के साथ साथ संरचना macromolecular क्रि एक्स – रे का उपयोग कर निर्धारण में उपयोग के लिए lipidic mesophases में उच्च throughput झिल्ली प्रोटीन के crystallization के लिए एक रोबोट दृष्टिकोण वर्णित है. तीन चिपचिपा और चिपचिपा प्रोटीन से लदी विधि का अभिन्न अंग mesophase से निपटने में सक्षम रोबोट पेश कर रहे हैं.
Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural & Functional Biology (MS&FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4.
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline.
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 °C) under ambient conditions.
हम लेख में इस वीडियो का प्रदर्शन किया है कि कैसे एक रोबोट का उपयोग करने के लिए स्वचालित रूप से meso crystallization परीक्षणों में 96 अच्छी तरह से कांच सैंडविच प्लेटों का उपयोग करते हुए एक प्रोटीन से लदी lipidic mesophase में सेट. विशेष रूप से इस काम में इस्तेमाल रोबोट चिपचिपा और चिपचिपा mesophase nanoliter की मात्रा का सटीक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य वितरण के लिए एक सकारात्मक विस्थापन ग्लास सिरिंज में शामिल हैं, के रूप में मूल रूप से 7 वर्णित करने के लिए डिजाइन किए गए थे.
सटीकता और परिशुद्धता एक रोबोट की महत्वपूर्ण विशेषताएं हैं. हालांकि, इन विशेषताओं के रूप में ही डिग्री और नियमितता जो रोबोट के प्रदर्शन का मूल्यांकन किया है और अंशांकन किया जाता है के रूप में अच्छा कर रहे हैं. यह कह रही है कि रोबोट का प्रदर्शन करते हुए व्यक्तिगत प्लेटों स्थापना की जा रही मूल्यांकन किया जाना चाहिए बिना चला जाता है. यह करने के लिए लगता है कि रोबोट flawlessly समारोह और रोबोट छोड़ने के लिए पहुंच से बाहर चलाने के लिए उपयुक्त नहीं है. चौकस और चौकस ऑपरेटर एक स्थिति में होना चाहिएition एक ध्वनि या एक स्वरूप है जब कुछ ठीक से काम नहीं कर रहा है और इसे तुरंत सही से ध्यान दें. इसके अतिरिक्त, एक थाली ध्यान अच्छी तरह से सामग्री की एकरूपता के लिए किया जाना चाहिए के रूप में जल्द ही आंखों से थाली के रूप में सील है का निरीक्षण किया और इससे पहले कि इसे दूर crystallization परीक्षण के लिए डाल दिया है. यह केवल कुछ सेकंड के प्रदर्शन करने के लिए किया जा सकता है, जबकि अगले प्लेट लोड किया जा रहा है की आवश्यकता होती है चाहिए. देख, उदाहरण के लिए, विशेष कुओं ठीक से नहीं भर रहे हैं कि तथ्य यह है कि एक निश्चित तेज़ वितरण टिप खराब रहता है उजागर कर सकते हैं. के mesophase की डिलीवरी अनियमित हो देखा जाना चाहिए, प्रासंगिक दोषपूर्ण आइटम के लिए तुरंत सुधारा जा आवश्यकता होगी. इन मुद्दों टिप्पण और सेट के दौरान प्रासंगिक समायोजन करने बहुमूल्य लिपिड और झिल्ली प्रोटीन सहित समय और सामग्री को बचाने के लिए होगा. यदि एक imager के क्रिस्टल विकास को ट्रैक करने के लिए प्रयोग किया जाता है, सटीकता और परिशुद्धता भी इमेजिंग के दौरान नजर रखी जा सकता है. उदाहरण के लिए ड्रॉप या सांस के साथ, व्यवस्थित समस्याओंimager द्वारा स्थान से संकेत मिलता है कि कुछ ठीक नहीं है कि और प्रोटोकॉल में सुधारात्मक कार्रवाई कहीं नदी के ऊपर की जरूरत है कि.
इसलिए विश्वसनीय प्रदर्शन के हितों में रोबोट एक नियमित समय पर calibrated किया जाना चाहिए और के रूप में की जरूरत है. Calibrations तेज़ और mesophase में अच्छी तरह से सांस और तेज़ प्लेसमेंट के रूप में के रूप में अच्छी तरह से वितरित की मात्रा को शामिल करना चाहिए. जाहिर है, जहाँ भी संभव अंशांकन मात्रा और उन कि गुणवत्ता नियंत्रण व्यायाम द्वारा कवर की अवधि में किए गए परीक्षणों में इस्तेमाल किया जाएगा के लिए इसी तरह की सामग्री का उपयोग किया जाना चाहिए.
अंशांकन के रूप में इतना महत्वपूर्ण भी स्टॉक में रोबोट भागों और आपूर्ति की पर्याप्त आपूर्ति हो रही है. महासंकट और अप्रत्याशित विफलताओं, रुकावटों और दुर्घटनाओं होते हैं और कर सकते हैं. इस तरह की एक घटना में, एक प्रतिस्थापन तेज़ वितरण टिप, उदाहरण के लिए, मतलब है कि एक बहुत ही मूल्यवान झिल्ली प्रोटीन की तैयारी यह चाहिए के रूप में प्रयोग किया जाता है और हो सकता हैव्यर्थ नहीं है.
एक रोबोट के लाभ में से कुछ तथ्य यह है कि यह अनिवार्य रूप से लगातार काम और यह या थकान की शिकायत 'ग्रस्त नहीं है कि शामिल हैं. एक रोबोट भी अंधेरे में इस तरह के रूप में है कि मानव के अनुकूल नहीं माना जाता है शर्तों के तहत इस्तेमाल किया जा सकता है, नियंत्रित प्रकाश और पर्यावरणीय परिस्थितियों में, और तापमान के चरम पर है. इस लेख में प्रदर्शन रोबोट सब ~ 20 डिग्री सेल्सियस परिवेश की शर्तों के तहत इस्तेमाल किया गया हालांकि, प्रोटीन और परियोजनाओं है कि गैर परिवेश तापमान नियंत्रित प्रकाश 11,12 और एक ऑक्सीकरण या एक 13 पर्यावरण को कम करने की आवश्यकता है. इन सभी के लिए catered जा सकता, रिश्तेदार आसानी, जब एक crystallization रोबोट के साथ प्रयोग किया जाता है.
हम एक पहले जौव वीडियो लेख में प्रदर्शन कैसे meso विधि में से crystallization परीक्षण स्थापित कर रहे हैं 1 मैन्युअल. mesophase की न्यूनतम मात्रा है कि हाथ से मज़बूती से तिरस्कृत कर सकते हैं ख सीमित हैy परीक्षणों की स्थापना व्यक्ति के दृश्य तीक्ष्णता और स्थिर मनमानी. हमारे अनुभव में, mesophase की nl 100 के रूप में कम के रूप में संस्करणों को आसानी से नियंत्रित किया जाता है. हम एक प्रयोगशाला है जहां मूलभूत मात्रा मैन्युअल तिरस्कृत nl 40 के बारे में है के बारे में पता है. हालांकि, काफी छोटी मात्रा एक रोबोट का उपयोग संभव हो रहे हैं. अलग से, हम पता चला है कि 550 picoliters के रूप में कम के रूप में mesophase मात्रा 14 robotically समाप्त किया जा सकता है. उस काम से यह स्पष्ट हो गया है कि रोबोट द्वारा आगे miniaturization संभव है, जो अगर लागू किया, मूल्यवान झिल्ली एक crystallization परीक्षण के लिए बाहर ले जाने के के लिए आवश्यक प्रोटीन की मात्रा में एक बड़ी कमी के लिए नेतृत्व करेंगे.
इस वीडियो लेख में, तीन व्यावसायिक रूप से उपलब्ध रोबोट उच्च throughput झिल्ली प्रोटीन crystallization lipidic mesophases का उपयोग कर प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल किया गया. इनमें से पहला एमएस और अमेरिकन प्लान हमारे अनुभव के आधार पर समूह की स्थापना परीक्षणों मैन्युअल, रूप में 1712 जौव 1 में वर्णित में विकसित किया गया था. यह वाद्य हैजाहिर है हम साथ सबसे परिचित है और वर्तमान लेख के थोक इसके उपयोग के लिए समर्पित है. अन्य दो रोबोट एमएस और समय पर लेख लिखा गया था और प्रासंगिक दृश्य यहाँ पूर्णता के हित में शामिल है अमेरिकन प्लान समूह में प्रदर्शन पर थे. सभी तीन रोबोटों बहुत ही mesophase वितरण प्रणाली, आवश्यक सुविधा है जो एक सकारात्मक विस्थापन कांच 5,7 सिरिंज का उपयोग करें. वे शीघ्र वितरण के संबंध में सबसे महत्वपूर्ण भिन्न होते हैं. रोबोट 1 और 2 तेज़ 8 कुओं, एक crystallization प्लेट पर एक समय में एक एकल स्तंभ में एक साथ वितरित कर सकते हैं. इसके विपरीत, 3 रोबोट एक एकल कार्रवाई में सभी 96 तेज़ समाधान dispenses. 2 रोबोट डिस्पोजेबल तेज़ वितरण सुझावों के साथ ही साधन है. पेशेवरों और विपक्ष के विभिन्न उपकरणों के साथ जुड़ा हुआ है कि विशेष रूप से आवेदन पर निर्भर कर रहे हैं, ये यहाँ पर सविस्तार नहीं जाएगा. इतना ही कहना है कि सभी तीन काम किया है और मुझे के क्रिस्टल का उत्पादनmeso विधि में द्वारा mbrane प्रोटीन.
macromolecular क्रिस्टलोग्राफी द्वारा संरचना निर्धारण की समग्र प्रक्रिया में अगले कदम के फसल के लिए और सेट अप के रूप में इस वीडियो लेख में वर्णित प्लेटों से क्रायो शांत क्रिस्टल और रिकॉर्ड और उन लोगों से एक्स – रे विवर्तन प्रक्रिया के लिए कर रहे हैं. इस श्रृंखला में 1,15 अलग जौव लेख में इन विषयों को कवर कर रहे हैं.
The authors have nothing to disclose.
वहाँ कई जो इस काम के लिए योगदान दिया है और सबसे स्ट्रक्चरल झिल्ली और कार्यात्मक बायोलॉजी समूह, दोनों अतीत और वर्तमान सदस्यों से कर रहे हैं. हम सभी के लिए अपनी हार्दिक धन्यवाद और प्रशंसा का विस्तार. इस काम के हिस्से में विज्ञान फाउंडेशन (07/IN.1/B1836) आयरलैंड, स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (P50GM073210 GM75915, और U54GM094599), और FP7 लागत लड़ाई CM0902 से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
Name of reagent | Company | Catalogue number | Components |
Brayer (roller) | Fisher Scientific | 50820937 | Tool |
Gas-tight syringes | Hamilton | 81030 | Tool |
Glass coverslips | Marienfeld | 01029990911 | Disposable |
Glass plates | Marienfeld | 1527127092 | Disposable |
Gryphon LCP Robot | Art Robbins | NA | Tool |
In meso robot | Anachem/Gilson | NA | Tool |
Lab notebook | Various | NA | Tool |
Mosquito LCP Robot | TTP Labtech | NA | Tool |
Perforated double-stick spacer tape | Saunders Corporation (hole-punched) | customized | Disposable |
Precipitant solutions | Various | Various | Reagent |
Purified water | Millipore | NA | Reagent |
Rain-X | Shell Car Care | 80199200 | Reagent |
Syringe tips | Hamilton | 7770-020 (gauge 22) | Tool |
Tissues | Various | Various | Disposable |
Water bottle | various | NA | Reagent |