Hierin beschreven een robot benadering high-throughput kristallisatie van membraaneiwitten in lipidische mesofasen voor gebruik in structuurbepaling met macromoleculaire X-ray kristallografie. Drie robots staat de behandeling van de viskeuze en kleverige eiwit beladen mesofase een integraal onderdeel van de methode worden geïntroduceerd.
Structuur-functie studies van membraaneiwitten veel baat hebben beschikbare hoge-resolutie 3-D structuur van het type die via macromoleculaire X-ray kristallografie (MX). Een essentieel onderdeel van MX is een constante aanvoer van ideaal diffractie-kwaliteit kristallen. De in lipide meso of kubische fase (LCP) werkwijze voor het kristalliseren membraaneiwitten een van verschillende methoden beschikbaar voor het kristalliseren membraaneiwitten. Het maakt gebruik van een bicontinue mesofase in om kristallen. Als een methode, heeft het had een aantal spectaculaire successen van te laat en heeft veel aandacht getrokken met vele onderzoeksgroepen nu geïnteresseerd in het gebruik ervan. Een van de uitdagingen in verband met de methode is dat de hosting mesofase is zeer viskeus en kleverig, doet denken aan een dikke tandpasta. Zo doseren deze handmatig op een reproduceerbare wijze in kleine hoeveelheden in de kristallisatie putten vereist vaardigheid, geduld en een vaste hand. Een protocol voor het doen van just die werd ontwikkeld in het membraan Structural & Functionele Biologie (MS & FB) Groep 1-3. Jove video artikels beschrijven de methode beschikbaar 1,4.
De handmatige aanpak voor het opstarten van meso studies heeft duidelijke voordelen met gespecialiseerde toepassingen, zoals kristal optimalisatie en derivatisering. Het heeft echter last van het zijn een lage throughput methode. Hier tonen we een protocol voor het uitvoeren van in meso kristallisatie onderzoeken robot. Een robot biedt de voordelen van snelheid, nauwkeurigheid, precisie, miniaturisatie en kunnen continu werken langdurig onder welke kunnen worden beschouwd als vijandige omstandigheden, zoals in het donker in een reducerende atmosfeer of bij lage of hoge temperaturen. Een in meso robot, wanneer goed gebruikt, kan de productiviteit van membraaneiwit structuur en functie onderzoek aanzienlijk verbeteren door kristallisatie een van de stappen in de langzamealgemene structuur bepaling pijplijn.
In deze video artikel tonen we het gebruik van drie beschikbare robots dat het viskeuze en kleverige mesofase integraal in meso crystallogenesis kan afzien. De eerste robot werd ontwikkeld in de MS & FB Group 5,6. De andere twee zijn sinds kort beschikbaar en worden hier voor de volledigheid opgenomen.
Een overzicht van de protocol die in dit artikel is weergegeven in figuur 1. Alle manipulaties werden uitgevoerd bij kamertemperatuur (~ 20 ° C) onder omgevingsomstandigheden.
In dit artikel video we hebben aangetoond hoe een robot automatisch opgericht in meso kristallisatie trials in 96-well platen sandwich glas met een proteïne beladen lipide mesofase. De robots die in dit werk zijn speciaal ontworpen om een positieve verplaatsing glazen spuit voor nauwkeurige en reproduceerbare levering van nanoliter volumes van de viskeuze en kleverige mesofase omvatten, zoals oorspronkelijk beschreven 7.
Nauwkeurigheid en precisie zijn belangrijke kenmerken van een robot. Echter, deze kenmerken zijn zo goed als de mate en regelmatigheid die robot prestatie wordt geëvalueerd en kalibratie wordt uitgevoerd. Het spreekt vanzelf dat de uitvoering van de robot moet worden geëvalueerd terwijl de individuele platen opgezet. Het is niet gepast om aan te nemen dat de robot foutloos zal functioneren en om de robot te verlaten nooit onbewaakt achter. De attente en oplettende bestuurder moet in een posbankwezen in om op te merken door een geluid of een verschijning als er iets niet goed werkt en onmiddellijk corrigeren. Voorts wordt elke plaat zorgvuldig gecontroleerd op het oog van een uniforme inhoud en zodra de plaat is afgesloten en alvorens deze opgeborgen voor kristallisatie trials. Dit vereist alleen een paar seconden te voeren en kan worden uitgevoerd terwijl de volgende plaat wordt geladen. Te merken, bijvoorbeeld, is het betreffende putten zijn niet goed gevuld wijzen op het feit dat een bepaalde neerslagmiddel doseertip werkt niet goed. Indien levering van mesofase worden gezien als onregelmatig, zou de relevante defect onderdeel moet onmiddellijk worden gecorrigeerd. Door op te merken deze kwesties en het maken van de aanpassingen tijdens de set-up bespaart tijd en materialen, met inbegrip van waardevolle lipiden en membraan eiwit. Als een imager wordt gebruikt om kristalgroei te volgen, kan de nauwkeurigheid en precisie ook worden gecontroleerd tijdens beeldvorming. Bijvoorbeeld, systematische problemen met drop of boluslocatie door de imager aan te geven dat er iets niet klopt en dat corrigerende maatregelen ergens stroomopwaarts in het protocol nodig is.
In het belang van betrouwbare prestaties dus de robot moet worden gekalibreerd op een regelmatig schema en als dat nodig is. Kalibraties moeten omvatten hoeveelheid precipitatiemiddel en mesofase en geleverd als bolus en precipiteermiddel plaatsing in de put. Uiteraard moet zoveel mogelijk kalibratie worden uitgevoerd met volumes en materialen vergelijkbaar met die die wordt gebruikt in proeven die in de periode van de kwaliteitscontrole.
Net zo belangrijk als de kalibratie is zo ook is in voorraad hebben voor een voldoende aanbod van robot onderdelen en benodigdheden. Katastrofisch en onverwachte storingen, blokkades en crashes kunnen en doen optreden. In dat geval kunnen beschikken over een vervangende precipitatiemiddel productietijd tip bijvoorbeeld zou kunnen betekenen dat een zeer waardevolle membraaneiwit preparaat gebruikt zoals het hoort enniet verspild.
Enkele van de voordelen van een robot is het feit dat het in hoofdzaak continu werken en dat het niet lijdt of "klagen" vermoeidheid. Een robot kan ook worden gebruikt onder omstandigheden die niet als mensvriendelijke, zoals in het donker, onder gecontroleerde verlichting en omgevingsomstandigheden en bij extreme temperaturen. De robots laten zien in dit artikel zijn alle gebruikte onder omgevingsomstandigheden bij ~ 20 ° C. Er zijn echter eiwitten en projecten die niet omgevingstemperaturen lichtpunt 11,12 en een oxiderende of reducerende omgeving 13 vereisen. Al deze kunnen worden opgevangen, met relatief gemak, wanneer er een kristallisatie robot wordt gebruikt.
In een eerder Jove video artikel zullen we laten zien hoe kristallisatie onderzoeken door de in meso-methode zijn opgezet handmatig instellen 1. De minimale hoeveelheid mesofase op betrouwbare wijze kan worden afgezien van de hand beperkt is by de gezichtsscherpte en gestage handigheid van de persoon het opzetten van de proeven. In onze ervaring, zijn volumes van mesofase zo laag als 100 nl gemakkelijk behandeld. We weten van een lab waar de standaard volume afgegeven handmatig is ongeveer 40 nl. Echter aanzienlijk kleinere volumes mogelijk met een robot. Afzonderlijk, hebben we aangetoond dat mesofase volumes zo laag als 550 picoliter kunnen robot 14 worden afgegeven. Van dat werk was het duidelijk dat verdere miniaturisering van robot mogelijk die, indien toegepast, zou leiden tot een aanzienlijke vermindering in de hoeveelheid waardevolle membraaneiwit benodigd zijn om een kristallisatie proces.
In deze video artikel werden drie commercieel verkrijgbare robots gebruikt om high-throughput membraaneiwit kristallisatie met behulp van lipide mesofasen aan te tonen. De eerste van deze is ontwikkeld in de MS & FB Group op basis van onze ervaring het opzetten van trials handmatig, zoals beschreven in Jove 1712 1. Dit is het instrumentment hebben we het meest vertrouwd zijn met en het grootste deel van het huidige artikel is gewijd aan het gebruik ervan. De andere twee robots waren op demonstratie in de MS & FB Group op het moment dat het artikel is geschreven en de relevante beeldmateriaal is hier opgenomen in het belang van volledigheid. Alle drie de robots maken gebruik van zeer veel hetzelfde mesofase doseersysteem, het wezenlijke kenmerk van wat een positieve verplaatsing glazen injectiespuit 5,7. Ze verschillen het meest significant met betrekking tot precipiterende levering. Robots 1 en 2 tegelijkertijd afgeven precipitant in 8 putjes, een kolom op een kristallisatie plaat tegelijk. In tegenstelling, Robot 3 verdeelt alle 96 neerslagmiddelen oplossingen in een enkele actie. Robot 2 is het enige instrument met een besteedbaar neerslagmiddel doseren tips. Er zijn voor-en nadelen van de verschillende instrumenten die afhankelijk van de specifieke toepassing, zullen deze niet nader hier. Volstaat de vaststelling dat alle drie de werken zeggen en hebben geproduceerd kristallen van mijmbrane eiwitten in de meso methode.
De volgende stappen in het totale proces van de structuurbepaling van macromoleculaire kristallografie zijn om te oogsten en te cryo-cool kristallen van platen opgezet, zoals beschreven in deze video artikel en om op te nemen en te verwerken röntgendiffractie van hen. Deze onderwerpen worden behandeld in aparte Jove artikelen in deze serie 1,15.
The authors have nothing to disclose.
Er zijn velen die hebben bijgedragen aan dit werk en de meeste zijn uit de membraan structuur-en Functionele Biologie Groep, zowel in het verleden en huidige leden. Als u alle breiden we onze hartelijke dank en waardering. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door subsidies van Science Foundation Ierland (07/IN.1/B1836), de National Institutes of Health (GM75915, P50GM073210 en U54GM094599), en KP7 COST Action CM0902.
Name of reagent | Company | Catalogue number | Components |
Brayer (roller) | Fisher Scientific | 50820937 | Tool |
Gas-tight syringes | Hamilton | 81030 | Tool |
Glass coverslips | Marienfeld | 01029990911 | Disposable |
Glass plates | Marienfeld | 1527127092 | Disposable |
Gryphon LCP Robot | Art Robbins | NA | Tool |
In meso robot | Anachem/Gilson | NA | Tool |
Lab notebook | Various | NA | Tool |
Mosquito LCP Robot | TTP Labtech | NA | Tool |
Perforated double-stick spacer tape | Saunders Corporation (hole-punched) | customized | Disposable |
Precipitant solutions | Various | Various | Reagent |
Purified water | Millipore | NA | Reagent |
Rain-X | Shell Car Care | 80199200 | Reagent |
Syringe tips | Hamilton | 7770-020 (gauge 22) | Tool |
Tissues | Various | Various | Disposable |
Water bottle | various | NA | Reagent |