Aquí se describe un enfoque robótico a alto rendimiento de cristalización de proteínas de membrana en mesofases lipídicos para su uso en la determinación de estructura macromolecular usando cristalografía de rayos X. Tres robots capaces de manejar la viscosa y pegajosa proteína cargada de mesofase integral con el método se introducen.
Los estudios de estructura-función de las proteínas de membrana se benefician mucho de tener disponibles de alta resolución de estructuras 3-D del tipo previsto a través de macromolecular cristalografía de rayos X (MX). Un ingrediente esencial del MX es una fuente constante de lo ideal de calidad de difracción de cristales. El meso o lipídica en fase cúbica (LCP) método para la cristalización de proteínas de la membrana es uno de varios métodos disponibles para la cristalización de proteínas de membrana. Se hace uso de una mesofase bicontinua en el cual crecer cristales. Como método, ha tenido algunos éxitos espectaculares en los últimos tiempos y ha llamado mucho la atención de los grupos de investigación ya muchos interesados en su uso. Uno de los desafíos asociados con el método es que la mesofase de alojamiento es extremadamente viscoso y pegajoso, que recuerda a una pasta de dientes de espesor. Por lo tanto, la dispensación de forma manual de una manera reproducible en pequeños volúmenes en los pozos de cristalización requiere habilidad, paciencia y una mano firme. Un protocolo para hacer just que se desarrolló en la membrana Estructural y Funcional de Biología (MS & FB) Grupo 1-3. Artículos Jove de vídeo que describen el método son 1,4 disponibles.
El enfoque manual para la instalación en meso ensayos tiene claras ventajas con aplicaciones especializadas, tales como la optimización de cristal y derivatización. Lo hace sin embargo sufren de ser un método de bajo rendimiento. Aquí, demostramos un protocolo para la realización de ensayos de cristalización en meso robóticamente. Un robot ofrece las ventajas de velocidad, exactitud, precisión, la miniaturización y ser capaz de trabajar de forma continua durante largos períodos de tiempo menores de lo que podría considerarse como condiciones hostiles, tales como en la oscuridad, en una atmósfera reductora o a temperaturas bajas o altas. Un robot en meso, cuando se utiliza correctamente, puede mejorar enormemente la productividad de la estructura de proteínas de membrana y la investigación función facilitando la cristalización que es uno de los pasos lentos en laestructura general tubería determinación.
En este artículo de vídeo, se demuestra el uso de tres robots disponibles comercialmente que pueden prescindir de la mesofase viscoso y pegajoso integral en crystallogenesis meso. El primer robot fue desarrollado en la MS y FB Group 5,6. Los otros dos se han convertido recientemente disponible y se incluyen aquí por completitud.
Una visión general del protocolo cubierto en este artículo se presenta en la Figura 1. Todas las manipulaciones se realizaron a temperatura ambiente (~ 20 ° C) en condiciones ambientales.
En este artículo hemos demostrado vídeo cómo utilizar un robot para configurar automáticamente en los ensayos de cristalización meso en el 96-y placas de vidrio sándwich usando una mesofase lipídica proteína cargada. Los robots utilizados en este trabajo fueron especialmente diseñados para incluir una jeringa de vidrio de desplazamiento positivo para la entrega precisa y reproducible de volúmenes de nanolitros de la mesofase viscoso y pegajoso, como se describió originalmente 7.
La exactitud y la precisión son características importantes de un robot. Sin embargo, estas características son sólo tan buena como el grado y la regularidad que se evalúa el rendimiento del robot y la calibración se realiza. No hace falta decir que el rendimiento del robot debe ser evaluado mientras que las placas individuales se están creando. No es correcto suponer que el robot funcione sin problemas y dejar que el robot ejecute de forma desatendida. El operador atento y observador debe estar en posesiónition notar por un sonido o una aparición cuando algo no está funcionando correctamente y para corregirlo de inmediato. Además, cada placa debe ser cuidadosamente inspeccionados por ojo para la uniformidad de contenido de los pocillos tan pronto como se cierra la placa y antes de que se pone de distancia para pruebas de cristalización. Esto sólo se requieren unos pocos segundos para realizar y se puede hacer mientras que la siguiente placa se está cargando. Al darse cuenta, por ejemplo, que los pozos particulares no estén llenos como puede resaltar el hecho de que un precipitante cierta punta dispensadora está funcionando mal. Si la entrega de mesofase se ve que es irregular, el elemento defectuoso relevante tendría que ser corregido inmediatamente. Al tomar nota de estas cuestiones y hacer los ajustes pertinentes durante el tiempo que ahorrará tiempo y materiales, incluyendo lípidos y valiosa proteína de membrana. Si un generador de imágenes se utiliza para seguir el crecimiento del cristal, la exactitud y precisión también se puede monitorizar durante la exploración. Por ejemplo, los problemas sistemáticos con gota o boloubicación de la cámara indican que algo no está bien y que la acción correctiva en algún lugar río arriba en el protocolo que se necesita.
En aras de un rendimiento fiable tanto, el robot debe ser calibrado en un horario regular y según sea necesario. Calibraciones debe incluir el volumen de precipitante y mesofase suministrar, así como la colocación de bolo y precipitante en el pocillo. Obviamente, siempre que sea posible la calibración se debe hacer uso de volúmenes y materiales similares a aquellos que se utilizan en los ensayos llevados a cabo en el período cubierto por el ejercicio de control de calidad.
Tan importante como la calibración también lo es tener en stock un suministro adecuado de piezas de robot y suministros. Fracasos catastróficos e inesperados, bloqueos y caídas pueden ocurrir y ocurren. En tal caso, disponer de una punta de repuesto de entrega precipitante, por ejemplo, puede significar que una preparación de proteínas de membrana extremadamente valioso se utiliza como debería yno se desperdicia.
Algunas de las ventajas de un robot incluyen el hecho de que funcionará esencialmente de forma continua y que no sufre de o 'se quejan de "fatiga. Un robot también puede ser utilizado en condiciones que no son considerados humano de usar, tales como en la oscuridad, bajo una iluminación controlada y las condiciones ambientales, y en los extremos de temperatura. Los robots se demuestra en este artículo se han utilizado todos en condiciones ambientales a ~ 20 ° C. Sin embargo, hay proteínas y proyectos que requieren temperaturas no ambientales, luz controlada 11,12 y un oxidante o un entorno de reducción 13. Todos estos pueden ser atendidos, con relativa facilidad, cuando un robot de cristalización se utiliza.
En un artículo anterior vídeo JoVE hemos demostrado cómo los ensayos de cristalización por el método de meso se configuran manualmente 1. El volumen mínimo de mesofase que se puede prescindir de manera fiable a mano se limita by la agudeza visual y constante uso de las manos de la persona que configura los ensayos. En nuestra experiencia, los volúmenes de mesofase tan bajas como 100 nl son fácilmente manipulados. Sabemos de un laboratorio donde el volumen predeterminado dispensado manual es de aproximadamente 40 nl. Sin embargo, los volúmenes considerablemente más pequeños son posibles utilizando un robot. Por otra parte, hemos demostrado que los volúmenes de mesofase tan bajas como 550 picolitros se puede prescindir de un robot 14. A partir de ese trabajo estaba claro que miniaturización por robot es posible que, si se aplica, daría lugar a una gran reducción en la cantidad de proteína de membrana valiosa necesaria para llevar a cabo un ensayo de cristalización.
En este artículo de vídeo, tres robots disponibles comercialmente se utilizaron para demostrar de alto rendimiento de la cristalización de proteínas de membrana utilizando mesofases lipídicas. El primero de estos fue desarrollado en el Grupo de MS y FB basado en nuestra experiencia en el establecimiento ensayos manualmente, como se describe en JoVE 1712 1. Este es el instrumentoción tenemos más familiaridad y la mayor parte del artículo actual está dedicada a su uso. Los otros dos robots estaban en manifestación en el Grupo MS & FB en el momento en que fue escrito el artículo y el material pertinente se incluye aquí en aras de la exhaustividad. Los tres robots usan mucho la mesofase mismo sistema de dispensación, la característica esencial de que es una jeringa de vidrio de desplazamiento positivo 5,7. Ellos difieren más significativamente con respecto a la entrega precipitante. Robots 1 y 2 puede prescindir precipitante simultáneamente en 8 pozos, una sola columna en una placa de cristalización a la vez. Por el contrario, Robot 3 dispensa los 96 soluciones precipitantes en una sola acción. Robot 2 es el único instrumento con puntas desechables precipitantes de dispensación. Hay ventajas y desventajas asociadas con los diferentes instrumentos que dependen de la aplicación particular, los cuales no serán elaborados por aquí. Basta con decir que todo el trabajo y han producido tres cristales de mímbrane proteínas por el método en meso.
Los próximos pasos en el proceso general de determinación de la estructura por cristalografía macromolecular son para la cosecha y para la crio-cool cristales de las placas tal como se establece en este artículo y vídeo para grabar y proceso de difracción de rayos X de ellos. Estos temas se tratan en sendos artículos de esta serie Jove 1,15.
The authors have nothing to disclose.
Hay muchas personas que contribuyeron a este trabajo y la mayoría son de la membrana estructural y Grupo de Biología Funcional, ambos miembros pasados y presentes. A todos les extendemos nuestro más sincero agradecimiento y reconocimiento. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones de la Science Foundation Ireland (07/IN.1/B1836), los Institutos Nacionales de Salud (GM75915, P50GM073210 y U54GM094599) y FP7 CM0902 Acción COST.
Name of reagent | Company | Catalogue number | Components |
Brayer (roller) | Fisher Scientific | 50820937 | Tool |
Gas-tight syringes | Hamilton | 81030 | Tool |
Glass coverslips | Marienfeld | 01029990911 | Disposable |
Glass plates | Marienfeld | 1527127092 | Disposable |
Gryphon LCP Robot | Art Robbins | NA | Tool |
In meso robot | Anachem/Gilson | NA | Tool |
Lab notebook | Various | NA | Tool |
Mosquito LCP Robot | TTP Labtech | NA | Tool |
Perforated double-stick spacer tape | Saunders Corporation (hole-punched) | customized | Disposable |
Precipitant solutions | Various | Various | Reagent |
Purified water | Millipore | NA | Reagent |
Rain-X | Shell Car Care | 80199200 | Reagent |
Syringe tips | Hamilton | 7770-020 (gauge 22) | Tool |
Tissues | Various | Various | Disposable |
Water bottle | various | NA | Reagent |