Heri beskrives en robot tilgang til high-throughput krystallisation af membranproteiner i lipidiske mesofaser til anvendelse i strukturbestemmelse ved hjælp af makromolekylære røntgenkrystallografi. Tre robotter kan håndtere den viskose og klæbende protein-ladede mesofase integreret med fremgangsmåden introduceres.
Struktur-funktionsundersøgelser af membranproteiner stor fordel at have tilgængelige høj opløsning 3-D strukturer af den type, der leveres gennem makromolekylær røntgenkrystallografi (MX). Et væsentligt element i MX er en stabil forsyning af ideelt diffraktions-kvalitet krystaller. Den i meso eller lipidiske kubiske fase (LCP) fremgangsmåde til krystallisering membranproteiner er en af flere metoder til rådighed til krystallisation af membranproteiner. Den gør brug af en bikontinuert mesofase til at dyrke krystaller. Som en metode, har det haft nogle spektakulære succeser sent og har tiltrukket sig megen opmærksomhed med mange forskergrupper nu interesseret i at bruge det. En af de udfordringer, der er forbundet med den metode er, at hosting mesofase er ekstremt tyktflydende og klæbrig, minder om en tyk tandpasta. Således dispensering det manuelt på en reproducerbar måde i små mængder til udkrystallisering brønde kræver dygtighed, tålmodighed og en rolig hånd. En protokol til at gøre just, der blev udviklet i membranen Strukturel & Funktionel Biologi (MS & FB) Gruppe 1-3. Jove video artikler, som beskriver den metode er tilgængelige 1,4.
Den manuelle fremgangsmåde for at oprette en meso forsøg har klare fordele med speciale applikationer, såsom krystal optimering og derivatisering. Det betyder dog lider af at være en lille produktion metode. Her viser vi en protokol til udførelse i meso krystallisering forsøg robot. En robot giver fordelene ved hastighed og nøjagtighed, præcision, miniaturisering og være i stand til at arbejde kontinuerligt i længere perioder under hvilke kan anses for fjendtlige tilstande, såsom i mørke, i en reducerende atmosfære eller ved lave eller høje temperaturer. En i meso robot, når de anvendes korrekt, kan forbedre produktiviteten af membranprotein struktur og funktion forskning ved at lette krystallisation som er en af de langsomme trin isamlede strukturbestemmelse pipeline.
I denne video artiklen udviser vi anvendelsen af tre kommercielt tilgængelige robotter, der kan dispensere den viskøse og klæbende mesofase integreret i meso crystallogenesis. Den første robot blev udviklet i MS & FB Group 5,6. De andre to har for nylig blevet tilgængelige og er medtaget her for fuldstændighedens skyld.
En oversigt af protokollen i artiklen er vist i fig. 1. Alle manipulationer blev udført ved stuetemperatur (~ 20 ° C) under omgivelsesbetingelser.
I denne video artikel har vi vist, hvordan man bruger en robot til automatisk oprettet i meso krystallisering forsøg i 96-brønds glas sandwich-plader ved hjælp af en protein-laden lipide mesofase. Robotterne anvendt i dette arbejde var specielt konstrueret til at omfatte en fortrængningspumpe glassprøjte til nøjagtig og reproducerbar afgivelse af nanoliter volumener af den viskose og klæbrige mesofase, som oprindeligt beskrevet 7.
Nøjagtighed og præcision er vigtige elementer i en robot. Men disse karakteristika er kun så god som den grad, og regelmæssighed, som robot resultater vurderes og kalibrering udføres. Det siger sig selv, at udførelsen af robotten bør evalueres, mens de enkelte plader er ved at blive oprettet. Det er ikke rimeligt at antage, at robotten vil fungere fejlfrit og overlade robotten til at køre uden opsyn. Den opmærksomme og opmærksomme operatør bør være i en position at bemærke med en lyd eller et udseende, når noget ikke fungerer korrekt, og at rette med det samme. Derudover skal hver plade nøje inspiceret med det blotte øje for ensartet og indholdet, så snart pladen forsegles, og før det lægges væk til krystallisation forsøg. Dette bør kun kræve et par sekunder til at udføre og kan gøres mens den næste plade bliver indlæst. Bemærke, for eksempel, kan denne særlige brønde ikke er korrekt udfyldt understrege, at en vis fældningsmiddel dispensering tip er funktionsfejl. Skulle levering af mesofase ses at være uregelmæssig, vil den relevante vare med fejl skal rettes med det samme. Ved at bemærke disse spørgsmål og foretage de relevante justeringer under opsætningen vil spare tid og materialer, herunder værdifuld lipid og membranprotein. Hvis en billeddanner bruges til at spore krystalvækst, kan nøjagtighed og præcision også overvåges under billedbehandling. For eksempel problemer systematisk med drop eller bolusbeliggenhed ved billeddanneren tyder på, at der er noget galt, og at korrigerende handling eller andet sted opstrøms i protokollen er nødvendig.
Af hensyn til pålidelig ydeevne derfor robotten skal kalibreres med jævne mellemrum og efter behov. Kalibreringer bør omfatte mængde fældningsmiddel og mesofase leveres, samt bolus og fældningsmiddel placering i brønden. Naturligvis bør så vidt muligt kalibrering gøres ved hjælp af volumener og materialer svarende til dem, der vil blive anvendt i forsøg udført i den periode, som kvalitetskontrollen øvelse.
Lige så vigtigt som kalibrering så også er at have på lager et tilstrækkeligt udbud af robot reservedele og tilbehør. Katastrofale og uventede nederlag, blokeringer og nedbrud kan og vil forekomme. I et sådant tilfælde, der foreligger en udskiftning præcipitant levering tip for eksempel, betyder måske, at en meget værdifuld membranprotein præparat anvendes som det skal, oger ikke spildt.
Nogle af fordelene ved en robot nævnes, at det vil fungere væsentlige kontinuerligt, og at det ikke lider af eller "klager over" træthed. En robot kan også anvendes under betingelser, der ikke betragtes human-friendly, såsom i mørke, under kontrollerede lys-og miljøforhold, og ved ekstreme temperaturer. Robotterne demonstreret i denne artikel er alle brugte under omgivelsesbetingelser ved ~ 20 ° C. Men der er proteiner og projekter, der kræver ikke-omgivelsestemperaturer, kontrollerede lys 11,12 og en oxiderende eller reducerende miljø 13. Alle disse kan blive taget hensyn til, med relativ lethed, når en krystallisering robot anvendes.
I et tidligere Jové video artikel, vi viste, hvordan krystallisering forsøg ved i meso metoden er sat op manuelt 1. Den mindste mængde mesofase der kan dispenseres pålideligt ved hånden er begrænset by den visuelle skarphed og støt håndethed for den person, opsætning af forsøg. Det er vores erfaring, er mængder af mesofase så lavt som 100 nl let håndteres. Vi kender en lab, hvor standard volumen dispenseres manuelt er omkring 40 nl. Imidlertid væsentligt mindre volumener er muligt ved hjælp af en robot. Separat, har vi vist, mesofase mængder så lave som 550 picoliters kan afgives robotically 14. Fra dette arbejde, det var tydeligt, at yderligere miniaturisering af robot er mulig som, hvis de gennemføres, vil føre til en stor reduktion i mængden af værdifulde membranprotein nødvendig for at gennemføre en krystallisering retssag.
I denne video artiklen blev tre kommercielt tilgængelige robotter benyttes til at påvise high-throughput membranprotein krystallisation med lipidiske mesofaser. Den første af disse blev udviklet i MS & FB Group baseret på vores erfaringer oprettelse forsøg manuelt, som beskrevet i Jove 1712 1. Dette er instrusomerdeltagerioverenskomsten vi har mest kendskab til og størstedelen af den nuværende artikel er helliget til at udnytte. De to andre robotter var på demonstration i MS & FB Group på det tidspunkt, artiklen blev skrevet, og den relevante optagelser er medtaget her af hensyn til fuldstændighed. Alle tre robotter bruger meget ens mesofase doseringssystem, det vigtigste element, der er en positiv forskydning glassprøjte 5,7. De adskiller sig mest markant med hensyn til præcipitant levering. Robotter 1 og 2 kan dispensere fældningsmiddel samtidigt i 8 brønde, en enkelt søjle på en krystallisation plade ad gangen. I modsætning hertil doserer Robot 3 alle 96 fældningsmiddel løsninger i en enkelt handling. Robot 2 er det eneste instrument med engangs præcipitant dispensering tips. Der er fordele og ulemper forbundet med de forskellige instrumenter, der afhænger af den særlige anvendelse, og disse vil ikke blive uddybet her. Det er nok at sige, at alle tre arbejde og har produceret krystaller af migmbrane proteiner ved den i meso metoden.
De næste trin i den overordnede proces for struktur bestemmelse ved makromolekylær krystallografi er til høst og til cryo-cool krystaller fra plader, der er oprettet som beskrevet i denne video artiklen og at registrere og bearbejde røntgendiffraktion fra dem. Disse emner behandles i separate Jové artikler i denne serie 1,15.
The authors have nothing to disclose.
Der er mange, der har bidraget til dette arbejde, og de fleste er fra Membrane strukturelle og funktionelle Biology Group, både tidligere og nuværende medlemmer. Til alle vi udvide vores varmeste tak og påskønnelse. Dette arbejde blev støttet delvist af tilskud fra Science Foundation Ireland (07/IN.1/B1836), National Institutes of Health (GM75915, P50GM073210 og U54GM094599), og FP7 COST Action CM0902.
Name of reagent | Company | Catalogue number | Components |
Brayer (roller) | Fisher Scientific | 50820937 | Tool |
Gas-tight syringes | Hamilton | 81030 | Tool |
Glass coverslips | Marienfeld | 01029990911 | Disposable |
Glass plates | Marienfeld | 1527127092 | Disposable |
Gryphon LCP Robot | Art Robbins | NA | Tool |
In meso robot | Anachem/Gilson | NA | Tool |
Lab notebook | Various | NA | Tool |
Mosquito LCP Robot | TTP Labtech | NA | Tool |
Perforated double-stick spacer tape | Saunders Corporation (hole-punched) | customized | Disposable |
Precipitant solutions | Various | Various | Reagent |
Purified water | Millipore | NA | Reagent |
Rain-X | Shell Car Care | 80199200 | Reagent |
Syringe tips | Hamilton | 7770-020 (gauge 22) | Tool |
Tissues | Various | Various | Disposable |
Water bottle | various | NA | Reagent |