Burada makromoleküler X-ışını kristalografisi yapı belirleme kullanım için lipidik mesophases içinde zar proteinlerinin yüksek verimli kristalleşme için bir robot bir yaklaşım tarif edilmektedir. Yöntemine ayrılmaz viskoz ve yapışkan protein yüklü Mezofaz taşıma kapasitesine sahip üç robotlar tanıtıldı.
Membran proteinlerinin yapı-fonksiyon çalışmaları büyük ölçüde makromoleküler X-ışını kristalografisi (MX) aracılığıyla sağlanır türü mevcut yüksek çözünürlüklü 3-D yapılar sahip yararlanacak. MX temel bir madde ideal kırınımı kaliteli kristaller sabit bir kaynağı olduğunu. Mezo ya da zar proteinleri kristalize edilmesine ilişkin bir lipidik kübik faz (LCP) yöntemi de membran proteinleri kristalizasyonuna yönelik çok sayıda yöntem biridir. Bu kristallerin büyümesi de bir bicontinuous mezofaz kullanır. Bir yöntem olarak, geç bazı muhteşem başarılar olmuştur ve şimdi kullanarak ilgilenen birçok araştırma grupları ile çok dikkat çekti. Yöntemi ile ilişkili sorunlardan biri barındırma Mezofaz kalın bir diş macunu andıran, son derece ağdalı ve yapışkan olmasıdır. Böylece, kristalizasyon kuyulara küçük hacimli bir tekrarlanabilir bir şekilde elle dağıtma beceri, sabır ve elinizi sabit tutmanız gerekir. Ju yapmak için bir protokolMembran Fonksiyonel ve Yapısal Biyoloji (MS & FB) Grup 1-3 geliştirilmiştir st. Yöntemini açıklayan Jüpiter Video yazılar mevcuttur 1,4 bulunmaktadır.
Mezo çalışmalarda kurmak için manuel bir yaklaşımla bu tür kristal optimizasyonu ve türevlendirme gibi özel uygulamalar ile belirgin avantajları vardır. Ancak düşük bir verim yöntemi olmaktan muzdarip yok. Burada, robotik mezo kristallendirme çalışmalarında gerçekleştirmek için bir protokol göstermektedir. Bir robot hız, doğruluk, kesinlik, minyatür ve indirgeyici bir ortamda ya da düşük veya yüksek sıcaklıklarda, örneğin karanlık gibi düşmanca koşullar olarak kabul edilebilir ne altında uzun süre sürekli çalışabilecek olmanın avantajlarını sunmaktadır. Doğru kullanıldığında mezo robot, bir ölçüde de yavaş adımlardan biridir kristalizasyon kolaylaştırarak membran protein yapısını verimlilik ve işlevi araştırma artırabilirgenel yapısının belirlenmesi boru hattı.
Bu video yazıda, mezo crystallogenesis içinde ayrılmaz viskoz ve yapışkan Mezofaz başarabilenin üç piyasada mevcut robotların kullanımını göstermektedir. İlk robot MS & FB Grubu 5,6 geliştirilmiştir. Diğer iki son zamanlarda kullanılabilir hale gelmiştir ve tamlığı için buraya dahildir.
Bu makalede anlatılan protokol bir genel görünüşü Şekil 1'de gösterilmiştir. Bütün manipulasyonlar oda sıcaklığında (yaklaşık 20 ° C) koşullar altında yapıldı.
Bu video yazıda otomatik bir protein yüklü lipidik Mezofaz kullanarak 96-sıra cam sandviç plakaları mezo kristallendirme çalışmalarında kurmak için bir robot nasıl kullanılacağını göstermiştir. Bu çalışmada kullanılan orijinal olarak 7 robot özel olarak tarif edildiği gibi, viskoz ve yapışkan bir mezofaz nanolitre hacimleri doğru ve tekrarlanabilir bir dağıtımı için bir pozitif yer değiştirme cam şırıngaya içerecek şekilde tasarlanmıştır.
Doğruluk ve hassasiyet bir robot önemli özellikleridir. Ancak, bu özellikleri robotun performansı değerlendirilir ve kalibrasyon gerçekleştirilir derece ve düzenlilik olarak sadece iyi. Bireysel plakaları kurmak edilirken robotun performansını değerlendirdi gerektiğini söylemeye gerek yok. Bu robotun kusursuz çalışır ve katılımsız çalıştırmak için robot bırakmak olduğunu varsaymak uygun değildir. Özenli ve dikkatli operatörü bir pos olmalıdırition bir ses falan düzgün çalışmıyor ve hemen düzeltmek için bir görünümü ile dikkat. Ayrıca, her plaka dikkatle en kısa sürede plaka mühürlü yanı içeriklerin bütünlüğü için göz tarafından kontrol edilmelidir ve kristalizasyon denemeleri için uzağa koymak önce. Bu sadece bir sonraki levha yüklenirken birkaç saniye gerçekleştirmek ve yapılabilir gerektirir. Fark, örneğin, özellikle kuyu tam dolu olmayan belirli bir çöktürücü boşaltım ucunu arızalı olduğu gerçeğini aydınlatabilir. Mezofaz teslim düzensiz olduğu görüldü olmalı, ilgili arızalı öğe hemen düzeltilmesi gerekir. Bu konularda dikkat ve kurulum sırasında ilgili ayarlamalar yaparak kadar değerli ve lipid membran proteini içeren, zaman ve malzeme tasarrufu olacaktır. Bir kamera kristal büyüme izlemek için kullanılırsa, doğruluk ve hassasiyet de görüntüleme sırasında izlenebilir. Damla veya hap ile Örneğin, sistematik problemlerkamera tarafından konumu bir şey doğru değildir ve protokol yerde akıntıya düzeltici eylem gerekli olduğunu gösterir.
Güvenilir performans çıkarları nedenle robotu düzenli aralıklarla kalibre edilmeli ve gerektiği gibi. Kalibrasyonları çökeltinin kuyuya bolus ve Çöktürücü yerleşim yanı sıra teslim Mezofaz hacmi içermelidir. Açıkçası, mümkün kalibrasyon kalite kontrol egzersiz kapsadığı dönemde yapılan çalışmalarda kullanılacak benzer hacimleri ve malzemeler kullanılarak yapılmalıdır.
Kalibrasyonu kadar önemlidir bu yüzden de stok robotu parçaları ve malzemeleri yeterli kaynağı yaşıyor edilir. Afet ve beklenmedik arızaları, tıkanıklıkları ve çöker ve meydana yapabilirsiniz. Böyle bir durumda, müsait bir yedek çöktürücü teslim ucu olan, örneğin, çok değerli bir zar proteini hazırlama gerektiği gibi kullanılmış olduğu anlamına olabilir veboşa değildir.
Bir robotun avantajları bazıları aslında devamlı çalışmak ve yorgunluğu 'şikayet' ya zarar vermez olacak gerçeğini içerir. Bir robot, aynı zamanda aydınlatma kontrollü ve çevresel şartlar altında, böyle karanlıkta insan dostu olarak kabul edilmez koşullar altında kullanılan ve aşırı sıcaklıklarda olabilir. Bu makale gösterilen robotlar tüm ~ 20 ° C'de ortam koşullarında kullanıldı Ancak, proteinlerin ve non-ortam sıcaklığında, kontrollü 11,12 ışık ve bir oksitleyici veya indirgeyici bir ortamda 13. gerektirmez proje vardır. Bütün bunlar, bir kristalizasyon robot kullanılan göreceli olarak kolay olan, yiyecek ve içecek olabilir.
Önceki bir Jüpiter Video yazıda mezo yöntemi ile kristallendirme çalışmalarında elle 1 kurmak nasıl gösterdi. El ile güvenilir bir şekilde vazgeçilebilir mezofaz arasında minimum hacmi b sınırlıdırçalışmaların oluşturulmasını kişinin y keskinliği görsel ve istikrarlı ellilik. Bizim tecrübelerimize göre, 100 nl gibi düşük Mezofaz hacimlerini kolaylıkla işlenir. Biz varsayılan hacmi 40 nl hakkında elle dağıtılan bir laboratuar biliyorum. Ancak, oldukça küçük hacimli bir robot kullanarak mümkündür. Bunların yanı sıra, 550 pikolitre gibi düşük mezofaz miktarlar robot 14 vazgeçilebilir olduğunu göstermiştir. Bu iş bakıldığında robot tarafından daha fazla minyatür uygulandığı takdirde, bir kristalizasyon deneme gerçekleştirmek için gerekli olan değerli zar proteini miktarının büyük bir azalmaya yol açacak olan, mümkün olduğu anlaşılmaktadır.
Bu video makalede, üç ticari robotlar lipidik mesophases kullanarak high-throughput membran protein kristalizasyon göstermek için kullanılmıştır. Bunlardan ilk olarak Jove 1712 1 anlatılan manuel denemeler kurma tecrübesine dayanarak MS & FB Grubu, geliştirilmiştir. Bu aletler olduğument ile en aşinalık var ve mevcut makale toplu kullanımı için ayrılmıştır. Diğer iki robot makale yazılmış ve ilgili görüntüleri eksiksizlik çıkarları buraya dahil edilmiştir zamanda MS & FB Grubu gösteri vardı. Her üç robotlar çok aynı Mezofaz dağıtım sistemi, pozitif deplasmanlı cam şırınga 5,7 olduğu temel özelliğini kullanın. Onlar Çöktürücü teslimat ile ilgili en belirgin olarak farklıdır. Robotlar 1 ve 2 8 kuyu, bir anda bir kristalizasyon plaka üzerinde tek bir sütuna aynı anda çöktürücü başarabilenin. Buna karşılık, Robot 3 tek bir eylem tüm 96 Çöktürücü çözümler dağıtır. Robot 2 tek çöktürücü dağıtım ipuçları ile yalnızca bir araçtır. Özellikle uygulamaya bağlıdır farklı enstrümanlar ile ilişkili artılarını ve eksilerini vardır ve bu burada ayrıntılarıyla olmayacak. Her üç çalışma söylemek yeterlidir ve beni kristaller ürettimezo yöntem ile mbrane proteinleri.
Makromoleküler kristalografisi tarafından yapı tayini genel sürecinde sonraki adımları hasat ve kriyo-serin kristalleri için bu videoyu makalede anlatıldığı gibi kurmak plakalar ve kayıt ve onlardan süreci X-ışını kırınımı için vardır. Bu konular bu serinin 1,15 ayrı vallahi makaleler kaplıdır.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışmaya katkıda ve en Yapısal Membran ve Fonksiyonel Biyoloji Grup, geçmiş ve şimdiki üyeleri hem birçok kim vardır. Tüm etmek bizim en içten teşekkürlerimizi ve şükranlarımızı. Bu eser Bilim Vakfı İrlanda (07/IN.1/B1836), Ulusal Sağlık Enstitüleri (GM75915, P50GM073210 ve U54GM094599) ve FP7 COST Action CM0902 hibeleri ile kısmen desteklenmiştir.
Name of reagent | Company | Catalogue number | Components |
Brayer (roller) | Fisher Scientific | 50820937 | Tool |
Gas-tight syringes | Hamilton | 81030 | Tool |
Glass coverslips | Marienfeld | 01029990911 | Disposable |
Glass plates | Marienfeld | 1527127092 | Disposable |
Gryphon LCP Robot | Art Robbins | NA | Tool |
In meso robot | Anachem/Gilson | NA | Tool |
Lab notebook | Various | NA | Tool |
Mosquito LCP Robot | TTP Labtech | NA | Tool |
Perforated double-stick spacer tape | Saunders Corporation (hole-punched) | customized | Disposable |
Precipitant solutions | Various | Various | Reagent |
Purified water | Millipore | NA | Reagent |
Rain-X | Shell Car Care | 80199200 | Reagent |
Syringe tips | Hamilton | 7770-020 (gauge 22) | Tool |
Tissues | Various | Various | Disposable |
Water bottle | various | NA | Reagent |