Heri beskrives en robot tilnærming til high-throughput krystallisering av membran proteiner i lipidic mesophases for bruk i strukturbestemmelse hjelp makromolekylær røntgenkrystallografi. Three roboter kan håndtere det viskøse og klebrig protein-laden mesofase integrert til metoden innføres.
Struktur-funksjon studier av membran proteiner stor nytte av å ha tilgjengelige høyoppløselige 3-D strukturer av den type som tilbys gjennom makromolekylær røntgenkrystallografi (MX). En viktig ingrediens i MX er en jevn tilførsel av ideelt diffraksjon kvalitet krystaller. Den i meso eller lipidic kubiske fase (LCP) metoden for utkrystalliserer membran proteiner er en av flere metoder for krystallisering membran proteiner. Det gjør bruk av en bicontinuous mesofase til å vokse krystaller. Som en metode, har det hatt noen spektakulære suksesser sent og har tiltrukket seg mye oppmerksomhet med mange fagmiljøer nå interessert i å bruke det. En av utfordringene knyttet til metoden er at hosting mesofase er ekstremt tyktflytende og klebrig, som minner om en tykk tannkrem. Dermed utlevering det manuelt i en reproduserbar måte i små volumer i krystallisering brønner krever dyktighet, tålmodighet og en stødig hånd. En protokoll for å gjøre just som ble utviklet i membranen Structural & Funksjonell Biology (MS & FB) Gruppe 1-3. JOVE video artikler som beskriver fremgangsmåten er tilgjengelige 1,4.
Den manuelle tilnærming for å sette opp i meso studier har klare fordeler med spesialitet programmer, for eksempel krystall optimalisering og derivatisering. Det gjør lider imidlertid fra å være en lav gjennomstrømming metode. Her viser vi en protokoll for å utføre i meso krystallisering forsøk robotically. En robot tilbyr fordelene av hastighet, nøyaktighet, presisjon, miniatyrisering og å kunne jobbe kontinuerlig i lengre perioder under hva som kan anses som fiendtlig forhold som i mørket, i en reduserende atmosfære eller ved lave eller høye temperaturer. En i meso robot, når de brukes riktig, kan forbedre produktiviteten av membranprotein struktur og funksjon forskning ved å tilrettelegge krystallisering som er en av de langsomme trinn isamlet strukturbestemmelse rørledning.
I denne videoen artikkelen viser vi bruken av tre kommersielt tilgjengelige roboter som kan dispensere viskøs og klebrig mesofase integrert i meso crystallogenesis. Den første roboten ble utviklet i MS & FB Gruppe 5,6. De andre to har nylig blitt tilgjengelig og er inkludert her for fullstendighet.
En oversikt av protokollen dekket i denne artikkelen er presentert i figur 1. Alle manipulasjoner ble utført ved romtemperatur (~ 20 ° C) under omgivelsesbetingelser.
I denne videoen artikkelen har vi demonstrert hvordan man bruker en robot til å automatisk sette opp i meso krystallisering studier i 96-brønners glass sandwich-plater ved hjelp av en protein-laden lipidic mesofase. Robotene brukt i dette arbeidet ble spesielt utformet for å inkludere et positivt deplasement glassprøyte for nøyaktig og reproduserbar levering av nanoliter volumer av det viskøse og klebrig mesofase, som opprinnelig beskrevet 7.
Nøyaktighet og presisjon er viktige egenskaper for en robot. Imidlertid, disse egenskapene er bare så god som grad og regularitet som robot ytelsen blir evaluert og kalibrering utføres. Det sier seg selv at resultatene av roboten skal evalueres mens enkelte plater blir satt opp. Det er ikke hensiktsmessig å anta at roboten vil fungere feilfritt og forlate roboten til å kjøre uten tilsyn. Den oppmerksomme og observante operatør bør være i en position å merke av en lyd eller en opptreden når noe ikke fungerer som den skal, og for å rette det umiddelbart. I tillegg bør hver plate være nøye inspisert av øye for ensartethet av vel innhold så snart platen er forseglet og før det tas bort for krystallisering forsøk. Dette bør bare kreve noen sekunder å utføre og kan gjøres mens den neste platen blir lastet. Merke seg, for eksempel, kan det spesielle brønner er ikke riktig fylt fremheve det faktum at en viss precipitant dispensing tips er feil. Bør levering av mesofase sees å være uregelmessig, ville den relevante defekt element må rettes umiddelbart. Ved å notere disse problemene og gjøre de relevante justeringer i løpet satt opp vil spare tid og materialer, inkludert verdifull lipid og membran protein. Hvis en imager brukes til å spore krystallvekst kan nøyaktighet og presisjon også overvåkes under avbildning. For eksempel systematiske problemer med dråpe eller bolusBeliggenheten ved imager indikerer at noe ikke er riktig, og at korrigerende tiltak sted oppstrøms i protokollen er nødvendig.
Av hensyn til pålitelig ytelse derfor roboten må kalibreres regelmessig og ved behov. Kalibreringer bør omfatte volumet av fellingsmidlet og mesofase levert samt bolus og fellingsmidlet plassering i brønnen. Selvfølgelig bør om mulig kalibrering gjøres ved hjelp av volum og materialer som ligner de som vil bli brukt i studier utført i perioden som dekkes av kvalitetskontroll øvelsen.
Like viktig som kalibrering så er også å ha på lager en tilstrekkelig tilførsel av robot deler og rekvisita. Katastrofale og uventede feil, blokkeringer og krasjer kan og forekomme. I et slikt tilfelle, har tilgjengelig en erstatning felling produksjonstid spissen, for eksempel, kan bety at en meget verdifull membranprotein produktet inngår som den skal oger ikke bortkastet.
Noen av fordelene med en robot inkluderer det faktum at det vil fungere hovedsakelig kontinuerlig, og at det ikke lider eller 'klager over' tretthet. En robot kan også brukes under forhold som ikke er betraktet menneskevennlige, for eksempel i mørke, under kontrollert belysning og miljømessige forhold, og ved ekstreme temperaturer. Robotene demonstrerte i denne artikkelen ble alle brukt under vanlige betingelser ved ~ 20 ° C. Men det er proteiner og prosjekter som krever ikke-omgivelsestemperaturer, kontrollert lys 11,12 og en oksiderende eller reduserende miljø 13. Alle disse kan arrangeres, med relativ letthet, når en krystallisering robot blir brukt.
I en tidligere Jove video artikkelen viste vi hvordan krystallisering studier av i meso-metoden er satt opp manuelt 1. Minst mulig volum av mesofase som kan dispenseres pålitelig etter hånden er begrenset by synsskarphet og jevn handedness av personen sette opp forsøkene. I vår erfaring, er mengder mesofase så lavt som 100 nl lett håndterbar. Vi vet om en lab der standard dispensert volum manuelt er ca 40 nl. Imidlertid betydelig mindre volumer er mulig ved hjelp av en robot. Separat, har vi vist at mesofase volumer så lavt som 550 picoliters kan tappes robotically 14. Fra at arbeidet var det klart at ytterligere miniatyrisering av roboten er mulige som, hvis implementert, ville føre til en stor reduksjon i mengden av verdifulle membran protein nødvendig for å utføre en krystallisasjonsprosess trial.
I denne videoen artikkelen ble tre kommersielt tilgjengelige roboter brukes til å demonstrere high-throughput membran protein krystallisering ved hjelp lipidic mesophases. Den første av disse ble utviklet i MS & FB konsernet basert på vår erfaring konfigurerer prøvelser manuelt, som beskrevet i Jove 1712 1. Dette er instrument vi har mest kjennskap til og mesteparten av den nåværende artikkelen er viet til sitt bruk. De andre to roboter var på demonstrasjonen i MS & FB-konsernet på det tidspunktet artikkelen ble skrevet og relevant opptakene er tatt med her av hensyn til fullstendighet. Alle tre roboter bruker veldig mye det samme mesofase dispensing system, viktig funksjon som er en positiv fortrengning glassprøyte 5,7. De skiller mest betydelig med hensyn til fellingsmidlet produksjonstid. Roboter 1 og 2 kan dispensere precipitant samtidig til 8 brønner, en enkelt kolonne på en krystallisering plate om gangen. I kontrast, dispenses Robot 3 alle 96 precipitant løsninger i en enkelt handling. Robot 2 er det eneste instrumentet med engangs precipitant dispensing tips. Det er fordeler og ulemper knyttet til de ulike instrumentene som er avhengige av en bestemt applikasjon, og disse vil ikke bli utdypet her. Det er nok å si at alle tre arbeid og har produsert krystaller av megmbrane proteiner ved in meso metoden.
De neste trinnene i den samlede prosessen strukturbestemmelse av macromolecular krystallografi er å høste og Cryo-kule krystaller fra platene satt opp som beskrevet i denne videoen artikkel, og ta opp og prosess røntgendiffraksjon fra dem. Disse temaene er dekket i egne Jove artikler i denne serien 1,15.
The authors have nothing to disclose.
Det er mange som har bidratt til dette arbeidet, og de fleste er fra Membran strukturelle og funksjonelle biologi Group, både tidligere og nåværende medlemmer. Til alle utvider vi vår varmeste takk og takknemlighet. Dette arbeidet ble støttet delvis av tilskudd fra Science Foundation Irland (07/IN.1/B1836), National Institutes of Health (GM75915, P50GM073210 og U54GM094599), og FP7 COST CM0902.
Name of reagent | Company | Catalogue number | Components |
Brayer (roller) | Fisher Scientific | 50820937 | Tool |
Gas-tight syringes | Hamilton | 81030 | Tool |
Glass coverslips | Marienfeld | 01029990911 | Disposable |
Glass plates | Marienfeld | 1527127092 | Disposable |
Gryphon LCP Robot | Art Robbins | NA | Tool |
In meso robot | Anachem/Gilson | NA | Tool |
Lab notebook | Various | NA | Tool |
Mosquito LCP Robot | TTP Labtech | NA | Tool |
Perforated double-stick spacer tape | Saunders Corporation (hole-punched) | customized | Disposable |
Precipitant solutions | Various | Various | Reagent |
Purified water | Millipore | NA | Reagent |
Rain-X | Shell Car Care | 80199200 | Reagent |
Syringe tips | Hamilton | 7770-020 (gauge 22) | Tool |
Tissues | Various | Various | Disposable |
Water bottle | various | NA | Reagent |