Aqui é descrito um método para robótica de alto rendimento de cristalização de proteínas de membrana em mesofases lipídicos para utilização na determinação da estrutura utilizando a cristalografia de raios-X macromolecular. Três robôs capazes de lidar com o viscoso e pegajoso mesofase proteína-laden integrante do método são introduzidos.
Estudos de estrutura-função de proteínas de membrana beneficiar grandemente de ter disponíveis de alta resolução de estruturas 3-D do tipo fornecido através de cristalografia de raios-X macromolecular (MX). Um ingrediente essencial de MX é uma fonte constante de difração idealmente qualidade de cristais. A meso ou em fase lipídica cúbico método (LCP) para cristalizar proteínas de membrana é um dos vários métodos disponíveis para a cristalização de proteínas de membrana. Ele faz uso de uma mesofase bicontinua em que para crescer cristais. Como método, ele teve alguns sucessos espetaculares da tarde e tem atraído muita atenção com grupos de pesquisa já muitos interessados em usá-lo. Um dos desafios associados ao método é que a mesofase hospedagem é extremamente viscoso e pegajoso, que lembra uma pasta de dente de espessura. Assim, dispensando-lo manualmente de forma reproduzível em pequenos volumes em poços de cristalização requer habilidade, paciência e uma mão firme. Um protocolo para fazer juª que foi desenvolvido na membrana estrutural e funcional Biologia (MS & FB) Grupo 1-3. Artigos de vídeo Jove que descrevem o método são 1,4 disponíveis.
A abordagem manual para a criação em meso ensaios tem vantagens distintas, com aplicações especiais, tais como otimização de cristal e derivatização. Isto, contudo, sofrem de ser um método de baixo volume de produção. Aqui, nós demonstramos um protocolo para a realização de ensaios de cristalização meso roboticamente. Um robô oferece as vantagens de rapidez, exactidão, precisão, miniaturização e ser capaz de trabalhar continuamente durante períodos prolongados sob o que poderia ser considerado como condições hostis como no escuro, numa atmosfera redutora ou a temperaturas baixas ou elevadas. Um robot de meso, quando utilizados de forma adequada, pode melhorar significativamente a produtividade da estrutura da proteína de membrana e de pesquisa de função ao facilitar a cristalização, que é um dos passos lentos naoleoduto determinação global da estrutura.
Neste artigo de vídeo, que demonstram a utilização de três robôs comercialmente disponíveis, que pode dispensar a mesofase viscoso e pegajoso integrante no crystallogenesis meso. O primeiro robô foi desenvolvido no MS & Grupo FB 5,6. Os outros dois tornaram-se recentemente disponíveis e são incluídos aqui para ser completo.
Uma visão geral do protocolo abordado neste artigo é apresentado na Figura 1. Todas as manipulações foram efectuadas à temperatura ambiente (~ 20 ° C) sob condições ambiente.
Neste artigo de vídeo demonstramos como usar um robô para configurar automaticamente em ensaios de cristalização meso em placas de 96 poços de vidro sanduíche usando uma mesofase proteína-laden lipídica. Os robôs usados neste trabalho foram especialmente concebidos de modo a incluir uma seringa de vidro de deslocamento positivo para o fornecimento preciso e reprodutível dos volumes nanolitros da mesofase viscosa e pegajosa, conforme descrito originalmente 7.
Exatidão e precisão são características importantes de um robô. No entanto, essas características são apenas tão bom quanto o grau de e regularidade que o desempenho do robô é avaliado e calibração é realizada. Escusado será dizer que o desempenho do robô deve ser avaliada enquanto pratos individuais estão a ser criadas. Não é adequado para assumir que o robô funcionará perfeitamente e deixar o robô para execução autônoma. O operador atento e observador deve estar em um position notar por um som ou uma aparência quando algo não está funcionando corretamente e para corrigi-lo imediatamente. Além disso, cada uma das placas deve ser cuidadosamente inspeccionadas por olho para a uniformidade de conteúdo do poço, logo que a placa é selada e antes de ser colocado afastado para ensaios de cristalização. Isso só deve exigir alguns segundos para executar e pode ser feito enquanto a placa ao lado está sendo carregado. Perceber, por exemplo, que os poços particulares não são devidamente preenchido pode destacar o fato de que um certo precipitante ponta distribuição está funcionando corretamente. Deve entrega de mesofase ser visto para ser irregular, o produto relevante defeituoso teria de ser corrigida imediatamente. Ao notar estes problemas e fazer os ajustes relevantes durante o set up vai poupar tempo e materiais, incluindo lipídios valioso e proteína de membrana. Se um gerador de imagens é usado para acompanhar o crescimento de cristais, exatidão e precisão também pode ser monitorado durante o exame. Por exemplo, problemas sistemáticos com gota ou boluslocalização pelo imageador indicam que algo não está certo e que medidas corretivas em algum lugar a montante no protocolo é necessário.
No interesse de um desempenho confiável, portanto, o robô deve ser calibrado em uma programação regular e conforme necessário. Calibrações deve incluir o volume de agente precipitante e mesofase entregue, bem como a colocação de bolus e precipitante no poço. Obviamente, onde quer que possível calibração deve ser feito o uso de volumes e materiais semelhantes aos que serão utilizadas em ensaios realizados no período do exercício de controlo de qualidade.
Tão importante quanto a calibração é assim também está a ter em estoque uma quantidade adequada de peças do robô e suprimentos. Falhas catastróficas e inesperada, bloqueios e acidentes podem acontecer. Em tal caso, ter disponível um substituto ponta entrega precipitante, por exemplo, pode significar que uma preparação de proteína da membrana é extremamente valioso utilizado como deveria eque não seja desperdiçado.
Algumas das vantagens de um robô incluem o facto de que vai funcionar essencialmente de forma contínua e que não sofra de ou "queixar-se de" fadiga. Um robô também pode ser utilizado sob condições que não sejam consideradas humano-friendly, tais como, no escuro, sob iluminação controladas e das condições ambientais, e a temperaturas extremas. Os robôs demonstrados neste artigo foram todas usadas em condições ambientais a ~ 20 ° C. No entanto, há proteínas e projectos que exigem temperaturas ambientes não-controlada, luz 11,12 e um oxidante ou um ambiente de redução 13. Todos estes podem ser servidos, com relativa facilidade, quando um robô de cristalização é usado.
Em um artigo de vídeo anterior JoVE demonstramos como ensaios de cristalização pelo método no meso são configuradas manualmente 1. O volume mínimo de mesofase que pode ser dispensado de forma fiável por mão é limitada by imparcialidade da acuidade visual e constante da pessoa configurar os ensaios. Na nossa experiência, os volumes de mesofase tão baixas como 100 nl são facilmente manipulados. Sabemos de um laboratório onde o volume padrão dispensado manualmente é cerca de 40 nl. No entanto, os volumes consideravelmente menores são possíveis usando um robô. Separadamente, mostrámos que os volumes de mesofase tão baixas como 550 picolitros pode ser dispensada roboticamente 14. Desse trabalho, ficou claro que uma maior miniaturização de robô é possível que, se aplicada, levaria a uma grande redução na quantidade de proteína de membrana valioso necessário para levar a cabo um ensaio de cristalização.
Neste artigo de vídeo, três robôs comercialmente disponíveis foram utilizados para demonstrar a high-throughput cristalização de proteínas de membrana utilizando mesofases lipídicas. O primeiro destes foi desenvolvido no Grupo MS & FB com base na nossa experiência configurar manualmente ensaios, tal como descrito no JoVE 1712 1. Este é o instrumento temos mais familiaridade e a maior parte do artigo actual é dedicado à sua utilização. Os outros dois robôs estavam em demonstração no MS & Grupo FB no momento que o artigo foi escrito e as filmagens relevante é incluído aqui, no interesse da completude. Todos os três robôs usar muito o mesmo sistema de distribuição de mesofase, a característica essencial do qual é uma seringa de vidro de deslocamento positivo 5,7. Eles diferem mais significativamente no que se refere à entrega precipitante. 1 e 2, os robôs podem dispensar precipitante simultaneamente em 8 poços, uma única coluna em um prato de cristalização de cada vez. Em contraste, a Robot 3 dispensa todos os 96 precipitantes soluções em uma única ação. Robô 2 é o único instrumento com descartáveis precipitantes dicas de dispensação. Há prós e contras associados com os diferentes instrumentos que dependem da aplicação em particular, estes não serão elaborados aqui. Basta dizer que o trabalho de todos os três e produziram cristais de membrane proteínas pelo método de meso.
Os próximos passos do processo global de determinação de estrutura por cristalografia macromolecular são para a colheita e para crio-cool cristais a partir de placas, constituídas como descrito no artigo de vídeo e de registo e de difracção de raio-X processo a partir deles. Esses temas são abordados em artigos separados Jove desta série 1,15.
The authors have nothing to disclose.
Há muitas pessoas que contribuíram para este trabalho e são mais da membrana estrutural e Grupo de Biologia Funcional, ambos membros passados e presentes. Para todos nós estendemos nossos mais sinceros agradecimentos e apreciação. Este trabalho foi financiado em parte por doações da Fundação Ciência da Irlanda (07/IN.1/B1836), os Institutos Nacionais de Saúde (GM75915, P50GM073210 e U54GM094599), e do 7 CM0902 Acção COST.
Name of reagent | Company | Catalogue number | Components |
Brayer (roller) | Fisher Scientific | 50820937 | Tool |
Gas-tight syringes | Hamilton | 81030 | Tool |
Glass coverslips | Marienfeld | 01029990911 | Disposable |
Glass plates | Marienfeld | 1527127092 | Disposable |
Gryphon LCP Robot | Art Robbins | NA | Tool |
In meso robot | Anachem/Gilson | NA | Tool |
Lab notebook | Various | NA | Tool |
Mosquito LCP Robot | TTP Labtech | NA | Tool |
Perforated double-stick spacer tape | Saunders Corporation (hole-punched) | customized | Disposable |
Precipitant solutions | Various | Various | Reagent |
Purified water | Millipore | NA | Reagent |
Rain-X | Shell Car Care | 80199200 | Reagent |
Syringe tips | Hamilton | 7770-020 (gauge 22) | Tool |
Tissues | Various | Various | Disposable |
Water bottle | various | NA | Reagent |