Summary
Vi beskriver en fremgangsmåde til at lokalisere fluorescerende mærkede proteiner i elektronmikrofotografier. Fluorescens først lokaliseret ved brug af foto-aktiveret lokalisering mikroskopi på ultratynde sektioner. Disse billeder bliver derefter tilpasset elektronmikrografer af den samme sektion.
Abstract
Kortlægning af fordelingen af proteiner er væsentlige for forståelsen af funktionen af proteiner i en celle. Fluorescensmikroskopi benyttes flittigt til protein lokalisering, men subcellulær sammenhæng er ofte fraværende i fluorescens billeder. Immuno-elektronmikroskopi, på den anden side, lokalisere kan proteiner, men teknikken er begrænset af en mangel på kompatible antistoffer, dårlig bevarelse af morfologi og fordi de fleste antigener ikke udsættes for prøvens overflade. Korrelative fremgangsmåder kan opnå den fluorescens billede fra en helcelle først, enten fra immuno-fluorescens eller genetisk mærkede proteiner. Prøven bliver derefter fikseret og indlejret til elektronmikroskopi, og billederne er korrelerede 1-3. Imidlertid lav opløsning fluorescensbillede og manglen på referencemærker markører til hinder for nøjagtig lokalisering af proteiner.
Alternativt kan fluorescensimagografi ske efter bevare prøven i plast. Idenne fremgangsmåde, blokken er opdelt, og fluorescensbilleder og Elektronmikrografier af den samme sektion er korreleret 4-7. Imidlertid diffraktionsgrænsen af lys i det korrelerede billedet skjuler placeringen af individuelle molekyler, og fluorescensen ofte strækker sig ud over grænsen for cellen.
Nano-opløsning fluorescens elektronmikroskopi (nano-FEM) er designet til at lokalisere proteiner ved nano-skala af imaging de samme dele med foto-aktiveret lokalisering mikroskopi (PALM) og elektronmikroskopi. PALM overvinder diffraktionsgrænsen ved billeddannende enkelte fluorescerende proteiner og efterfølgende kortlægge centroiden af hver fluorescerende spot 8-10.
Vi skitserer nano-FEM teknik i fem trin. Først bliver prøven fikseret og indlejret under anvendelse af betingelser, der bevarer fluorescens af mærkede proteiner. Dels harpiksen blokke er opdelt i ultratynde segmenter (70-80 nm), som er monteretpå et dækglas. For det tredje er fluorescens afbildet i disse afsnit ved hjælp af Zeiss PALM mikroskop. Det fjerde er elektrontætte strukturer afbildet i de samme sektioner ved hjælp af et scanningselektronmikroskop. Femte er de fluorescens og Elektronmikrografier opstillet under anvendelse guldpartikler som referencemærker markører. Sammenfattende kan den subcellulære lokalisering af fluorescens-mærkede proteiner bestemmes ved nanometer opløsning i cirka en uge.
Protocol
1. Højtryks Frysning
- Forbered cryo-beskyttelsesmiddel ved tilsætning af 0,2 g BSA i 1 ml af et passende medium til prøve (fx dyrkningsmedium til cellekulturer, M9 for C. elegans). Inkubér glasset i et 37 ° C vandbad, indtil alt BSA er opløst.
- Inden nedfrysning, fylde den automatiserede fryse-substitution enhed (Leica AFS) med flydende nitrogen
- Sæt AFS-programmet: -90 ° C i 5-30 timer *, 5 ° C / time til -60 ° C, -60 ° C i 2 timer (eller vælg "pause", hvis du bruger Leica AFS 2), 5 ° C / time til -30 ° C og -30 ° C i 72 timer. Hvis AFS maskinen er i stand til at have mere end fem trin, bør -30 ° C trin erstattes med en "pause" er indstillet til 0 timer, og to yderligere skridt bør tilføjes: 10 ° C / time til -20 ° C og 24 timer ved -20 ° C. Hvis maskinen er begrænset til fem trin, der er nedsat et andet program i en anden hukommelse slot som følger: 10 ° C / time til -20 ° C og 24 timerr ved -20 ° C.
* Tiden her kan indstilles således, at -60 ° C trin starter i de tidlige morgentimer. - Fremstilling af 1% osmiumtetroxid stamopløsning ved at blande 0,1 g osmiumtetroxid krystaller (EMS, RT19134) med 10 ml vandfrit acetone (EMS, # RT10016). Forberede fiksativer i et 50 ml konisk rør på følgende måde. Først tilsættes 1 ml milliQ vand, og derefter opløses i det 0,02 g kaliumpermanganat (EMS, RT20200). Tilføj 19 ml acetone og bland det godt. Endelig tilsættes 20 ul 1% osmium stamopløsning ind i røret. Acetone er en fri radikal-scavenger 11 og således forhindrer polymerisation af plast, men anvendelse af acetone som et fryse-substitution medium er nødvendig for at bevare morfologi på grund af dens interaktion med lipider. Acetone vil blive substitueret med ethanol forud for plast infiltration. Alikvot 1 ml til hver cryovialet og holde de fiksativer frosset ved at lagre rørene i flydende nitrogen.
- Fyld en prøve bærer med 20% BSA eller bakterier.Både 20% BSA og bakterier tjener som cryo-beskyttelsesmidler. Valget af typen af prøven bæreren afhænger af prøven. For C. elegans, skal du bruge en 100 um godt.
- Prøven anbringes i bæreren og fryse det ved hjælp af en højtryks-fryser.
- Efter frysning og under flydende nitrogen, overføre prøven i cryotube indeholder fikseringsmidler. Kontroller, at prøven forbliver i væsken hele tiden.
- Gentag 1,5) - 1,7), indtil alle prøverne er frosne.
- Overfør alle cryorør i AFS-enhed, og genoptage programmet.
2. Fryse-substitution
- Når temperaturen når -60 ° C, sted hætteglas indeholdende 20 ml 95% acetone i AFS.
- Når temperaturen når -50 ° C, erstatte fikseringsmidler med 95% acetone seks gange over en periode på 2 timer.
- Placere et hætteglas indeholdende 20 ml 0,1% uranylacetat (Polysciences, # 21447-25) i 95% acetone i kammeret ogfor-afkøle den til -50 ° C.
- Ved afslutningen af vasketrinnet, tilsættes ~ 1 ml uranylacetat opløsning til hvert hætteglas. Genoptag programmet, hvis det er nødvendigt.
- Når temperaturen når -30 ° C, udskifte uranylacetat med 95% ethanol seks gange over en periode på 2 timer.
- I mellemtiden udgør 97% glycol methacrylatharpiks (GMA, SPI Supplies / Structure Probe, Inc., # 02630-AA) ved at blande 22,3 ml GMA, 10 ml n-butylmethacrylat, 1 ml milliQ-vand, og 0,2 g benzoylperoxid (katalysator). Opbevar det i hætteglas (EMS, # 72.632) og forberede 30% GMA ved at blande det med 95% ethanol. Opbevar ikke GMA medier i plastrør, fordi kvaliteten af polymerisation forringes med den langsigtede opbevaring i polyethylen-baserede plast. For-afkøle GMA opløsningen til -30 ° C.
Traditionelle epoxyharpikser såsom Araldit og Epon kan ikke anvendes i protokollen, da de er vandfri og sure hvilket slukker fluorescerende proteiner. Acrylharpikser, såsom LR White, cen tolerere en lille mængde vand og kan bevare fluorescerende protein, men dens sur pH har tendens til at udslukke fluoroforen 12. GMA tolererer faktisk kræver en lille mængde vand og er alkalisk (pH 8) 12. GMA er desværre lidt skørt. Desuden GMA ikke cross-link med væv som traditionelle epoxyharpikser Do. Disse karakteristika GMA årsag inkonsistens i skæring kvalitet især når snit tyndere end 80 nm.
Selv om holdbarheden af GMA er omkring et år, bør GMA anvendes inden for 3 måneder efter købet for at sikre dets kvalitet.
3. Infiltration og Polymerisation
Trin 3,1-3,3 udføres i de samme kryoglas anvendes til fryse-substitution. Infiltration og polymerisation udføres ved -30 ° C i AFS at bevare det fluorescerende protein.
- Forbered infiltration medier ved blanding af GMA stamopløsningen med 95% ethanol. Inkuber prøveri 30% GMA i 3-5 timer.
- Inkubér prøver i 70% GMA for 4-6 timer.
- Inkubér prøver i 97% GMA natten over.
- Den næste dag, gøre op frisk 97% GMA.
- Overfør prøver til en indlejring skimmel (EBSciences, # TC). Forbered en skive af ACLAR film (EMS, # 50.425-10) ved hjælp af en 3/8 "DISC Punch (Ted Pella Inc.), og anbring disken i bunden af BEEM kapsel.
- Udveksling af 97% GMA tre gange i 6 timer ved -30 ° C.
- Efter den tredje udveksling, tilsættes initiatoren N, N-dimethyl-p-toluidin (Sigma-Aldrich, # D9912) til GMA ved en koncentration på 1,5 gl / 1 ml GMA og anvende denne opløsning til hver prøve mold. Umiddelbart placere prøven i det omsluttende Skimmelsvamp i AFS.
Bemærk, at benzoylperoxid katalysatoren og til stede ved enhver infiltration trin så omrøring er ikke nødvendig. Benzoylperoxid ikke polymerisere plasten, indtil det udsættes for den kemiske initiator N, N,-dimethyl-p-toluidin. Initiatoren aktiverer polymerization straks og vil polymerisere harpiksen selv i væv inden for 1 time. Ikke desto mindre kan væv dropouts resultere i dybe væv på grund af ufuldstændige polymerisation. I øvrigt har GMA ikke tværbinde prøven til blokken godt, så adskille prøven fra kryobeskyttelsesmidlet ved at trykke på den pågældende matrix bakterier.
Hvis polymerisationen udføres uden for en AFS, skal det omsluttende formen dækkes med en Aclar disk til at blokere udsættelse for oxygen. GMA ikke polymerisere fuldstændigt når de udsættes for oxygen. - Tillader plast at hærde natten over, selv om det polymeriserer løbet af 1 time.
- Opbevar en prøve i en nitrogengas-fyldt vakuumpose (Ziploc) i fryseren (-20 ° C) indtil videre bearbejdning, således at fluorescerende proteiner ikke udsættes for oxygen.
4. Sektionering
- Sektionering af GMA-embedded prøver kan udføres på en måde svarende til den for EPON-indlejrede enheder. Ekstra forsigtighed bør tagen ikke at befugte sektionering overflade, fordi GMA er meget hydrofil og båndene vil blive drevet i vandbadet hvis de befugtes på begge sider.
- Collect bånd af sektioner (50-80 nm) på et dækglas, hvis en TIRF mikroskop anvendes til lokalisering. Ellers skal du bruge et gitter lavet til transmissionselektronmikroskopi. Skærehastigheden skal indstilles at1.6 mm / s eller højere. Ellers kan et bånd ikke dannes.
- Store dele ved -20 ° C, hvis ikke afbildes umiddelbart. Beskyt fluoroforer fra UV-lys ved at dække sektion indehavere med aluminiumsfolie.
5. PALM Imaging
- Opstil PALM mikroskop i henhold til producentens anbefalinger. Temperaturen af et EMCCD kamera skal sættes til -70 ° C eller derunder.
- Anvendes guldpartikler (# 790122-010 - 2x koncentreret, mikrokugler-nanospheres.com) i opløsning (ca. 50 ul) til prøven, der skal afbildes. Lad opløsningen sidde i 30 sekunder på forsidernelæbe, mens under en sort cover sag.
- Fjern guld opløsning ved at blæse det til kanten af dækglasset og absorbere det med en Kimwipe.
- Sæt dækglasset i en cirkulær dækglas holder. Om nødvendigt anvender vakuum fedt på fælgen for at holde dækglasset på plads.
- Anvendelse immersionsolie til undersiden af dækglasset, direkte under prøverne.
- Sæt prøveholderen i sprækken på scenen af mikroskopet. Vær særlig forsigtig med ikke at røre målene.
- Juster holderen, så det er stramt, og centrerer afsnittene ovenfor målet.
- Find afsnittene ved brug af en 10x objektiv.
- Skift til 100x objektiv.
- Fokus på prøven.
- Lokalisere et område af interesse ved at observere styrken af fluorescenssignaler. Brug 488 nm laser og øge intensiteten i Kanalmenuen til 10%. Fokus på de områder lyseste fluorescens. Bemærk, at dette trin ikke nødvendigt, hvis området of interesse, kan identificeres i det lyse område i øjet.
- Skift laseren til 561 nm og øge intensiteten til 100% blege for baggrunden autofluorescens. Bleach prøven for ~ 2 min.
- Hvis fokus ændres under blegning, tillade 5 min skal gå, før justering af fokus og tage billeder. Denne pause tillader temperaturen at stabilisere sig. Hvis PALM anvendelsesområde er udstyret med en rugekammeret, indstille temperaturen til 20 ° C og vente på ~ 2 hr at stabilisere temperaturen i kammeret.
- Når blegning er færdig, aktiveres 405 nm laser og indstil det til den laveste intensitet.
- Begynd at indsamle de billeder ved 20 billeder per sekund. Vi indsamler normalt 5.000-6.000 frames per eksperiment, men antallet af billeder bør justeres afhængig af formålet med forsøget. For eksempel, hvis alle proteiner i et område af interesse skal afbildes af ramme nummer øges.
- Hvis signalerne er sparsomme eller svag, langsomt increase den 405 nm laser intensitet.
- Under købet proces, skal du sørge for at holde prøver i fokus ved forsigtigt at justere grebet efter behov.
- Når billederne indsamles, bør PALM analyseres. For tdEos, filtrer vi ud eventuelle signaler, der fluorescerer længere end 500 ms, fordi disse signaler skyldes sandsynligvis autofluorescens.
6. SEM Imaging
- Før SEM imaging, plette dele med 2,5% uranylacetat (i vand) i 4 minutter. Vask den uranylacetat grundigt med filtreret milliQ vand.
- Når alle dele er tørret, carbon-coat dækglasset ved anvendelse af en carbon sputter indtil dækglasset bliver forholdsvis mørkt. Anvende den ene ende af carbon ledende tape på kanten af dækglasset og den anden ende på metallet stub således at elektroner, der akkumuleres på overfladen af dækglasset er jordforbundet.
- Monter prøven ind i SEM kammer (FEI Nova Nano).
- Indsæt VCD detektoren. Kammeret lukkes og pumpe det ved hjælp af højvakuum indstilling.
- Når evakueret, åbnes kolonnen ventil, således at elektronstrålen påføres en prøve.
- Udfør en rutinemæssig tilpasning af elektronstråle.
- Find prøven.
- Når fokus er indstillet, skal du linke prøven scenen og opdrage scenen til 5 mm under polstykket.
- Tag en lav forstørrelse billede af prøven (~ 5.000 x).
- Zoome ind på området af interesse og opnå stor forstørrelse (50.000 x) billeder.
- Flytte til næste afsnit, og gentag trin 6.10) og 6.11), indtil alle sektioner er afbildet.
7. Justering Palm og EM Images
- Åbn Photoshop og de erhvervede SEM billeder.
- Opret et nyt vindue med dimensionerne med 5.000 x 5.000 pixels og 300 pixels / inch opløsning.
- Kopiere lille forstørrelse SEM billedet i det nye vindue (figur 1A).
- Skalere billedet, så det fylderhele vinduet ved hjælp af transformationen manipulation (Command + T for en Mac).
- Kopier højere forstørrelse SEM billeder og skalere dem efter behov.
- Vend sum TIRF billedet vandret ved at vælge billede rotation fra billedet drop-down menu bar.
- Kopier og indsæt sum TIRF billede (fra PALM) i et nyt lag.
- Skalere billedet ved hjælp af transformation manipulation og derefter rotere efter behov for at passe til fluorescensen af guldpartiklerne (hvide pile i figur 1A) med de tilsvarende strukturer ses ved SEM (figur 1B).
- Kopier PALM billedet i et nyt lag og anvende samme transformation (figur 1C). En større forstørrelse billede kan ekstraheres fra billedet (figur 2).
- For præsentationen, skal du kopiere den transformerede PALM billedet i et nyt lag. Vælg de PALM signaler, men ikke baggrund ved hjælp af "color range" i "vælg" drop-down menu. Sørg for at select en baggrund pixel som reference pixel og tænde for "vende" valgmulighed.
- Skær de ønskede PALM signaler og indsætte dem til et nyt lag.
- Påfør gennemsigtighed til baggrunden lag, og indstil den til 10%. Dette muliggør visualisering af håndfladen signaler ved at gøre baggrunden gennemsigtig uden at kompromittere deres intensitet (figur 2D).
8. Repræsentative resultater
Histon mærket med tdEos kan stabilt udtrykt i nematoden C. elegans, og de transgene dyr blev behandlet under anvendelse af protokollen beskrevet ovenfor. Håndfladen og elektron mikrografer blev erhvervet fra det samme afsnit (Figur 1). At bringe billederne, er summen TIRF billede, som opsummerer den fluorescens over hele tidsforløbet, overlejres på elektronmikrografi. Nanopartiklerne af guld vist i både fluorescens og Elektronmikrografier og kan anvendes til at tilpasse de to billeder ved hjælp af 'TransfOrm 'funktion i Photoshop (figur 1A og B). Derefter blev samme "transformation" værdien for den PALM billede (figur 1C). Ved denne forstørrelse, kan strukturelle detaljer ikke skelnes, så vi zoomet ind i et område nær den øverste ende af mikrografiet (figur 2). I stor forstørrelse billedet, kan subcellulære detaljer som en kerne, en nucleolus, nukleare porer, og endoplasmatiske reticulum overholdes. Endvidere er de mærkede histon-molekyler udelukkende lokaliseret til kernen, men ikke til nucleolus, som forventet. Den modsvarende PALM og elektronmikroskopi således mulighed for protein lokalisering i den højeste opløsning.
Fem problemer kan forringe kvaliteten af billederne. For det første kan iskrystal beskadigelse forvride ultrastruktur (figur 3A og B). At placere prøver i et cryo-beskyttelsesmiddel, såsom bakterier, hvilket reducerer udbredelsen af iskrystaller, kan reducere denne beskadigelse. AlligevelMan skal stadig screene prøver ved elektronmikroskopi og kassere dem med frysning artefakter. For det andet, er GMA ikke tværbinde til væv som epoxyharpikser, og således prøver ofte bryde løs fra den omgivende plast og strækning, krympe eller falde ud af sektionen (figur 3C og D). Dissektion af prøven væk fra bakterier eller andre cryo-beskyttelsesmiddel før indlejring giver mulighed for øget adhæsion af plast til modellen (figur 3C). Tilsvarende strukturer såsom lipiddråber i tarmen ofte dissocierer fra vævet på grund af fravær af tværbinding (fig. 3E). For det tredje den ufuldstændige polymerisation af plast årsager strækker sig eller foldning af væv (figur 3F), tilstedeværelsen af oxygen i prøven også hæmmer polymerisationen af GMA. Det fjerde, de fattige sektionering kvaliteten af GMA ofte resulterer i en usammenhængende morfologi (figur 3G og H). GMA sektioner skal skæres på70 nm eller tykkere og ved en hastighed på omkring 1,6 mm / s for at minimere skæring artefakter. Femte, baggrund autofluorescens fra støv på dækglasset eller sektionen er uundgåelig. Autofluorescens fra støv kan minimeres ved hjælp af forrensede dækglas og ved at undgå støv forurening fra Kimwipes og filterpapir som beskrevet i protokollen. Det PALM analyse program kan redigere signaler fra prøven eller plast, der fluorescerer længere end typiske signaler fra fluorescerende proteiner (figur 2 A og B). Den endelige billede vil derfor være fri for sådanne artefakter.
Fig. 1. Justering fluorescens og Elektronmikrografier med guld nanopartikler. (A) En lav forstørrelse elektronmikrografi af et tværsnit af C. elegans udtrykker de mærkede histon tdEos :: HIS-11. Hvid arrows viser 100 nm elektrontæt guld nanopartikler anvendt forud for PALM billeddannelse, der tjener som referencemærker. (B) De guldperler fluorescerer ved udsættelse for ~ 580 nm lys og skabe referencemærker i fluorescensbillede. Summen TIRF billedet rettet ind et elektronmikrografi baseret på placeringen af referencemærkerne. Summen TIRF Billedet repræsenterer alle fotonerne detekteres af kameraet under det eksperimentelle tidsforløb. Bemærk, at de lyse pletter på den øverste venstre (hvid pil) stammer fra klynger af guldpartikler. (C) En PALM billedet sættes derefter til den elektronmikrografi og roteret og translateret baseret på værdierne bestemt ud fra tilpasning af summen TIRF billede i (B). se større tal .
Figur 2. Korrelationsmaalinger nano-FEM hjælp histon fusionsproteiner. (A) Sum TIRF billede af tdEos :: HIS-11 erhvervet fra en tynd sektion (70Nm). (B) Tilsvarende PALM billede af tdEos :: HIS-11. Autofluorescens (hvid pil) varede længere end 500 msek blev filtreret ud af PALM programmet. (C) elektronmikrofoto af en kerne erhvervet fra den samme sektion. (D) korrelativ PALM image og elektronmikrografi af tdEos :: HIS-11. Fluorescens tæt lokaliseret til kromatin i kernen.
Figur 3. Problemer i forbindelse med nano five. (A) elektronmikrografi af et C. elegans organ muskler uden iskrystal beskadigelse. (B) elektronmikrografi af et organ muskel med iskrystal skader. I stedet for diskrete tværsnit, der actin og myosin filamenter klappes sammen til aggregater på grund af dannelse af iskrystaller. (C, D) Lav forstørrelse elektronmikrografis, viser dissociationen af orme fra det omgivende medium. Strækningen er mere forvrænget i en prøve, der er omgivet af cryo-beskyttende bakterier (D), end når prøven er omgivet af plast (C). Det bakterielle cryo-beskyttelsesmiddel i gallette bør dissekeres bort fra den faste prøve før plastic indlejring. Bemærk, at dyret til højre i (D) var snit skråt, og således formen ikke skyldes forvridning af væv. (E) elektronmikrografi af tarmen, der viser dropouts af væv (sorte pile). (F) elektronmikrografi af nerve ring, der viser foldningen af sektioner på grund af ufuldstændig polymerisation af plast (sorte pile). (G, H) Elektronmikrografier af neuroner fra den samme prøve, snittet på forskellige datoer. Bevarelsen af væv er fantastisk på én dag (G), men sådan morfologi sløres af den inkonsekvente sektionering kvalitet (H). Klik her for at vIEW større tal.
Discussion
Her beskriver vi, hvordan du bevarer fluorescerende proteiner i plast, de fluorescerende proteiner i sektioner lokalisere, og image ultrastrukturen hjælp elektronmikroskopi. Proteiner blev lokaliseret under diffraktionsgrænsen hjælp PALM mikroskopi til nanometer opløsning. For at tilpasse denne protokol til bestemte prøver, skal følgende parametre tages i betragtning: fluorofor, kvantificering og tilpasning.
Valget af fluorescerende protein eller organiske fluorofor afhænger af anvendelsen og modelsystemet. Vi har testet en række fluorescerende proteiner, herunder EGFP, YFP, citrin, mEosFP, mEos2, tdEos, mOrange, PA-mCherry, og Dendra 12. Bevarelsen af fluorescensen fra hver fluorofor var ens, hvilket antyder, at alle fluorescerende proteiner kan bevares ved hjælp af den beskrevne fremgangsmåde. Vi valgte tdEos fordi det udtrykkes godt i C. elegans, proteiner forblev funktionelle ved fusion til tdEos, og fordi densfoto-aktivering karakteristika var optimal for PALM mikroskopi. Imidlertid har aggregering eller undladt ekspression af tdEos er lejlighedsvis observeret 12.
Afhængigt af programmet, kan en anden fluorofor være bedre egnet. I mange tilfælde er det ikke nødvendigt at anvende en foto-aktiverede fluorescerende protein. Simple korrelativ fluorescens elektronmikroskopi kræver ikke tilgængeligt aktiveret fluorescerende protein. GFP eller organiske farvestoffer kan anvendes til at afbilde fluorescens fra mærkede proteiner i afsnittene ovenfor diffraktionsgrænsen. For eksempel kan et billede en Axon i en neuropil ved hjælp af fluorescensmikroskopi og korrelere fluorescenssignal med en bestemt axon i et elektronmikrografi af afbilde fluorescens på et fluorescensmikroskop. Andre super-opløsning teknikker, såsom stimuleret emission udtømning mikroskopi (STED) 12, grundtilstand udtynding mikroskopi efterfulgt af individuel molekyle retur (GSDIM) 13, ogstruktureret lys-mikroskopi (SIM) 14 kræver ikke tilgængeligt-aktiverede fluorescerende proteiner. Desuden super-opløsning billeddannelse teknikker, der bruger organiske farvestoffer 9,15,16 eller den iboende egenskab af fluorescerende prober 17 er umiddelbart anvendelig.
I PALM, kan antallet af molekyler kan kvantificeres, fordi fluorescensen af hvert molekyle er adskilt rumligt og tidsligt. Dog kan kvantificering være vildledende for fire grunde: oxidation, undercounting, overcounting, og overekspression. For det første kan en brøkdel af de fluorescerende proteiner denatureres eller oxideres under prøvebearbejdning 5,12. Selv ~ 90% af fluorescenssignalet blev bevaret gennem fiksering og forankring i vores protokol, kan oxidation af det fluorescerende protein være efter at prøven har været i snit og overfladen udsættes for oxygen. Dels aktiveringen af foto-aktiverbare proteiner er stokastisk, og dermed flere molekyler kan væreaktiveres i et givet diffraktion begrænset spot 8. Fluorescens fra de mange molekyler vil fremtræde som en plet, og dermed det samlede antal proteiner vil blive undercounted. For det tredje kan et lignende problem føre til overcounting. I PALM er hver fluorescerende protein lokaliseret og derefter "slettes" ved blegning. Dog kan fluorescerende proteiner vende tilbage fra den mørke tilstand uden at være permanent bleget 18. Sådanne molekyler vil derefter blive talt flere gange. Det fjerde mærkede proteiner er udtrykt som transgener og er ofte til stede i flere kopier, som kan føre til overekspression. Derfor kan kvantificering fra PALM bruges til at vurdere, men ikke nøjagtigt bestemme antallet af molekyler i en given lokalitet.
Tilpasningen af en PALM billede med et elektronmikrografi kan også være en udfordring på grund af opløsning forskel i lys-og elektronmikroskopi og forvrængning forårsaget af elektronstrålen. Guldpartikler anvendes som stramt localized referencemærker markører i elektronmikrofotografier. Men fluoresecence fra guldpartikler er ikke foto-aktiveret, og fremstår som en stor diffraktion-begrænset stedet. Således anbringelse af et fluorescens billede over et elektronmikrografi er et estimat. Forvridninger kan også opstå som følge af samspillet mellem elektroner med plast sektion. Acrylharpikser såsom GMA er mindre stabile under elektronstrålen, og dimensionerne af plastic kan ændres. Under disse omstændigheder kan tilpasse fluorescens med ultrastrukturen kræver ikke-lineær transformation af referencemærkerne markører.
Disclosures
Produktion og fri adgang til denne artikel er sponsoreret af Carl Zeiss, Inc.
Acknowledgments
Vi takker Harald Hess og Eric Betzig for adgang til PALM mikroskop for proof-of-principle eksperimenter, Richard Fetter til deling fikseringspunkter protokoller, reagenser og opmuntring. Vi takker Michael Davidson, Geraldine Seydoux, Stefan Eimer, Rudolf Leube, Keith Nehrke, Christian Frøkjr-Jensen, Aude Ada-Nguema og Marc Hammarlund for DNA-konstruktioner. Vi takker også Carl Zeiss Inc. for at give adgang til Zeiss PAL-M, en betaversion af Zeiss Elyra P.1 PALM mikroskop.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High-pressure freezer | ABRA | HPM 010 | EMPact and HPM 100 from Leica or hpf-01 from Wohlwend can also be used. |
| Automated freeze substitution unit | Leica Microsystems | AFS 2 | AFS 1 can also be used. |
| Zeiss PALM |  Carl Zeiss, Inc. |
ELYRA P.1 | Nikon and Vutara also sell commercial PALM microscopes. |
| Scanning electron microscope | FEI | Nova nano | Other high-resolution SEM microscopes can be used. |
| Acetone | EMS | RT10016 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 459844-1L | |
| Osmium tetroxide | EMS | RT19134 | |
| Potassium permanganate | EMS | RT20200 | |
| Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A3059-50G | |
| Uranyl acetate | Polysciences, Inc. | 21447-25 | pH of uranyl acetate from this company is slightly higher. |
| Glycol methacrylate (GMA) | SPI Supplies | 02630-AA | Low acid, TEM grade. |
| N,N-Dimethyl-p-toluidine | Sigma-Aldrich | D9912 | |
| Cryo vials | Nalge Nunc international | 5000-0020 | |
| Glass vials | EMS | 72632 | |
| Aclar film | EMS | 50425-10 | |
| BEEM capsule | EBSciences | TC | Polypropylene |
| 3/8" DISC punches | Ted Pella, Inc. | 54741 | |
| Gold nanoparticles | microspheres-nanospheres.com | 790122-010 | Request 2x concentrated solution |
References
- Polishchuk, R. S., et al. Correlative light-electron microscopy reveals the tubular-saccular ultrastructure of carriers operating between Golgi apparatus and plasma membrane. J. Cell Biol. 148, 45-58 (2000).
- Oberti, D., Kirschmann, M. A., Hahnloser, R. H. R. Correlative microscopy of densely labeled projection neurons using neural tracers. Front. Neuroanat. 4, 24 (2010).
- Bishop, D., et al. Near-infrared branding efficiently correlates light and electron microscopy. Nat. Meth. 8, 568-570 (2011).
- Sims, P. A., Hardin, J. D. Fluorescence-integrated transmission electron microscopy images: integrating fluorescence microscopy with transmission electron microscopy. Methods Mol. Biol. 369, 291-308 (2007).
- Micheva, K., Smith, S. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55, 25-36 (2007).
- Nixon, S. J., et al. A single method for cryofixation and correlative light, electron microscopy and tomography of zebrafish embryos. Traffic. 10, 131-136 (2009).
- Kukulski, W., et al. Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision. J. Cell Biol. 192, 111-119 (2011).
- Betzig, E., et al. Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat. Methods. 3, 793-795 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).
- Weibull, C., Christiansson, A. Extraction of proteins and membrane lipids during low temperature embedding of biological material for electron microscopy. J. Microsc. 142, 79-86 (1986).
- Watanabe, S., et al. Protein localization in electron micrographs using fluorescence nanoscopy. Nat. Methods. 8, 80-84 (2011).
- F lling, J., et al. Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return. Nat. Methods. 5, 943-945 (2008).
- Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J. Microsc. 198, 82-87 (2000).
- Wombacher, R., et al. Live-cell super-resolution imaging with trimethoprim conjugates. Nature Methods. 7, 717-719 (2010).
- Dertinger, T., Colyer, R., Iyer, G., Weiss, S., Enderlein, J. Fast, background-free, 3D super-resolution optical fluctuation imaging (SOFI). PNAS. 106, 22287-22292 (2009).
- Burnette, D. T., Sengupta, P., Dai, Y., Lippincott-Schwartz, J., Kachar, B. Bleaching/blinking assisted localization microscopy for superresolution imaging using standard fluorescent molecules. PNAS. , (2011).
- Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy. Nat. Meth. 8, 527-528 (2011).
