Qui è descritto un approccio robotico per alta produttività cristallizzazione di proteine di membrana in mesofasi lipidici destinati determinazione della struttura macromolecolare usando cristallografia a raggi X. Tre robot capaci di gestire la viscoso e appiccicoso proteina-carico mesofase solidale al metodo vengono introdotti.
Studi struttura-funzione di proteine di membrana grande beneficio da avere disponibili ad alta risoluzione strutture 3-D del tipo dotato macromolecolare tramite cristallografia a raggi X (MX). Un ingrediente essenziale di MX è un rifornimento costante di diffrazione idealmente qualità cristalli. Il meso o in fase lipidica cubica (LCP) metodo per cristallizzare proteine di membrana è uno dei diversi metodi disponibili per cristallizzare proteine di membrana. Si fa uso di una mesofase bicontinue in cui crescere cristalli. Come metodo, ha avuto alcuni successi spettacolari in ritardo e ha attirato molta attenzione con i gruppi di ricerca ormai da molti interessati ad utilizzarlo. Una delle sfide connesse con il metodo è che il mesofase hosting è estremamente viscoso e appiccicoso, che ricorda un dentifricio di spessore. Quindi, erogazione manualmente in modo riproducibile in piccoli volumi in pozzi di cristallizzazione richiede abilità, pazienza e una mano ferma. Un protocollo per fare just che è stato sviluppato nel Membrane Strutturale e Funzionale Biologia (MS & FB) Gruppo 1-3. Video Articoli Giove che descrivono il metodo sono disponibili 1,4.
L'approccio manuale a creare in meso studi presenta evidenti vantaggi con applicazioni speciali, quali l'ottimizzazione cristallo e derivatizzazione. Ha, tuttavia soffre di essere un metodo con bassa produttività. Qui, dimostriamo un protocollo per l'esecuzione di prove di cristallizzazione in meso robot. Un robot offre i vantaggi di velocità, accuratezza, precisione, miniaturizzazione e la possibilità di lavorare in continuo per lunghi periodi in quello che potrebbe essere considerato come condizioni ostili come al buio, in una atmosfera riducente o a temperature basse o alte. Un robot in meso, se usato correttamente, può migliorare notevolmente la produttività della struttura della membrana proteica e funzione di ricerca facilitando cristallizzazione, che è uno dei passi lenti nellacomplessiva struttura a pipeline determinazione.
In questo articolo video, viene illustrato l'utilizzo di tre robot disponibili in commercio in grado di dispensare la mesofase viscoso e appiccicoso integrale al crystallogenesis meso. Il primo robot è stato sviluppato in MS e FB Group 5,6. Gli altri due sono stati recentemente resi disponibili e sono inclusi per completezza.
Una panoramica del protocollo in questo articolo è presentato in figura 1. Tutte le operazioni sono state effettuate a temperatura ambiente (~ 20 ° C) in condizioni ambiente.
In questo articolo video che abbiamo dimostrato come utilizzare un robot per impostare automaticamente in prove di cristallizzazione meso in lastre di vetro da 96 pozzetti a sandwich con una proteina-mesofase carico lipidico. I robot utilizzati in questo lavoro sono stati progettati per includere una siringa di vetro spostamento positivo per la consegna accurata e riproducibile di volumi di nanolitri mesofase viscoso e appiccicoso, come originariamente descritto 7.
Accuratezza e precisione sono le caratteristiche importanti di un robot. Tuttavia, queste caratteristiche sono solo buono come il grado di regolarità e di cui viene valutato le prestazioni del robot e taratura. Inutile dire che le prestazioni del robot deve essere valutato quando singole piastre vengono costituiti. Non è corretto pensare che il robot funzionerà senza problemi e di lasciare il robot per l'esecuzione automatica. L'operatore attento e attento dovrebbe essere in position notare da un suono o un aspetto quando qualcosa non funziona correttamente e di correggere immediatamente. Inoltre, ogni piastra deve essere attentamente controllata da occhio per uniformità di contenuto e non appena la piastra è sigillata e prima di essere messo fuori per prove di cristallizzazione. Questo richiede solo pochi secondi per eseguire e può essere eseguita mentre la piastra successiva viene caricata. Notare, per esempio, che i pozzetti particolari non sono adeguatamente riempiti può evidenziare il fatto che una certa punta di erogazione precipitante viene malfunzionamento. Se la consegna di mesofase essere visto per essere irregolare, il relativo elemento difettoso avrebbe bisogno di essere corretti immediatamente. Da notare questi problemi e fare le relative rettifiche durante il set up farà risparmiare tempo e materiali, tra cui lipidi prezioso e proteina di membrana. Se un imager viene utilizzato per monitorare la crescita dei cristalli, l'accuratezza e la precisione possono essere monitorati durante l'esposizione. Ad esempio, problemi sistematici con goccia o boloposizione dalla termocamera indicano che qualcosa non è giusto e che le azioni correttive da qualche parte a monte del protocollo è necessario.
Per motivi di prestazioni affidabili, pertanto il robot deve essere calibrato a intervalli regolari e, se necessario. Calibrazioni dovrebbe includere il volume di precipitante e mesofase pronunciata quanto posizionamento bolo e precipitato nel pozzo. Ovviamente, per quanto possibile, la taratura deve essere effettuata utilizzando i volumi e materiali simili a quelli che verranno utilizzati in studi condotti nel periodo di riferimento l'esercizio di controllo della qualità.
Importante come calibrazione è così anche sta avendo in magazzino una quantità adeguata di parti del robot e forniture. Guasti catastrofici e inaspettati, blocchi e crash possono e si verificano. In tal caso, avendo a disposizione una punta di erogazione precipitante sostituzione, per esempio, potrebbe significare che un prezioso preparazione proteina di membrana viene utilizzata come dovrebbe enon è sprecato.
Alcuni dei vantaggi di un robot includono il fatto che funzionerà sostanzialmente continuo e che non soffre di o 'lamentare' affaticamento. Un robot può essere utilizzato anche in condizioni che non sono considerati human-friendly, come al buio, in condizioni di illuminazione e di condizioni ambientali controllate, ed a temperature estreme. I robot hanno dimostrato in questo articolo sono stati tutti utilizzati in condizioni ambientali a ~ 20 ° C. Tuttavia, ci sono proteine e progetti che richiedono temperature non ambientali, luce controllata 11,12 e un ossidante o un ambiente riducente 13. Tutti questi possono essere soddisfatti, con relativa facilità, quando un robot cristallizzazione viene utilizzato.
In un articolo precedente video JoVE abbiamo dimostrato come prove di cristallizzazione per il metodo in meso sono impostati manualmente 1. Il volume minimo di mesofase che può essere erogato affidabile a mano è limitata by manualità la acutezza visiva e costante della persona che l'impostazione dei processi. Nella nostra esperienza, i volumi di mesofase a partire da 100 nl sono facilmente gestite. Sappiamo di un laboratorio in cui il volume predefinito erogato manualmente è di circa 40 nl. Tuttavia, volumi notevolmente più piccoli sono possibili usando un robot. Separatamente, abbiamo dimostrato che i volumi mesofase a partire da 550 picolitri può fare a meno robot 14. Da quel lavoro era chiaro che miniaturizzazione dal robot è possibile che, se attuato, porterebbe ad una notevole riduzione della quantità di proteina di membrana valore necessario per effettuare un processo di cristallizzazione.
In questo articolo video, tre robot disponibili in commercio sono stati utilizzati per dimostrare high-throughput cristallizzazione della proteina di membrana con mesofasi lipidiche. Il primo di questi è stato sviluppato nel gruppo MS & FB basata sulla nostra esperienza impostare manualmente prove, come descritto in JoVE 1712 1. Questo è lo strumentomento abbiamo più familiarità con e la maggior parte dell'attuale articolo è dedicato al suo utilizzo. Gli altri due robot erano in dimostrazione nel MS & Gruppo FB al momento è stato scritto l'articolo e il filmato in questione è incluso qui nell'interesse di completezza. Tutti e tre i robot utilizzano molto lo stesso sistema mesofase di erogazione, la caratteristica essenziale di che è un positivo siringa di vetro spostamento 5,7. Essi differiscono significativamente più rispetto alla consegna precipitante. Robot 1 e 2 può erogare contemporaneamente precipitante in 8 pozzetti, una singola colonna su una piastra cristallizzazione alla volta. Al contrario, Robot 3 dispensa tutti i 96 soluzioni precipitanti in una singola azione. Robot 2 è l'unico strumento con puntali precipitanti di erogazione. Ci sono vantaggi e svantaggi associati con i diversi strumenti che dipendono dalla particolare applicazione, questi non saranno elaborati qui. Basti dire che tutti e tre di lavoro e hanno prodotto cristalli di meproteine mbrane dal metodo in meso.
I passi successivi nel processo generale di determinazione della struttura di cristallografia macromolecolare sono di raccogliere e di crio-cool cristalli piatti installati come descritto in questo articolo video e di registrare e di processo diffrazione di raggi X da loro. Questi argomenti sono trattati in articoli separati Giove in questa serie 1,15.
The authors have nothing to disclose.
Ci sono molti che hanno contribuito a questo lavoro e la maggior parte sono della membrana Biologia Strutturale e Funzionale del Gruppo, sia i membri passati e presenti. A tutti rivolgiamo i nostri più sentiti ringraziamenti e apprezzamento. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da finanziamenti Science Foundation Ireland (07/IN.1/B1836), il National Institutes of Health (GM75915, P50GM073210 e U54GM094599), e 7 ° PQ CM0902 Azione COST.
Name of reagent | Company | Catalogue number | Components |
Brayer (roller) | Fisher Scientific | 50820937 | Tool |
Gas-tight syringes | Hamilton | 81030 | Tool |
Glass coverslips | Marienfeld | 01029990911 | Disposable |
Glass plates | Marienfeld | 1527127092 | Disposable |
Gryphon LCP Robot | Art Robbins | NA | Tool |
In meso robot | Anachem/Gilson | NA | Tool |
Lab notebook | Various | NA | Tool |
Mosquito LCP Robot | TTP Labtech | NA | Tool |
Perforated double-stick spacer tape | Saunders Corporation (hole-punched) | customized | Disposable |
Precipitant solutions | Various | Various | Reagent |
Purified water | Millipore | NA | Reagent |
Rain-X | Shell Car Care | 80199200 | Reagent |
Syringe tips | Hamilton | 7770-020 (gauge 22) | Tool |
Tissues | Various | Various | Disposable |
Water bottle | various | NA | Reagent |