يوصف هنا نهج الروبوتية إلى الإنتاجية العالية بلورة البروتينات الغشاء في mesophases شحمي لاستخدامها في تصميم هيكل الجزيئات باستخدام الأشعة السينية البلورات. وقدم ثلاثة روبوتات قادرة على التعامل مع لزجة لزجة والبروتين لادن mesophase جزءا لا يتجزأ من أسلوب.
هيكل الوظائف الدراسات البروتينات الغشاء تستفيد كثيرا من وجود المتاحة عالية الدقة هياكل 3-D من النوع المقدمة من خلال البلورات بالأشعة السينية الجزيئات (MX). عنصر أساسي من MX هو إمداد ثابت من بلورات حيود الجودة مثالي. وأو شحمي في المتوسط مكعب المرحلة (LCP) طريقة لبلورة البروتينات الغشاء هي واحدة من العديد من الطرق المتاحة لبلورة البروتينات الغشاء. فإنه يجعل من استخدام mesophase bicontinuous التي تنمو البلورات. كوسيلة من وسائل، وكان له بعض النجاحات الرائعة في الآونة الأخيرة واستقطبت الكثير من الاهتمام مع العديد من المجموعات البحثية المهتمة الآن في استخدامه. واحدة من التحديات المرتبطة الأسلوب هو أن mesophase استضافة لزج للغاية ومثبت، تذكرنا معجون أسنان سميكة. وهكذا، فإنه يدويا الاستغناء بطريقة استنساخه في كميات صغيرة في بلورة الآبار يتطلب مهارة وصبر ومطرد من ناحية. بروتوكول للقيام جوش التي وضعت في الغشاء الهيكلي والوظيفي الأحياء (MS & FB) المجموعة 1-3. مقالات الفيديو إن الرب واصفا الطريقة هي 1،4 المتاحة.
النهج دليل لإقامة المحاكمات في المتوسط لديها مزايا واضحة مع التطبيقات المتخصصة، مثل وضوح الشمس والتحسين الاشتقاق. ومع ذلك فإنه لا يعاني من كونها وسيلة إنتاجية منخفضة. هنا، ونحن يبرهن على وجود بروتوكول للأداء في بلورة التجارب المتوسط آليا. والروبوت يوفر مزايا السرعة والدقة، والدقة، والتصغير والقدرة على العمل بشكل مستمر لفترات طويلة تحت ما يمكن اعتباره ظروف عدائية كما هو الحال في الظلام، في جو خفض أو في درجات حرارة منخفضة أو عالية. يمكن للروبوت في المتوسط، عندما تستخدم بشكل صحيح، تحسن كثيرا من إنتاجية بنية البروتين الغشاء وظيفة البحث من خلال تسهيل بلورة التي تعد واحدة من الخطوات البطيئة فيوعموما خط أنابيب هيكل المصير.
في هذه المقالة الفيديو، ونحن لشرح استخدام ثلاثة الروبوتات المتاحة تجاريا التي يمكن الاستغناء عن mesophase لزج ودبق جزءا لا يتجزأ من المتوسط في crystallogenesis. تم تطوير أول روبوت في MS & FB مجموعة 5،6. أصبحت في الآونة الأخيرة اثنين آخرين المتاحة ويتم تضمين هنا للتأكد من اكتمالها.
ويقدم لمحة عامة عن بروتوكول المشمولة بهذه المادة في الشكل 1. تم تنفيذ كافة التلاعب في درجة حرارة الغرفة (~ 20 ° C) في ظل الظروف المحيطة.
في هذه المقالة الفيديو وأثبتنا كيفية استخدام الروبوت لتعيين تلقائيا في التجارب تبلور في المتوسط 96-وحات جيدة ساندويتش الزجاج باستخدام mesophase البروتين شحمي لادن. وقد صممت خصيصا للروبوتات المستخدمة في هذا العمل ليشمل الزجاج الإزاحة الموجبة للتسليم حقنة دقيقة وقابلة للتكرار وحدات التخزين نانولتر من mesophase لزج ودبق، كما هو موضح في الأصل 7.
الدقة والدقة هي السمات الهامة لالروبوت. ومع ذلك، وهذه الخصائص هي فقط جيدة بقدر درجة وانتظام التي يتم تقييم أداء الروبوت ويتم تنفيذ المعايرة. فمن نافلة القول أنه ينبغي تقييم أداء الروبوت في حين أنه يتم حاليا وضع لوحات فردية. من غير المناسب أن نفترض أن الروبوت سوف تعمل لا تشوبه شائبة وترك الروبوت لتشغيل غير المراقب. يقوم مشغل اليقظة وملاحظ تكون في نقاط البيعition أن نلاحظ من خلال الصوت أو ظهور عندما يكون هناك شيء لا يعمل بشكل صحيح وتصحيح على الفور. بالإضافة إلى ذلك، ينبغي تفقد كل لوحة بعناية من قبل العين توحيد محتويات جيدا بمجرد اغلاق لوحة وقبل وضعه بعيدا عن المحاكمات التبلور. وينبغي أن يتطلب سوى بضع ثوان لأداء ويمكن القيام به في حين يتم تحميل لوحة القادم. يلاحظ، على سبيل المثال، قد لا يتم بشكل صحيح ملء الآبار خاصة تسليط الضوء على حقيقة أن بعض تلميح الاستغناء الكثيرمن تعمل بصورة صحيحة. يجب تسليم mesophase أن ينظر إليها على أنها غير منتظمة، فإن البند ذي الصلة خلل تحتاج إلى تصحيح على الفور. بالإشارة إلى هذه القضايا وإجراء التعديلات ذات الصلة خلال مجموعة سيوفر وقتا والمواد، بما في ذلك البروتين والدهون قيمة الغشاء. إذا تم استخدام تصوير لتتبع نمو البلورات، ويمكن أيضا أن دقة ودقة رصد خلال التصوير. على سبيل المثال، مشاكل منهجية مع انخفاض أو البلعةالموقع من قبل تصوير تشير إلى أن شيئا ما ليس صحيحا وأنه يلزم اتخاذ إجراءات تصحيحية المنبع في مكان ما في البروتوكول.
في مصلحة الأداء الموثوق ذلك يجب معايرة الروبوت على جدول منتظم وحسب الحاجة. يجب أن تشمل المعايرة حجم مرسب وmesophase تسليمها وكذلك التنسيب بلعة ومرسب في البئر. من الواضح، ينبغي أن يتم معايرة حيثما كان ذلك ممكنا باستخدام وحدات التخزين والمواد مماثلة لتلك التي سيتم استخدامها في التجارب التي أجريت في الفترة التي يغطيها نوعية ممارسة السيطرة.
بنفس أهمية المعايرة وذلك أيضا هو وجود في سوق الأسهم إمدادات كافية من قطع الروبوت واللوازم. يمكن فشل كارثي وغير متوقعة، وانسداد حوادث والقيام تحدث. في مثل هذا الحدث، وكان يتوفر على معلومات سرية استبدال تسليم الكثيرمن، على سبيل المثال، قد يعني أن يتم استخدام البروتين الغشاء قيمة للغاية كما يجب إعداد ولا يضيع.
بعض من مزايا الروبوت تشمل حقيقة أنه سوف يعمل بشكل مستمر في الأساس، وأنه لا يعاني من أو "يشكون من" التعب. ويمكن أيضا أن تستخدم الروبوت في ظل ظروف التي لا تعتبر الإنسان والعائلات، كما هو الحال في الظلام، تحت اضاءة مسيطر عليها والظروف البيئية، وعلى اقصى درجة الحرارة. واستخدمت جميع الروبوتات موضح في هذه المقالة في ظل الظروف المحيطة في C. ~ ° 20 ومع ذلك، هناك بروتينات والمشاريع التي تتطلب درجات حرارة غير المحيطة، وعلى ضوء سيطرة 11،12 والمؤكسدة وتقليل أو بيئة 13. يمكن كل هذه لبيت، بسهولة نسبية، عند استخدام الروبوت التبلور.
في مقال سابق إن الرب فيديو أثبتنا كيف يتم تعيين التجارب التي تبلور في طريقة المتوسط يصل يدويا 1. ويقتصر حجم الحد الأدنى من mesophase التي يمكن الاستغناء موثوق باليد بذ البصرية وحدة ثابتة الإنصاف للشخص إقامة المحاكمات. في تجربتنا، يتم التعامل مع بسهولة حجم mesophase منخفضة تصل إلى 100 NL. ونحن نعرف من أحد المختبرات حيث حجم الافتراضي يدويا الاستغناء حوالي 40 NL. ومع ذلك، حجم أصغر بكثير ممكنة باستخدام الروبوت. بشكل منفصل، وقد أظهرنا أنه يمكن الاستغناء عن كميات منخفضة mesophase إلى 550 picoliters آليا 14. من أن العمل كان من الواضح أن المزيد من التصغير الروبوت المحتملة التي، إذا ما نفذت، من شأنه أن يؤدي إلى انخفاض كبير في كمية البروتين الغشاء قيمة اللازمة لإجراء المحاكمة التبلور.
في هذه المقالة الفيديو، تم استخدام ثلاثة الروبوتات المتاحة تجاريا لإثبات عالية الإنتاجية بلورة البروتين غشاء شحمي باستخدام mesophases. تم تطوير أول هذه المجموعة في الفيس بوك وMS بناء على خبرتنا إقامة محاكمات يدويا، كما هو موضح في 1712 إن الرب 1. هذا هو الصكوكمنة لدينا أكثر ألفة مع ويخصص الجزء الأكبر من المادة الحالية لاستخدامها. كانت الآخران الروبوتات على مظاهرة في مجموعة الفيس بوك وMS في وقت كتابة المقال ويتم تضمين لقطات ذات الصلة هنا في مصلحة اكتمالها. جميع الروبوتات تستخدم ثلاثة منها كثيرا نفس الاستغناء عن نظام mesophase، وسمة أساسية من سمات وهو الزجاج الإزاحة الإيجابية حقنة 5،7. أنها تختلف الأهم فيما يتعلق تسليم الكثيرمن. يمكن الروبوتات 1 و 2 في وقت واحد الاستغناء الكثيرمن إلى 8 آبار، عمود واحد على لوحة تبلور في وقت واحد. في المقابل، روبوت 3 يوزع كل الحلول مرسب 96 وذلك في خطوة واحدة. الروبوت 2 هو الأداة الوحيدة مع نصائح الكثيرمن المتاح الاستغناء. هناك إيجابيات وسلبيات المرتبطة مختلف الصكوك التي تعتمد على تطبيق معين، لن يتم وضع هذه هنا. ويكفي ان نقول ان كل عمل لمدة ثلاث وأنتجت بلورات ليالبروتينات mbrane من قبل في طريقة المتوسط.
الخطوات التالية في العملية الشاملة لتصميم الهيكل من قبل البلورات الجزيئات هي الحصاد والبرد بارد بلورات من إعداد لوحات كما هو موضح في هذه المقالة الفيديو وتسجيل وعملية حيود الأشعة السينية منها. وتغطي هذه المواضيع في مقالات منفصلة إن الرب في هذه السلسلة 1،15.
The authors have nothing to disclose.
هناك العديد من الذين ساهموا في هذا العمل ومعظمها من الغشاء الهيكلية والوظيفية المجموعة الأحياء، وكلاهما عضو في الماضي والحاضر. لجميع نتقدم بأحر الشكر والتقدير. وأيد هذا العمل في جزء من المنح المقدمة من مؤسسة العلوم ايرلندا (07/IN.1/B1836)، والمعاهد الوطنية للصحة (GM75915، وP50GM073210 U54GM094599)، وFP7 CM0902 العمل COST.
Name of reagent | Company | Catalogue number | Components |
Brayer (roller) | Fisher Scientific | 50820937 | Tool |
Gas-tight syringes | Hamilton | 81030 | Tool |
Glass coverslips | Marienfeld | 01029990911 | Disposable |
Glass plates | Marienfeld | 1527127092 | Disposable |
Gryphon LCP Robot | Art Robbins | NA | Tool |
In meso robot | Anachem/Gilson | NA | Tool |
Lab notebook | Various | NA | Tool |
Mosquito LCP Robot | TTP Labtech | NA | Tool |
Perforated double-stick spacer tape | Saunders Corporation (hole-punched) | customized | Disposable |
Precipitant solutions | Various | Various | Reagent |
Purified water | Millipore | NA | Reagent |
Rain-X | Shell Car Care | 80199200 | Reagent |
Syringe tips | Hamilton | 7770-020 (gauge 22) | Tool |
Tissues | Various | Various | Disposable |
Water bottle | various | NA | Reagent |