במסמך מתואר נהלים המיושמים בממברנה קבוצת ביולוגיה המבנית ופונקציונלית לגבישי חלבון קרום קציר וcryo-מגניב שגודלו בשלבים עוקבים וספוג lipidic לשימוש בקביעת מבנה באמצעות קריסטלוגרפיה macromolecular רנטגן קאפרי.
מסלול חשוב להבנה כיצד חלבונים לתפקד ברמה מכניסטית הוא לקבל את המבנה של חלבון המטרה הזמין, באופן אידיאלי ברזולוציה אטומית. נכון להיום, יש רק דרך אחת כדי ללכוד מידע מסוג זה כפי שהוחל על חלבונים אינטגרליים בממברנה (איור 1), ואת הקומפלקסים שהם יוצרים, ושיטה שהיא רנטגן קריסטלוגרפיה macromolecular (MX). כדי לעשות גבישים באיכות עקיפה מושלמת יש צורך בו, במקרה של חלבונים בממברנה, לא יוצר בקלות. שיטה לגיבוש חלבונים בממברנה, הכרוכים בשימוש בmesophases lipidic, במיוחד את השלבים העוקבים וספוג 1-5, זכתה לתשומת לב רבה של עקב האיחור להצלחות שהיו לה בתחום הקולטן G-חלבון בשילוב 6-21 (www . Mpdb.tcd.ie). עם זאת, השיטה, יקרא להלן בטווה או שיטת שלב מעוקב lipidic, מגיע עם טכני שלואתגרים. אלה נובעים, בחלקו, בשל האופי בדרך הצמיג ודביק של mesophase lipidic שבו הגבישים, אשר לעתים גבישי מייקרו, לגדול. מניפולצית גבישים הופכת להיות קשה כתוצאה ובעיקר במהלך קצירת 22,23. בעיות מתעוררות גם בשלב שלפני קציר אשר דורש כי צלחות זכוכית הכריך שבו גדלים הגבישים (איור 2) 24,25 נפתחות כדי לחשוף את בולוס mesophase, ובו הגבישים, לקטיף, קירור וcryo-X סופו של דבר איסוף נתוני עקיפה-ray.
וריאנטים mesophase מעוקבים וספוג (איור 3) שממנה יש לי rheologies נקטפו גבישים שונים השונה המהותי 4,26. השלב מעוקב הוא צמיג ודביק דומה למשחת שיניים עבה. לעומת זאת, בשלב הספוג הוא יותר נוזל עם נטייה מובהקת לזרימה. בהתאם לכך, גישות שונות להתגבשות פתיחת הבארות containiגבישי ng גדלו במעוקב ושלב הספוג נקראים לכפי שאכן שיטות שונות נדרשות לקציר גבישים משני סוגי mesophase. פרוטוקולים לעושים בדיוק את זה כבר מעודן ומיושם בממברנה ביולוגיה מבנית ותפקודית (MS & FB) קבוצה, והם מתוארים בפירוט במאמר זה יופיטר (איור 4). דוגמאות לכך הן נתונה של מצבים שבם מסתיימים בהצלחת הגבישים וcryo התקררו. אנו מספקים גם דוגמאות למקרים בם מתעוררות בעיות שהובילו לאובדן בלתי ההפיך של גבישים ונתאר כיצד בעיות אלה ניתן למנוע. במאמר זה מציג מסופק עם הוראות שלב אחר שלב לפתיחת בארות התגבשות כריך זכוכית, לקציר ולגבישי cryo-קירור של חלבוני קרום גדלו במעוקב ובשלבים ספוגים.
במאמר זה וידאו שהראינו כיצד גבישים גודלו בmesophase lipidic נקצרים וcryo התקררו בתכשיר לשימוש באיסוף נתונים עקיפים וסופו של דבר לקביעת מבנה. Mesophase האירוח יכול להיות שלב מעוקב הצמיג ודביק או שלב הספוג יותר נוזלי 4. איך את צלחות כריכי הזכוכית נפתחות ואיך את הגבישים נקצרים מאוד תלוי בסוג mesophase. לכן חשוב לדעת איזו משני אחד לא עוסק בבעוד מועד. זהותו של שומני האירוח והמזרז בשימוש הן חשובה בהקשר זה, ואת המראה הפיזי של בולוס mesophase בגיבוש גם יכול לשמש כדי להבדיל ביניהם (איור 3). מסיק משני סוגי mesophase הומחש במאמר זה.
קציר גבישים קטנים מmesophase lipidic בצלחות זכוכית כריך הוא תהליך קפדני שדורש זמן, מיומנות, experience, סבלנות ויד יציבה. חשוב להניח בצד את הכמות מתאימה של זמן לקצירה ולהקים את המעבדה כך שכל האספקה והציוד הם בהישג יד מראש. אדם שני, שיסייע בקצירה אינו הכרחי אך מומלץ. אותו האדם יכול לעזור באספקת לוחות מסומנים מראש לאדם עושה קצירה, כמו גם הצבת לולאות רכובות cryo מקוררים עם גבישים נקטפו לתוך דיסקוס האחסון. העוזר יכול גם לשחק תפקיד חשוב בתמיכה בתיעוד תצפיות על הגבישים בוצעו במהלך הקצירה שעשויה להוכיח מכריע במהלך איסוף נתוני עקיפה. בהעדרו של עוזר, מכשיר קול המופעל שמע הקלטה יכול לשמש יתרון לתיעוד.
בעקבות הפרוטוקול המתואר במאמר זה יעזור לי המציג והפעלה עם קצירת גביש. עם זאת, חשוב להבין, שהתהליך אינו פשוט וכי practice נחוץ לפני ההשקה לקצירת גבישי חלבון קרום יקרים ערך. לכן מומלץ שצלחות בדיקה עם גבישים של חלבונים שאינם יקרים במיוחד שהתנסו בראשון. זה יספק את החניך עם ניסיון רב ערך בחיתוך זכוכית, הסרת רסיסי זכוכית, מרים coverglass מרחבי mesophase, תוך שימוש בתכונת הקיטוב במיקרוסקופ כדי לראות גבישים ולעקוב אחריהם במהלך קציר, ולבסוף טיפול בסוגים השונים של mesophases וקציר מהם. המרקם של mesophase, ובהרחבה את הקלות שבה ניתן לקצור גבישים, משתנה עם זמן במהלך התגבשות. לכן חשוב לתרגל קצירה עם גבישים פחות יקרים אבל עם אלה שגדלו באותם תנאים כמו אלה יקרים יותר. זה אפשרי לגדל גבישים של Lysozyme וthaumatin ידי בטווה או שיטת שלב מעוקב lipidic 28 ואלה צריכים להיחשב כנעלי ספורט בדרך של צובר היכרות עם חומרים ואת השיטה. כדאי גם לשקול לעבוד עם mesophase חלבון החופשי ראשון ללמוד מהגחמות שלו.
הנהלים הפגינו כאן היו הכל נעשה ב20 נוח ° C או בסמוך לכך. זה אפשרי לגדל גבישים ידי בשיטה טווה בטמפרטורות נמוכות יותר. לפיכך, monoolein כשומני אירוח במדינת שלב metastable ניתן להשתמש ב 4 ° C 1,2,29,30. אלטרנטיבה היא להשתמש 7.9 MAG תוכנן באופן רציונלי להתגבשות טמפרטורה נמוכה 31. אנחנו עושים crysallogenesis טמפרטורה נמוכה באופן שגרתי עם מטרות חלבון קרום מסוימות. במקרה זה, גידול גביש והקציר נעשה בהליכה, ב4 ° C מקרר. עובד בתנאים כאלה, יש אתגרים משלו לא פחות מזה הוא הצורך בלבוש חם ונוח.
השלב הבא בתהליך הכולל של קביעת מבנה באמצעות crys macromoleculartallography הוא לאסוף נתונים עקיפים על גבישים נקטפו וSnap-התקרר כפי שמודגם במאמר זה. במבוגר טווה גבישים הם בדרך כלל קטנים. עם זאת, איסוף נתונים עקיפים שימושי היה אפשרי בגבישים בעלי ממד מקסימום של 20 מיקרומטר 9. לצורך כך, מייקרו קרן ה-X קרינת סינכרוטרון משמשת ונמצאת במוקד המאמר יופיטר נפרד בסדרת 32,33 זה.
The authors have nothing to disclose.
ישנם רב שתרמו לעבודה זו ורובם מן הקרום המבני קפריי וקבוצת ביולוגיה פונקציונלית, שניהם חברים בעבר ובהווה. לכל, ובמיוחד לJingquan טאן וג'וזף ליונס, אנו מרחיבים את התודה וההערכה החמה שלנו. עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מענקים מקרן המדע אירלנד (07/IN.1/B1836), המכונים הלאומיים לבריאות (GM75915, P50GM073210 וU54GM094599), ועלות FP7 ופעולות Curie מארי (CM0902 וPIEF-GA-2009 -235612).
Name of reagent | Company | Catalogue number | Components |
Curved tweezers | Sigma | F4142 | Tool |
Disposable pipette tips | Gilson | Various | Disposable |
Foam dewar | Spearlab | FD-500 | Tool |
Glass and metal waste containers | Daniels Healthcare | DD479OL | Tool |
Harvesting loops | MiTeGen | Various | Tool |
Harvesting microscope | Nikon | SMZ1500 | Tool |
Lab notebook | Various | NA | Tool |
Magnetic push button sample loading wand | Hampton Research/Molecular Dimensions | HR4-729/MD7-411 | Tool |
Original Puck (for use with ALS-style robots only) | Crystal Positioning Systems | CP-111-035 | Tool |
Pipetting devices | Gilson | Various | Tool |
Precipitant solutions | Various | Various | Reagent |
Puck Bent Cryo-Tong | Crystal Positioning Systems | CP-111-030 | Tool |
Puck Shelved Shipping Cane (original ALS-style) with hooked handle and locking rod | Crystal Positioning Systems | CP-111-029 | Tool |
Purified water | Millipore | Reagent | |
Safety goggles | Various | NA | Tool |
Sample Pin Bases – Magnetic (non-copper) | Crystal Positioning Systems | CP-111-015 | Tool |
Shipping dewar | Taylor-wharton | CX100 | Tool |
Tissues | NA | NA | Disposable |
Tungsten-carbide glass cutter (TCT Scriber) | Silverline Tools (Yeovil, UK) | 633657 | Tool |