing vacuüm vet aan op de rand van de dekglaasje zijn plaats te houden.
- Toepassing immersie olie aan de onderzijde van het dekglaasje, direct onder de monsters.
- Plaats de monsterhouder in de sleuf aan de tafel van de microscoop. Wees extra voorzichtig niet om de doelstellingen te raken.
- Stel de houder dus het is strak en centreert de secties boven de doelstelling.
- Zoek de secties met behulp van een 10x objectief.
- Ga naar de 100x objectief lens.
- Focus op het monster.
- Localisatie een gebied van belang door het observeren van de sterkte van de fluorescentiesignalen. Gebruik de 488 nm laser en de intensiteit in het menu Kanalen 10%. Focus op het gebied van de helderste fluorescentie. Merk op dat deze stap niet nodig is indien de regio of belang kan worden geïdentificeerd in het helder veld op het oog.
- Schakel de laser tot 561 nm en de intensiteit op 100% te bleken de achtergrond autofluorescentie. Bleach het monster voor ca. 2 min..
- Als de focus verandert tijdens het bleken, laat 5 min. laten verstrijken alvorens het aanpassen van de focus en het vastleggen van beelden. Deze pauze kan de temperatuur stabiliseren. Als de PALM scope is uitgerust met een incubatiekamer, stelt u de temperatuur op 20 ° C en wacht tot ~ 2 uur om de temperatuur in de kamer te stabiliseren.
- Wanneer bleken is voltooid, activeer dan de 405 nm laser en zet deze op de laagste intensiteit.
- Beginnen met het verzamelen van de beelden met 20 frames per seconde. We meestal verzamelen 5.000-6.000 frames per experiment, maar het aantal frames moeten worden aangepast afhankelijk van het doel van het experiment. Als bijvoorbeeld alle eiwitten in een gebied van belang worden afgebeeld moet het framenummer verhoogd.
- Als de signalen zijn schaars of vaag, langzaam increase de 405 nm laser intensiteit.
- Tijdens het overnameproces, moet u de monsters te houden in focus door voorzichtig het aanpassen van de knop als nodig is.
- Wanneer beelden worden verzameld, moet de PALM analyse worden uitgevoerd. Voor tdEos, we filteren alle signalen die fluoresceren langer dan 500 msec, omdat deze signalen zijn waarschijnlijk te wijten aan autofluorescentie.
6. SEM Imaging
- Vóór SEM beeldvorming vlek punten met 2,5% uranylacetaat (in water) gedurende 4 minuten. Was de uranylacetaat grondig met gefilterd milliQ water.
- Nadat de onderdelen zijn gedroogd, koolstof-coat het dekglaasje met behulp van een koolstof sputter totdat het dekglaasje wordt vrij donker. Breng een uiteinde van koolstof geleidende band aan de rand van het dekglaasje en het andere uiteinde op de metalen strook zodat elektronen die zich op het oppervlak van het dekglaasje geaard.
- Monteer het specimen in de SEM kamer (FEI Nova Nano).
- Plaats de VCD detector. Sluit de tank en pomp deze met de hoog vacuüm omgeving.
- Na de evacuatie open kolom klep zodat elektronenbundel wordt toegepast op een specimen.
- Een routine uitlijning van elektronenbundel.
- Zoek het monster.
- Wanneer de scherpstelling is ingesteld, verbinden de monster podium en brengen het podium tot 5 mm onder de paal stuk.
- Neem een lage vergroting beeld van het specimen (~ 5000 x).
- Zoom in op het gebied van de rente en het verkrijgen van hoge vergroting (50.000 x) beelden.
- Ga naar de volgende sectie, en herhaalt u stap 6.10) en 6.11) totdat alle onderdelen worden afgebeeld.
7. Uitlijnen PALM en EM Afbeeldingen
- Open Photoshop en de verworven SEM beelden.
- Maak een nieuw venster met afmetingen van 5.000 x 5.000 pixels en 300 pixels / inch resolutie.
- Kopieer de lage vergroting SEM-beeld in het nieuwe venster (Figuur 1A).
- Schaal de afbeelding, zodat het vulthet hele venster met behulp van de transformatie manipulatie (Ctrl + T voor een Mac).
- Kopieer de hogere vergroting SEM beelden en schalen ze als dat nodig is.
- Horizontaal spiegelen de som TIRF afbeelding door deze te selecteren beeldrotatie van de afbeelding drop-down menu balk.
- Kopieer en plak de som TIRF beeld (van PALM) in een nieuwe laag.
- Scale het beeld met de transformatie manipulatie en draai als nodig is om de fluorescentie van de gouddeeltjes (witte pijlen in Figuur 1A) met de overeenkomstige structuren gevisualiseerd SEM (Figuur 1B) overeenkomen.
- Kopieer de PALM afbeelding in een nieuwe laag en pas dezelfde transformatie (Figuur 1C). Een hogere vergroting beeld kan worden uit het beeld (Figuur 2).
- Voor de presentatie, kopieert u de getransformeerde PALM afbeelding in een nieuwe laag. Selecteer de PALM-signalen, maar niet in de achtergrond door het gebruik van "kleurbereik" in het "selecteer" drop-down menu. Zorg ervoor dat select een achtergrond pixel als referentie pixel en zet de "invert" optie.
- Snijd de gewenste PALM signalen en plak ze op een nieuwe laag.
- Breng transparantie van de achtergrond laag, en zet deze op 10%. Dit maakt visualisatie van de PALM signalen door de achtergrond transparant zonder intensiteit (Figuur 2D).
8. Representatieve resultaten
Histon gelabeld met tdEos stabiel kan worden uitgedrukt in de nematode C. elegans, en de transgene dieren worden verwerkt volgens de hierboven beschreven protocol. De PALM en electronenmicroscoop overgenomen van dezelfde sectie (figuur 1). De beelden uitlijnen, wordt de som TIRF beeld dat de fluorescentie over het gehele tijdsverloop bedragen, bedekt de electronen microscoop. De gouden nanodeeltjes verschijnen in de fluorescentie en electronenmicroscoop en kan worden gebruikt om de twee beelden met de 'lijn transform-functie in Photoshop (figuur 1A en B). Daarna werd dezelfde 'transformatie' geldt voor de PALM (Figuur 1C). Dit vergroting kan constructieve details niet worden onderscheiden, dus we ingezoomd op een gebied nabij het boveneinde van de microfoto (figuur 2). In de hoge vergroting beeld kan subcellulaire details zoals een kern, een nucleolus, nucleaire poriën, en endoplasmatisch reticulum in acht worden genomen. Bovendien zijn de moleculen gelabeld histon uitsluitend gelokaliseerd in de kern, maar niet de nucleolus zoals verwacht. De correlatieve PALM en elektronenmicroscopie staat dus toe eiwit lokalisatie op de hoogste resolutie.
Vijf problemen kunnen afbreuk doen aan de kwaliteit van de beelden. Ten eerste kan ijs kristalschade verstoren ultrastructuur (Figuur 3A en B). Specimens plaatsen in een cryo-beschermingsmiddel zoals bacteriën, waardoor de vermeerdering van ijskristallen vermindert, kan deze schade beperken. Nietteminmen moet nog steeds screenen exemplaren met behulp van elektronenmicroscopie en lever dit met het bevriezen artefacten. Ten tweede, GMA niet cross-link naar weefsels zoals epoxyharsen, en dus exemplaren vaak breken los uit de omringende plastic en stretch, krimpen of zelfs uit val van de sectie (figuur 3C en D). Dissectie van het monster weg van de bacteriën of andere cryo-beschermingsmiddel voor inbedding voorziet in een grotere hechting van de kunststof met het model (Figuur 3C). Evenzo structuren zoals lipidedruppels in de darm vaak dissociëren van het weefsel door de afwezigheid van verknoping (Figuur 3E). Derde onvolledige polymerisatie van plastic oorzaken rekken of te vouwen weefsels (Figuur 3F), de aanwezigheid van zuurstof in het monster belemmert ook de polymerisatie van GMA. Vierde snijden de slechte kwaliteit van GMA leidt vaak tot een inconsistent morfologie (figuur 3G en H). GMA secties moet gesneden worden op70 nm of dikker en met een snelheid van ongeveer 1,6 mm / s snijden artefacten te minimaliseren. Ten vijfde, achtergrond autofluorescentie van stof op het dekglaasje of sectie is onvermijdelijk. Autofluorescentie van stof kan worden geminimaliseerd door het gebruik van vooraf gereinigd dekglaasjes en door het vermijden van vervuiling door stof uit kimwipes en filterpapier, zoals beschreven in het protocol. Het PALM analyse programma kan bewerken van signalen van het monster of plastic dat langer fluoresceren dan normale signalen van fluorescerende eiwitten (Figuur 2 A en B). Het uiteindelijke beeld zal dan ook vrij zijn van dergelijke artefacten.
Figuur 1. Uitlijnen fluorescentie en electronenmicroscoop met goud nanodeeltjes. (A) een lage vergroting elektronen microfoto van een dwarsdoorsnede van C. elegans de uiting van de gelabelde histon tdEos :: HIS-11. White eenrrows geven 100 nm elektron-dichte gouden nanodeeltjes voor PALM beeldvorming die dienen als vaste merktekens aangebracht. (B) De gouden kralen fluoresceren bij blootstelling aan ~ 580 nm licht en schep de vaste merktekens in de fluorescentie beeld. De som TIRF beeld wordt uitgelijnd op een elektronenmicrofoto basis van de locatie van de vaste merktekens. De som TIRF beeld vertegenwoordigt alle fotonen gedetecteerd door de camera tijdens de experimentele tijdsverloop. Merk op dat de lichtvlekken op het linker (witte pijl) komen voort uit de clusters van gouddeeltjes. (C) Een PALM beeld wordt vervolgens toegevoegd aan de elektronenmicrofoto en geroteerd en vertaald basis van de waarden bepaald uit de uitlijning van de som TIRF afbeelding (B). Klik hier om groter bedrag bekijken .
Figuur 2. Correlatieve nano-Fem met histon-eiwitten. (A) Som TIRF beeld van tdEos :: HIS-11 verworven van een dun plakje (70Nm). (B) Overeenkomstige PALM beeld van tdEos :: HIS-11. Autofluorescentie (witte pijl) langer dan 500 msec werd gefilterd door de PALM programma. (C) Electron microfoto van een kern verkregen van dezelfde sectie. (D) Correlatieve PALM beeld en electronen microscoop van tdEos :: HIS-11. Fluorescentie wordt stevig gelokaliseerd in het chromatine in de kern.
Figuur 3. Problemen in verband met nano Fem. (A) Electron microfoto van een C. elegans lichaam spieren zonder ijs kristal schade. (B) Electron microfoto van een lichaam spier met ijskristal schade. In plaats van afzonderlijke doorsneden worden actine en myosine filamenten samengevoegd in aggregaten door de vorming van ijskristallen. (C, D) Low vergroting elektronenmicrofotos, waarin de dissociatie van wormen van de omringende media. De sectie is vervormd in een monster die door de cryo-beschermende bacteriën (D) omgeven dan wanneer het monster wordt omringd door plastic (C). De bacteriële cryo-beschermer in de gallette moet worden ontleed uit de buurt van de vaste monster voor plastic inbedding. Merk op dat het dier aan de rechterzijde in (D) was schuin doorgesneden, en aldus de vorm niet door de vervorming van weefsels. (E) Electron microfoto darm, met openingen van weefsels (zwarte pijlen). (F) elektronenmicrofoto van zenuw ring, die gevouwen secties het onvolledige polymerisatie van plastic (zwarte pijlen). (G, H) Electronenmicroscoop van neuronen van hetzelfde specimen, doorsneden op verschillende tijdstippen. Het behoud van weefsels is prachtig op een dag (G), maar een dergelijke morfologie wordt verduisterd door de inconsequente snijden kwaliteit (H). Klik hier om view grotere afbeelding.
Discussion
Hier beschrijven we hoe u fluorescerende eiwitten te bewaren in plastic, lokaliseren de fluorescerende eiwitten in secties, en het imago van de ultrastructuur met behulp van elektronenmicroscopie. Eiwitten werden gelokaliseerd onder de diffractielimiet met behulp van PALM microscopie tot nanometer-resolutie. Om dit protocol aan te passen aan bepaalde exemplaren, moeten de volgende parameters worden overwogen: fluorofoor, kwantificering en uitlijning.
De keuze van fluorescerend eiwit of organische fluorofoor afhankelijk van de toepassing en het modelsysteem. We hebben getest een verscheidenheid van fluorescerende eiwitten, met inbegrip van EGFP, YFP, Citrien, mEosFP, mEos2, tdEos, Morange, PA-mCherry en Dendra 12. Het behoud van fluorescentie van elk fluorofoor was vergelijkbaar, suggereert dat alle fluorescerende eiwitten kunnen worden bewaard volgens de beschreven werkwijze. We kozen tdEos omdat het goed uitgedrukt C. elegans, eiwitten bleven functioneel wanneer gefuseerd met tdEos, en omdat defotoactivering eigenschappen waren optimaal voor PALM microscopie. Echter, aggregatie of mislukte uitdrukking van tdEos is af en toe 12 waargenomen.
Afhankelijk van de toepassing kan een andere fluorofoor beter geschikt. In veel gevallen is het niet nodig om een foto-geactiveerde fluorescent eiwit te gebruiken. Eenvoudige correlatieve fluorescentie elektronenmicroscopie vereist geen foto-geactiveerde fluorescent eiwit. GFP of organische kleurstoffen kunnen worden gebruikt om beelden van fluorescentie-gemerkte eiwitten in de voorgaande hoofdstukken diffractiegrens. Bijvoorbeeld kan men een beeld axon in een neuropil gebruik van fluorescentiemicroscopie en correleren het fluorescentiesignaal met een bepaalde axon in een elektronenmicroscopische opname van de fluorescentie beeldvorming op een fluorescentiemicroscoop. Superresolutie andere technieken, zoals gestimuleerde emissie depletion microscopy (STED) 12 grondtoestand uitputting microscopie gevolgd door individuele molecule return (GSDIM) 13, engestructureerde verlichting microscopie (SIM) 14, vereisen geen foto-geactiveerde fluorescerende eiwitten. Bovendien superresolutie beeldvormingstechnieken die organische kleurstoffen 9,15,16 of de intrinsieke eigenschap van fluorescerende probes 17 worden toepasbaar zijn.
In PALM, kan het aantal moleculen worden gekwantificeerd door fluorescentie van elk molecuul in ruimte en tijd gescheiden. Echter, kwantificering misleidend zijn om vier redenen: oxidatie, undercounting, overcounting, en overexpressie. Ten eerste kan een deel van de fluorescerende eiwitten worden gedenatureerd of geoxideerd tijdens monsterverwerking 5,12. Hoewel ~ 90% van het fluorescentiesignaal werd bewaard door fixatie en inbedding in ons protocol kan oxidatie van het fluorescerende eiwit later het monster is doorgesneden en het oppervlak blootgesteld aan zuurstof. Anderzijds de activering van foto-activeerbare eiwitten stochastisch en dus meerdere moleculen kan zijngeactiveerd in een gegeven diffractie beperkte plek 8. Fluorescentie van de meerdere moleculen verschijnt als een spot, en dus het totaal aantal eiwitten worden undercounted. Ten derde kan een soortgelijk probleem tot overcounting. In PALM, wordt elke fluorescerende eiwit gelokaliseerd en vervolgens op "gewist" door bleken. Echter, fluorescente eiwitten terug uit de donkere toestand, zonder permanent gebleekt 18. Dergelijke moleculen worden vervolgens meerdere keren geteld. Vierde gemerkte eiwitten worden uitgedrukt als transgenen en zijn vaak aanwezig in meerdere kopieën, wat kan leiden tot overexpressie. Daarom kan kwantificering van PALM worden gebruikt om te schatten maar niet nauwkeurig de aantal moleculen op een bepaalde locatie.
De uitlijning van een PALM beeld met een elektronenmicrofoto ook een uitdaging omdat de resolutie verschil in licht-en elektronenmicroscopie en vervorming veroorzaakt door de elektronenbundel. Gouddeeltjes dienen als stevig localized de vaste markeringen in electronenmicroscoop. Echter fluoresecence van gouddeeltjes niet foto-geactiveerde, en weergegeven als een buigingsbegrensde vlek. Dus de plaatsing van een fluorescentiebeeld over een elektronenmicrofoto is een schatting. Verstoringen kunnen ook voortvloeien uit interacties van elektronen met het kunststof profiel. Acrylharsen zoals GMA minder stabiel onder de elektronenbundel en de afmetingen van de kunststof kan worden gewijzigd. Onder deze omstandigheden kan het uitlijnen van de fluorescentie met ultrastructuur vereisen niet-lineaire transformatie van de vaste markers.
Disclosures
Productie en gratis toegang tot dit artikel wordt gesponsord door Carl Zeiss, Inc
Acknowledgments
Wij danken Harald Hess en Eric Betzig voor toegang tot de PALM microscoop voor proof-of-principle experimenten, Richard Fetter voor het delen van fixatie-protocollen, reagentia en bemoediging. Wij danken Michael Davidson, Geraldine Seydoux, Stefan Eimer, Rudolf Leuba, Keith Nehrke, Christian Frøkjr-Jensen, Aude Ada-Nguema en Marc Hammarlund voor DNA-constructen. We danken ook Carl Zeiss Inc voor de toegang tot de Zeiss PAL-M, een beta-versie van de Zeiss ELYRA P.1 PALM microscoop.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High-pressure freezer | ABRA | HPM 010 | EMPact and HPM 100 from Leica or hpf-01 from Wohlwend can also be used. |
| Automated freeze substitution unit | Leica Microsystems | AFS 2 | AFS 1 can also be used. |
| Zeiss PALM |  Carl Zeiss, Inc. |
ELYRA P.1 | Nikon and Vutara also sell commercial PALM microscopes. |
| Scanning electron microscope | FEI | Nova nano | Other high-resolution SEM microscopes can be used. |
| Acetone | EMS | RT10016 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 459844-1L | |
| Osmium tetroxide | EMS | RT19134 | |
| Potassium permanganate | EMS | RT20200 | |
| Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A3059-50G | |
| Uranyl acetate | Polysciences, Inc. | 21447-25 | pH of uranyl acetate from this company is slightly higher. |
| Glycol methacrylate (GMA) | SPI Supplies | 02630-AA | Low acid, TEM grade. |
| N,N-Dimethyl-p-toluidine | Sigma-Aldrich | D9912 | |
| Cryo vials | Nalge Nunc international | 5000-0020 | |
| Glass vials | EMS | 72632 | |
| Aclar film | EMS | 50425-10 | |
| BEEM capsule | EBSciences | TC | Polypropylene |
| 3/8" DISC punches | Ted Pella, Inc. | 54741 | |
| Gold nanoparticles | microspheres-nanospheres.com | 790122-010 | Request 2x concentrated solution |
References
- Polishchuk, R. S., et al. Correlative light-electron microscopy reveals the tubular-saccular ultrastructure of carriers operating between Golgi apparatus and plasma membrane. J. Cell Biol. 148, 45-58 (2000).
- Oberti, D., Kirschmann, M. A., Hahnloser, R. H. R. Correlative microscopy of densely labeled projection neurons using neural tracers. Front. Neuroanat. 4, 24 (2010).
- Bishop, D., et al. Near-infrared branding efficiently correlates light and electron microscopy. Nat. Meth. 8, 568-570 (2011).
- Sims, P. A., Hardin, J. D. Fluorescence-integrated transmission electron microscopy images: integrating fluorescence microscopy with transmission electron microscopy. Methods Mol. Biol. 369, 291-308 (2007).
- Micheva, K., Smith, S. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55, 25-36 (2007).
- Nixon, S. J., et al. A single method for cryofixation and correlative light, electron microscopy and tomography of zebrafish embryos. Traffic. 10, 131-136 (2009).
- Kukulski, W., et al. Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision. J. Cell Biol. 192, 111-119 (2011).
- Betzig, E., et al. Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat. Methods. 3, 793-795 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).
- Weibull, C., Christiansson, A. Extraction of proteins and membrane lipids during low temperature embedding of biological material for electron microscopy. J. Microsc. 142, 79-86 (1986).
- Watanabe, S., et al. Protein localization in electron micrographs using fluorescence nanoscopy. Nat. Methods. 8, 80-84 (2011).
- F lling, J., et al. Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return. Nat. Methods. 5, 943-945 (2008).
- Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J. Microsc. 198, 82-87 (2000).
- Wombacher, R., et al. Live-cell super-resolution imaging with trimethoprim conjugates. Nature Methods. 7, 717-719 (2010).
- Dertinger, T., Colyer, R., Iyer, G., Weiss, S., Enderlein, J. Fast, background-free, 3D super-resolution optical fluctuation imaging (SOFI). PNAS. 106, 22287-22292 (2009).
- Burnette, D. T., Sengupta, P., Dai, Y., Lippincott-Schwartz, J., Kachar, B. Bleaching/blinking assisted localization microscopy for superresolution imaging using standard fluorescent molecules. PNAS. , (2011).
- Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy. Nat. Meth. 8, 527-528 (2011).
