Summary
Vi beskriver ett förfarande för att lokalisera fluorescerande märkta proteiner i elektronmikrofotografier. Fluorescens först lokaliseras med foto-aktiverad lokalisering mikroskopi på ultratunna sektioner. Dessa bilder är sedan anpassad till elektronmikrofotografier av samma avsnitt.
Abstract
Kartläggning av fördelningen av proteiner är nödvändig för att förstå funktionen av proteiner i en cell. Fluorescensmikroskopi används flitigt för protein lokalisering, men subcellulär sammanhang är ofta frånvarande i fluorescens bilder. Immuno-elektronmikroskopi, å andra sidan, kan lokalisera proteiner, men tekniken är begränsad genom en brist på kompatibla antikroppar, dålig bevarande av morfologi och eftersom de flesta antigener inte utsätts för provytan. Korrelativa metoder kan förvärva fluorescens bilden från en hel cell först, antingen från immuno-fluorescens eller genetiskt märkta proteiner. Provet fixeras därefter och inbäddas för elektronmikroskopi, och bilderna korreleras 1-3. Emellertid lågupplöst bild fluorescens och avsaknaden av referensmärken markörer hindra exakt lokalisering av proteiner.
Alternativt kan fluorescens avbildning göras efter att bevara provet i plast. Idetta tillvägagångssätt, är blocket sektionerades och fluorescens bilder och elektronmikrofotografier av samma avsnitt är korrelerade 4-7. Emellertid skymmer diffraktionsgränsen av ljus i det korrelerade bilden placeringen av individuella molekyler, och fluorescensen ofta sträcker sig bortom gränsen för cellen.
Nano-upplösning fluorescens elektronmikroskopi (nano-FEM) är utformad för att lokalisera proteiner i nanoskala från avbildning samma avsnitt med foto-aktiverad lokalisering mikroskopi (PALM) och elektronmikroskopi. PALM övervinner diffraktionsgränsen av avbildning enskilda fluorescerande proteiner och därefter kartlägga tyngdpunkten av varje fluorescerande fläck 8-10.
Redogör vi för nano-Fem tekniken i fem steg. Först provet fixeras och bäddas med användning av betingelser som bevarar fluorescens märkta proteiner. För det andra harts blocken uppställd i ultratunna segment (70-80 nm) som är monteradepå ett täckglas. Tredje, fluorescens avbildas i dessa avsnitt med hjälp av Zeiss PALM mikroskop. Det fjärde, är elektrontäta strukturer avbildas i dessa samma sektioner med hjälp av ett svepelektronmikroskop. Femte är fluorescens och elektronmikrofotografier linje med guldpartiklar som referenspunkter markörer. Sammanfattningsvis kan den subcellulära lokaliseringen av fluorescent märkta proteiner bestämmas vid nanometer upplösning i ungefär en vecka.
Protocol
1. Högtrycks-Frysning
- Förbered kryo-skyddande genom tillsats av 0,2 g BSA i 1 ml av ett lämpligt medium för prov (t.ex. odlingsmedium för cellodlingar, M9 för C. elegans). Inkubera röret i en 37 ° C vattenbad tills allt BSA upplöst.
- Före frysning, fylla den automatiserade frys-substitution enhet (Leica AFS) med flytande kväve
- Ställ AFS-programmet: -90 ° C för 5-30 timmar *, 5 ° C / h till -60 ° C, -60 ° C under 2 timmar (eller välj "pausa" alternativet om du använder Leica AFS 2), 5 ° C / h till -30 ° C och -30 ° C under 72 timmar. Om AFS maskinen kan ha mer än fem steg bör -30 ° C steg ersättas med en "paus" inställt på 0 timmar och två ytterligare steg bör läggas till: 10 ° C / timme till -20 ° C och 24 h vid -20 ° C. Om maskinen är begränsad till fem steg, konfigurera ett annat program i en annan minnesplats enligt följande: 10 ° C / h till -20 ° C och 24 timmarr vid -20 ° C.
* Tiden här kan justeras så att -60 ° C, steg startar tidigt på morgonen. - Bered 1% osmium lösning tetroxid lager genom att blanda 0,1 g kristaller osmiumtetroxid (EMS, RT19134) med 10 ml vattenfri aceton (EMS, # RT10016). Förbered fixativ i en 50 ml koniskt rör på följande sätt. Först tillsätt 1 ml MilliQ-vatten och sedan lösas upp i det 0,02 g kaliumpermanganat (EMS, RT20200). Lägg 19 ml aceton och blanda väl. Slutligen, tillsätt 20 pl av 1% osmium stamlösning i röret. Aceton är en fri-radikaler 11 och sålunda förhindrar polymerisation av plast, men användningen av aceton som en frys-substitution mediet är nödvändig för att bevara morfologi på grund av dess interaktion med lipider. Aceton kommer att ersättas med etanol före plast infiltration. Alikvotera 1 ml till varje köldkärlet och hålla fixativ fryses genom att lagra rören i flytande kväve.
- Fyll ett exemplar bärare med 20% BSA eller bakterier.Både 20% BSA och bakterier fungerar som Cryo-skyddsmedel. Valet för den typ av provet bärare beror på provet. För C. elegans, använda en 100 | im väl.
- Placera provet i hållaren och frysa den med en högtrycks-frys.
- Efter frysning och under flytande kväve, överföra provet till cryotube innehåller fixativ. Se till provet stannar under vätska vid alla tidpunkter.
- Upprepa 1,5) - 1,7) tills alla proverna fryses.
- Överför alla kryorör i AFS enheten och återuppta programmet.
2. Frys-substitution
- När temperaturen når -60 ° C, placera flaskor innehållande 20 ml 95% aceton i AFS.
- När temperaturen når -50 ° C, ersätta fixativ med 95% aceton sex gånger under perioden 2 timmar.
- Placera en flaska innehållande 20 ml 0,1% uranylacetat (Polysciences, # 21.447-25) i 95% aceton i kammaren ochförkyla den till -50 ° C.
- Vid slutet av tvättningssteget, tillsätt ~ 1 ml uranylacetat lösning till varje flaska. Avbryta pausen programmet om det behövs.
- När temperaturen når -30 ° C, ersätta uranylacetat med 95% etanol sex gånger under en period av 2 timmar.
- Under tiden utgör 97% harts glykolmetakrylat (GMA, SPI Tillbehör / struktur Probe, Inc., # 02.630-AA) genom att blanda 22,3 ml GMA, 10 ml n-butylmetakrylat, 1 ml MilliQ-vatten och 0,2 g bensoylperoxid (katalysator). Förvara den i glasflaskor (EMS, # 72.632) och förbereda 30% GMA genom att blanda det med 95% etanol. Förvara inte GMA-media i plaströr eftersom kvaliteten på polymerisationen försämras med långtidslagring i polyeten-baserade plaster. Förkyla GMA lösningen till -30 ° C.
Traditionella epoxihartser såsom Araldite och Epon kan inte användas i protokollet eftersom de är vattenfria och sura som släcker fluorescerande proteiner. Akrylhartser, såsom LR vit, c.en tolerera en liten mängd vatten och kan bevara det fluorescerande proteinet, men dess surt pH tenderar att släcka fluoroforen 12. GMA tolererar i själva verket kräver en liten mängd vatten och är alkalisk (pH 8) 12. GMA är tyvärr något spröd. Dessutom gör GMA inte tvärbinder med vävnader som traditionella epoxihartser Do. Dessa egenskaper hos GMA orsakar inkonsekvens i sektionering kvalitet, särskilt när sektioneras tunnare än 80 nm.
Även om hållbarhet GMA är ungefär ett år, bör GMA användas inom 3 månader efter köpet för att säkerställa dess kvalitet.
3. Infiltration och Polymerisation
Steg 3,1-3,3 utförs i samma kryokärl används för frys-substitution. Infiltration och polymerisation utförs vid -30 ° C i AFS att bevara det fluorescerande proteinet.
- Förbered infiltration medier genom att blanda GMA förrådslösningen med 95% etanol. Inkubera provernai 30% GMA i 3-5 timmar.
- Inkubera proverna i 70% GMA under 4-6 timmar.
- Inkubera proverna i 97% GMA natten.
- Nästa dag, utgör färsk 97% GMA.
- Överför proverna till ett inbäddande mögel (EBSciences, # TC). Förbered en skiva av ACLAR film (EMS, # 50.425-10) med hjälp av en 3/8 "DISC Punch (Ted Pella Inc.) och placera skivan i botten av BEEM kapseln.
- Byt ut 97% GMA tre gånger under 6 h vid -30 ° C.
- Efter den tredje utbytet, tillsätt initiatorn N, N-dimetyl-p-toluidin (Sigma-Aldrich, # D9912) till GMA i en koncentration av 1,5 | il / 1 ml GMA och tillämpa denna lösning till varje prov mögel. Omedelbart placera provet i inbäddning mögel i AFS.
Observera att bensoylperoxid är katalysatorn och är närvarande under alla infiltration steg så omröring är inte nödvändigt. Bensoylperoxid inte polymerisera inte plasten tills det utsätts för kemisk initiator N, N-dimetyl-p-toluidin. Initiatorn aktiverar polymerization omedelbart och kommer att polymerisera hartset även i vävnader inom 1 timme. Icke desto mindre kan vävnad dropouts resultera i djupa vävnader på grund av den ofullständiga polymerisation. Heller tvärbinder GMA inte provet på blocket väl, så separera provet från frysskyddsmedel genom att trycka på matrisen av bakterier.
Om polymerisationen utförs utanför ett AFS, måste inbäddning gjutformen täckas med en Aclar skiva att blockera exponering för syre. GMA inte polymeriserar inte helt när de exponeras för syre. - Låt plasten att härda över natten, även om det polymeriserar inom 1 timme.
- Förvara prov i en kvävgas-fylld vakuumblåsa (Ziploc) i frysen (-20 ° C) tills vidare bearbetning, så att fluorescerande proteiner inte utsätts för syre.
4. Sektionering
- Sektionering av GMA-inbäddade prover kan utföras på ett sätt liknande det för EPON-inbyggda prover. Extra försiktighet bör tan inte att väta sektionering ytan eftersom GMA är mycket hydrofil och banden kommer att drivas in i vattenbadet om de vätes på båda sidor.
- Samla band av sektioner (50-80 nm) på ett täckglas om en TIRF mikroskop används för lokalisering. Annars använder ett rutnät görs för transmissionselektronmikroskopi. Skärhastigheten bör ställas at1.6 mm / s eller högre. Annars kan ett band bildas inte.
- Förvara sektioner vid -20 ° C om inte avbildas direkt. Skydda fluoroforerna från UV-ljus genom att täcka avsnitt innehavare med aluminiumfolie.
5. PALM Imaging
- Ställ in PALM mikroskop enligt tillverkarens rekommendationer. Temperaturen hos en EMCCD kamera bör sättas till -70 ° C eller lägre.
- Applicera guldpartiklar (# 790.122-010 - 2x koncentrerad, mikrosfärer-nanospheres.com) i lösning (ca 50 ul) till provet som skall avbildas. Låt lösningen stå i 30 sekunder på omslagenläpp medan under ett svart lock fall.
- Avlägsna guld lösningen genom att blåsa den till kanten av täckglas och absorbera det med en Kimwipe.
- Sätt in täckglas i en cirkulär täckglas hållare. Om det behövs, anbringa vakuum fett till fälgen för att hålla täckglas på plats.
- Applicera immersionsolja till undersidan av täckglaset, direkt under proven.
- Sätt in provhållaren i skåran på scenen av mikroskopet. Var särskilt försiktig med att inte röra målen.
- Justera hållaren så det är tätt och centrerar avsnitten ovanför målet.
- Leta avsnitten med en 10x objektiv.
- Byt till 100x objektiv.
- Fokusera på provet.
- Hitta en region av intresse genom att observera styrkan av fluorescens signaler. Använd 488 nm laser och öka intensiteten i menyn Kanaler till 10%. Fokusera på de områden ljusaste fluorescens. Observera att detta steg är inte nödvändigt om regionen of intresse kan identifieras i den ljusa området genom ögat.
- Växla lasern till 561 nm och öka intensiteten till 100% att bleka ut bakgrunden autofluorescens. Bleach provet för ~ 2 minuter.
- Om fokus ändras under blekning, låt 5 minuter förflyta innan du justerar fokus och ta bilder. Denna paus medger temperaturen stabiliseras. Om PALM omfattning är utrustad med en inkubationskammaren, ställa in temperaturen till 20 ° C och vänta på ~ 2 timmar för att stabilisera temperaturen i kammaren.
- När blekning är klar, aktivera 405 nm laser och ställ in den på den lägsta intensiteten.
- Börja samla in bilder med 20 bilder per sekund. Vi samlar vanligtvis 5000-6000 bilder per försök, men antalet ramar bör justeras beroende på målet med försöket. Till exempel, om alla proteiner i en region av intresse måste avbildas, bör det ramnummer ökas.
- Om signalerna är gles eller svag, långsamt increaSE den 405 nm laser intensitet.
- Under förvärvsprocessen, se till att hålla proven i fokus genom att försiktigt justera ratten efter behov.
- När bilder samlas bör PALM analys utföras. För tdEos, filtrera vi ut alla signaler som fluorescerar längre än 500 msek eftersom dessa signaler är sannolikt på grund av autofluorescens.
6. SEM Imaging
- Före SEM avbildning, färga sektioner med hjälp 2,5% uranylacetat (i vatten) under 4 min. Tvätta bort uranylacetat noggrant med filtrerat MilliQ-vatten.
- Efter sektionerna torkas, kol-belägga täckglas med en kol spotta tills täckglas blir ganska mörk. Applicera en ände av kol ledande tejp vid kanten av täckglaset och den andra änden på metallen påbörjad så att elektroner som ansamlas på ytan av täckglaset är jordade.
- Montera prov i SEM kammaren (FEI Nova Nano).
- Sätt i VCD detektorn. Stäng kammaren och pumpa det med högvakuum inställningen.
- När evakueras, öppna kolonnen ventilen så att elektronstrålen appliceras på ett prov.
- Utför en rutinmässig inriktning av elektronstråle.
- Leta reda på provet.
- När fokus är justerat, länka provet scenen och ta upp på scenen för att 5 mm under polstycket.
- Ta en låg förstoring bild av provet (~ 5.000 x).
- Zooma in det område av intresse och med hög förstoring (50.000 x) bilder.
- Flytta till nästa avsnitt, och upprepa steg 6,10) och 6,11) tills alla sektionerna avbildas.
7. Justera Palm och EM Bilder
- Öppna Photoshop och de förvärvade SEM-bilder.
- Skapa ett nytt fönster med måtten 5.000 x 5.000 pixlar och 300 pixlar / tum upplösning.
- Kopiera låg förstoring SEM-bild i det nya fönstret (Figur 1A).
- Skala bilden så att den fyller upphela fönstret med hjälp av transform manipulation (Kommando + T för en Mac).
- Kopiera högre förstoring SEM bilder och skala dem efter behov.
- Vända bilden summa TIRF horisontellt genom att välja bildrotering från bilden rullgardinsmenyn bar.
- Kopiera och klistra in summan TIRF bild (från Palm) till ett nytt lager.
- Skala bilden med transform manipulation och vrid sedan efter behov för att matcha fluorescensen hos guldpartiklarna (vita pilar i figur 1 A) med motsvarande strukturer ses med SEM (Figur 1B).
- Kopiera PALM bilden i ett nytt lager och tillämpa samma omvandling (Figur 1C). En högre förstoring bild kan extraheras från detta bilden (figur 2).
- För presentation, kopiera den transformerade PALM bilden i ett nytt lager. Välj PALM signalerna men inte bakgrunden genom att använda "färgskala" i "välj" rullgardinsmenyn. Se till att SELect en bakgrund pixel som referens pixel och slå på "invertera" alternativet.
- Skär de önskade PALM signaler och klistra in dem i ett nytt lager.
- Applicera insyn bakgrundslagret och ställ in den på 10%. Detta möjliggör visualisering av PALM signalerna genom att göra bakgrunden genomskinlig utan att kompromissa deras intensitet (figur 2D).
8. Representativa resultat
Histon taggade med tdEos kan stabilt uttryck i nematoden C. elegans, och transgena djur behandlades med användning av protokollet beskrivet ovan. Handflatan och elektronmikrofotografier förvärvades från samma avsnitt (figur 1). Att anpassa bilderna är summan TIRF bilden, vilket summerar fluorescensen över hela tidsförloppet, överlagras på elektronmikrofotografi. Guld nanopartiklar visas i både fluorescens-och elektronmikrofotografier och kan användas för att rikta in två bilder med hjälp av "transferOrm "-funktionen i Photoshop (Figur 1A och B). Därefter genomfördes samma "transformationen" värde tillämpas på PALM bild (figur 1C). Vid denna förstoring kan strukturella detaljer inte skiljas, så vi zoomat in i ett område nära den övre änden av mikrofotografiet (figur 2). I hög förstoring bild kan subcellulära detaljer såsom en kärna, en kärnsystemet, nukleära porer och endoplasmatiskt retikulum följas. Dessutom är de taggade molekylerna Histon uteslutande lokaliserad till kärnan men inte till kärnsystemet, som förväntat. Den korrelativa PALM och elektronmikroskopi medger således för protein lokalisering på högsta upplösning.
Fem problem kan äventyra kvaliteten på bilderna. Först, kan iskristall skador snedvrida ultrastruktur (Figur 3A och B). Placering exemplar i en kryo-skyddsmedel såsom bakterier, vilket minskar spridning av iskristaller, kan minska skadorna. Ändå,en måste fortfarande screena prover med elektronmikroskopi och kasta dem med frysning artefakter. Det andra, inte tvärbinda GMA inte till vävnader som epoxihartser, och därmed prover ofta bryta sig loss från den omgivande plasten och stretch, krympa eller falla ut ur sektionen (Figur 3C och D). Dissektion av provet bort från bakterier eller andra kryo-skyddsmedel innan inbäddning ger större vidhäftning av plasten till provet (Figur 3C). Likaså, strukturer såsom lipiddroppar i tarmen dissocierar ofta från vävnader på grund av frånvaron av tvärbindning (figur 3E). Det tredje, den ofullständiga polymerisation av plast orsakar sträckning eller vikning av vävnader (figur 3F), närvaro av syre i provet hindrar också polymerisationen av GMA. Det fjärde resulterar den dåliga sektionering kvalitet GMA ofta i ett inkonsekvent morfologi (Figur 3G och H). GMA sektioner ska klippas vid70 nm eller tjockare och med en hastighet av cirka 1,6 mm / s för att minimera sektionering artefakter. Femte, bakgrund autofluorescens från damm på täckglas eller sektionen är oundvikligt. Autofluorescens från damm kan minimeras genom att använda förrengöras täckglas och genom att undvika damm från Kimwipes och filterpapper som beskrivs i protokollet. PALM analysprogrammet kan redigera ut signaler från provet eller plast som fluorescerar längre än vanliga signaler från fluorescerande proteiner (Figur 2 A och B). Den slutliga bilden kommer därför att vara fritt från sådana artefakter.
Figur 1. Justera fluorescens och elektronmikrofotografier med guld nanopartiklar. (A) En låg förstoring elektronmikrofotografi från ett tvärsnitt av C. elegans uttrycker de märkta histon tdEos :: HIS-11. Vit Arrows visar 100 nm elektron-täta guld nanopartiklar appliceras före PALM avbildning som fungerar som referenspunkter. (B) guld pärlor fluorescerar vid exponering för ~ 580 nm ljus och skapa referenspunkter i fluorescens bilden. Summan TIRF bilden är inriktad på ett elektronmikrofotografi baserad på placeringen av referensmärken. Summan TIRF bilden representerar alla fotoner detekteras av kameran under den experimentella tidsförloppet. Observera att ljusa fläckar på övre vänstra (vit pil) härrör från kluster av guldpartiklar. (C) en palm bild sedan till elektronmikrofotografi och roteras och översatt utifrån de värden som bestämts från inriktningen av summan TIRF bilden (B). Klicka här för att se större bild .
Figur 2. Korrelat nano-Fem hjälp Histon fusionsproteiner. (A) Summa TIRF bild av tdEos :: HIS-11 förvärvas från en tunn del (70 nm). (B) Motsvarande PALM bild av tdEos :: HIS-11. Autofluorescens (vit pil) som varar längre än 500 ms filtrerades av PALM programmet. (C) elektronmikrofotografi av en kärna som förvärvats från samma avsnitt. (D) Korrelat PALM bild och elektronmikrofotografi av tdEos :: HIS-11. Fluorescens är tätt lokaliserad till kromatin i kärnan.
Figur 3. Problem förknippade med nano FEM. (A) elektronmikrofotografi av ett C. elegans kroppen muskler utan iskristall skadas. (B) elektronmikrofotografi av en kropp muskel med iskristall skador. Istället för diskreta tvärsektioner är aktin och myosin filament kollapsade i aggregat på grund av bildningen av iskristaller. (C, D) Låg förstoring elektronmikrofotografis, som visar dissociationen av maskar från det omgivande mediet. Avsnittet är mer förvrängd i ett prov som är omgiven av kryo-skyddande bakterier (D) än när provet omges av plast (C). Den bakteriella kryo-skyddande i gallette bör dissekerades bort från det fasta provet före plast inbäddning. Observera att djuret till höger i (D) var sektionerades snett, och därmed formen är inte beror på snedvridning av vävnader. (E) elektronmikrofotografi av tarmen, som visar avhopp av vävnader (svarta pilar). (F) elektronmikrofotografi av nerv ring visar vikning av sektioner på grund av den ofullständiga polymerisation av plast (svarta pilar). (G, H) Elektronmikrofotografier av neuroner från samma prov, sektionerade vid olika tidpunkter. Bevarandet av vävnader är utmärkt på en dag (G), men en sådan morfologi skyms av den inkonsekventa sektionering kvalitet (H). Klicka här för att vIEW större figur.
Discussion
Här beskriver vi hur man bevarar fluorescerande proteiner i plast, lokalisera de fluorescerande proteinerna i sektioner och avbilda ultrastruktur med elektronmikroskopi. Proteiner lokaliserade under diffraktionsgränsen med PALM mikroskopi till nanometer upplösning. Att anpassa detta protokoll till speciella prover bör följande parametrar beaktas: fluorofor, kvantifiering och justering.
Valet av fluorescerande proteinet eller organiska fluoroforen beror på tillämpningen och modellsystem. Vi har testat en rad olika fluorescerande proteiner, inklusive EGFP, YFP, Citrin, mEosFP, mEos2, tdEos, mOrange, PA-mCherry och Dendra 12. Bevarandet av fluorescens från varje fluorofor var liknande, vilket antyder att alla fluorescerande proteiner kan konserveras med hjälp av den beskrivna metoden. Vi valde tdEos eftersom det uttrycks väl i C. elegans förblev proteiner fungerar vid smält till tdEos, och eftersom dessfoto-aktivering egenskaper var optimala för PALM mikroskopi. Har dock aggregering eller inte uttryck av tdEos har ibland observerats 12.
Beroende på tillämpning kan en annan fluorofor vara bättre lämpad. I många fall är det inte nödvändigt att använda en foto-aktiverat fluorescerande protein. Enkel korrelat fluorescens elektronmikroskopi kräver inte foto-aktiverade fluorescerande protein. GFP eller organiska färgämnen kan användas för att avbilda fluorescens från märkta proteiner i avsnitten ovan diffraktionsgränsen. Till exempel, kan en bild ett axon i en neuropil med fluorescensmikroskopi och korrelera fluorescenssignalen med en särskild axonet i ett elektronmikrofotografi genom avbildning av fluorescensen på ett fluorescensmikroskop. Andra super-upplösning tekniker, såsom stimulerad emission utarmning mikroskopi (Sted) 12, grundtillståndet utarmning mikroskopi följt av individuell molekyl retur (GSDIM) 13, ochstrukturerad belysning mikroskopi (SIM) 14, behöver inte foto-aktiverade fluorescerande proteiner. Dessutom super-upplösning avbildningstekniker som använder organiska färgämnen 9,15,16 eller den inneboende egenskapen hos fluorescerande prober 17 är lätt tillämpas.
I PALM, kan antalet molekyler kvantifieras eftersom fluorescens av varje molekyl separeras spatialt och temporalt. Dock kan kvantifiering vara vilseledande för fyra skäl: oxidation, undercounting, overcounting och överuttryck. Först, kan en fraktion av de fluorescerande proteinerna denatureras eller oxideras under provbearbetning 5,12. Även ~ 90% av fluorescens-signalen bevaras genom fixering och inbäddning i vår protokoll, kan oxidation av det fluorescerande proteinet sker efter provet har sektionerad och den yta som exponeras för syre. Andra är aktiveringen av foto-aktiverbara proteiner stokastisk och därmed flera molekyler kanaktiveras i en viss diffraktionsbegränsad fläck 8. Fluorescens från de multipla molekylerna visas som en fläck, och därmed det totala antalet proteiner kommer att undercounted. Tredje kan ett liknande problem leda till overcounting. I PALM är varje fluorescerande proteinet lokaliserades och sedan "raderas" genom blekning. Däremot kan fluorescerande proteiner tillbaka från den mörka tillståndet utan att vara permanent blekt 18. Sådana molekyler kommer därefter räknas flera gånger. Fjärde, märkta proteiner uttrycks som transgener och är ofta närvarande i flera kopior, vilket kan leda till överuttryck. Därför kan kvantifiering från PALM användas för att uppskatta, men inte exakt bestämma antalet molekyler i en given plats.
Anpassningen av en palm bild med ett elektronmikrofotografi kan också vara utmanande på grund av upplösningen skillnaden i ljus-och elektronmikroskopi och distorsion som orsakas av elektronstrålen. Guldpartiklar tjänar som tätt locOrealiserade referensmärken markörer i elektronmikrofotografier. Dock är fluoresecence från guldpartiklar inte foto-aktiverad och visas som en stor diffraktionsbegränsad fläck. Således är placeringen av en fluorescens bild över en elektronmikrofotografi en uppskattning. Snedvridningar kan också uppstå interaktioner mellan elektroner med plast sektionen. Akrylhartser såsom GMA är mindre stabila under elektronstrålen, och dimensionerna hos plasten kan ändras. Under dessa omständigheter kan anpassa fluorescens med ultrastrukturen kräva icke-linjär transformation av de referenspunkter markörerna.
Disclosures
Produktion och fri tillgång till denna artikel är sponsrad av Carl Zeiss, Inc.
Acknowledgments
Vi tackar Harald Hess och Eric Betzig för tillträde till PALM mikroskop för proof-of-principle experiment Richard Fetter för att dela fixering protokoll, reagens och uppmuntran. Vi tackar Michael Davidson, Geraldine Seydoux, Stefan Eimer, Rudolf Leube, Keith Nehrke, Christian Frøkjr-Jensen, Aude Ada-Nguema och Marc Hammarlund för DNA-konstruktioner. Vi tackar också Carl Zeiss Inc. för att ge tillgång till Zeiss PAL-M, en beta version av Zeiss Elyra P.1 PALM mikroskop.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High-pressure freezer | ABRA | HPM 010 | EMPact and HPM 100 from Leica or hpf-01 from Wohlwend can also be used. |
| Automated freeze substitution unit | Leica Microsystems | AFS 2 | AFS 1 can also be used. |
| Zeiss PALM |  Carl Zeiss, Inc. |
ELYRA P.1 | Nikon and Vutara also sell commercial PALM microscopes. |
| Scanning electron microscope | FEI | Nova nano | Other high-resolution SEM microscopes can be used. |
| Acetone | EMS | RT10016 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 459844-1L | |
| Osmium tetroxide | EMS | RT19134 | |
| Potassium permanganate | EMS | RT20200 | |
| Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A3059-50G | |
| Uranyl acetate | Polysciences, Inc. | 21447-25 | pH of uranyl acetate from this company is slightly higher. |
| Glycol methacrylate (GMA) | SPI Supplies | 02630-AA | Low acid, TEM grade. |
| N,N-Dimethyl-p-toluidine | Sigma-Aldrich | D9912 | |
| Cryo vials | Nalge Nunc international | 5000-0020 | |
| Glass vials | EMS | 72632 | |
| Aclar film | EMS | 50425-10 | |
| BEEM capsule | EBSciences | TC | Polypropylene |
| 3/8" DISC punches | Ted Pella, Inc. | 54741 | |
| Gold nanoparticles | microspheres-nanospheres.com | 790122-010 | Request 2x concentrated solution |
References
- Polishchuk, R. S., et al. Correlative light-electron microscopy reveals the tubular-saccular ultrastructure of carriers operating between Golgi apparatus and plasma membrane. J. Cell Biol. 148, 45-58 (2000).
- Oberti, D., Kirschmann, M. A., Hahnloser, R. H. R. Correlative microscopy of densely labeled projection neurons using neural tracers. Front. Neuroanat. 4, 24 (2010).
- Bishop, D., et al. Near-infrared branding efficiently correlates light and electron microscopy. Nat. Meth. 8, 568-570 (2011).
- Sims, P. A., Hardin, J. D. Fluorescence-integrated transmission electron microscopy images: integrating fluorescence microscopy with transmission electron microscopy. Methods Mol. Biol. 369, 291-308 (2007).
- Micheva, K., Smith, S. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55, 25-36 (2007).
- Nixon, S. J., et al. A single method for cryofixation and correlative light, electron microscopy and tomography of zebrafish embryos. Traffic. 10, 131-136 (2009).
- Kukulski, W., et al. Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision. J. Cell Biol. 192, 111-119 (2011).
- Betzig, E., et al. Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat. Methods. 3, 793-795 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).
- Weibull, C., Christiansson, A. Extraction of proteins and membrane lipids during low temperature embedding of biological material for electron microscopy. J. Microsc. 142, 79-86 (1986).
- Watanabe, S., et al. Protein localization in electron micrographs using fluorescence nanoscopy. Nat. Methods. 8, 80-84 (2011).
- F lling, J., et al. Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return. Nat. Methods. 5, 943-945 (2008).
- Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J. Microsc. 198, 82-87 (2000).
- Wombacher, R., et al. Live-cell super-resolution imaging with trimethoprim conjugates. Nature Methods. 7, 717-719 (2010).
- Dertinger, T., Colyer, R., Iyer, G., Weiss, S., Enderlein, J. Fast, background-free, 3D super-resolution optical fluctuation imaging (SOFI). PNAS. 106, 22287-22292 (2009).
- Burnette, D. T., Sengupta, P., Dai, Y., Lippincott-Schwartz, J., Kachar, B. Bleaching/blinking assisted localization microscopy for superresolution imaging using standard fluorescent molecules. PNAS. , (2011).
- Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy. Nat. Meth. 8, 527-528 (2011).
