Aqui é descrito procedimentos implementados na membrana Caffrey Estrutural e Grupo Biologia Funcional para colheita e crio-cool cristais de proteína de membrana lipídica cultivadas em fases cúbicas e esponja de uso na determinação estrutura usando cristalografia de macromoléculas de raios-X.
Uma via importante para a compreensão de como proteínas funcionar a um nível mecanístico é ter a estrutura da proteína alvo disponível, idealmente em resolução atómica. Presentemente, há apenas uma maneira para captar informação, tais como aplicado a proteínas integrais de membrana (Figura 1), e os complexos se formam, e esse método é a cristalografia de raios-X macromolecular (MX). Para fazer cristais de qualidade MX difracção que são necessários, no caso de proteínas de membrana, não se formam prontamente. Um método para cristalizar proteínas da membrana que envolve o uso de mesofases lipídicos, especificamente as fases cúbicos e esponja 1-5, ganhou atenção considerável devido tarde para o sucesso que teve no campo receptor acoplado à proteína G 6-21 ( www . mpdb.tcd.ie ). No entanto, o método, doravante referida como a em meso ou método fase lipídica cúbico, vem com sua própria técnicadesafios. Estas surgem, em parte, devido à natureza geralmente viscoso e pegajoso da mesofase lipídico no qual os cristais, os quais são muitas vezes micro-cristais, crescer. Manipulando cristais torna-se difícil, como resultado e, particularmente, durante a colheita, 22,23. Os problemas surgem também no passo que precede a colher que requer que as placas de vidro em sanduíche no qual os cristais crescem (Figura 2) 24,25 são abertos para expor o bolus de mesofase, e os cristais na mesma, para a colheita, crio-arrefecimento e X eventuais -ray de coleta de dados de difração.
As variantes de mesofase cúbicos e esponja (Figura 3) a partir da qual devem ser colhidas cristais têm reologias 4,26 profundamente diferentes. A fase cúbica é viscosa e pegajosa semelhante a uma pasta de dentes de espessura. Por outro lado, a fase de esponja é mais fluida com uma clara tendência para fluir. Por conseguinte, as diferentes abordagens para a abertura de poços de cristalização containicristais ng crescem na fase cúbica e esponja são chamados como, aliás, para diferentes métodos são necessários para a colheita de cristais a partir dos dois tipos de mesofase. Protocolos para fazer apenas que foram refinados e aplicados no Membrane Biology estrutural e funcional (MS & FB) de grupo, e são descritos em detalhe neste artigo JoVE (Figura 4). São dados exemplos de situações em que os cristais são colhidos com sucesso e crio-arrefecido. Nós também dar exemplos de casos onde os problemas surgem que levam à perda irreparável de cristais e descrever como esses problemas podem ser evitados. Neste artigo o Viewer é fornecido com o passo-a-passo para a abertura de poços de vidro de cristalização de sanduíche, para a colheita e para crio-refrigeração cristais de proteínas da membrana que crescem em cúbico e em fases de esponja.
Neste artigo de vídeo, demonstramos como cristais crescidos numa mesofase lipídica são colhidas e crio-arrefecido em preparação para utilização na recolha de dados de difracção e, finalmente, para a determinação da estrutura. A mesofase hospedagem pode ser a fase viscosa e pegajosa cúbico ou a fase esponja mais fluido 4. Como as placas de sanduíche de vidro são abertas e como os cristais são colhidas depende muito do tipo de mesofase. É importante, portanto, saber qual dos dois é um lidar com antecedência. A identidade do lípido e do precipitante de hospedagem utilizado são importantes, a este respeito, e a aparência física dos bolus mesofase na cristalização bem podem ser usados para distingui-los (Figura 3). A colheita de ambos os tipos de mesofase foi ilustrado neste artigo.
Colheita de pequenos cristais de uma mesofase lipídico em placas de sanduíche de vidro é um processo trabalhoso que requer tempo, habilidade exper,IENCE paciência, e uma mão firme. É importante reservar uma quantidade de tempo adequado para a colheita e para configurar o laboratório para que todos os suprimentos e equipamentos estão à mão com antecedência. Uma segunda pessoa para facilitar a colheita não é essencial, mas é recomendado. Essa pessoa pode ajudar com o fornecimento de placas pré-marcadas para o indivíduo fazer a colheita, bem como a colocação de crio-refrigerados laços montados com cristais colhidas para o disco de armazenamento. O assistente também pode desempenhar um papel importante apoio na documentação de observações sobre os cristais feitos durante a colheita, que pode revelar-se crucial durante a coleta de dados de difração. Na ausência de um assistente, um dispositivo ativado por voz de gravação de áudio pode ser usado com vantagem para a documentação.
Seguindo o protocolo descrito neste artigo irá ajudar a obter o Visualizador instalado e funcionando com a colheita de cristal. No entanto, é importante ter em conta que o processo não é linear e que practice é necessária antes de se lançar na colheita de cristais de proteínas de membrana valiosos. Recomenda-se, portanto, que as placas de teste com cristais de proteínas que não são particularmente valiosas ser experimentado em primeiro lugar. Isto irá fornecer a neophyte com experiência valiosa no corte de vidro, a remoção de fragmentos de vidro, erguendo-se a lamela de cima da mesofase, utilizando a funcionalidade de polarização no microscópio para observar cristais e localizá-los durante a colheita, e, finalmente, tratamento dos diferentes tipos de mesofases e colher a partir deles. A textura da mesofase, e, por extensão, a facilidade com que os cristais podem ser colhidos, que muda com o tempo, durante a cristalização. É importante, por conseguinte, para a prática de colheita de cristais de menor valor, mas com as que cresceram sob as mesmas condições como as mais importantes. É possível crescer cristais de lisozima e taumatina pelo meso ou no método de fase lipídica cúbica 28 e estes devem ser consideradosrado pelo modo de obter a familiaridade com os materiais e os métodos. Deve-se considerar também a trabalhar com a proteína livre de mesofase primeiro a saber de seus caprichos.
Os procedimentos demonstrados aqui foram todas feitas em um confortável 20 ° C ou menos. É possível cultivar os cristais pelo método de meso a temperaturas mais baixas. Assim, como a mono-oleína lipídico hospedagem em um estado metaestável de fase podem ser utilizados, a 4 ° C 1,2,29,30. Uma alternativa é usar a racionalmente concebidos 7,9 MAG para a cristalização a baixa temperatura 31. Fazemos crysallogenesis baixa temperatura rotineiramente com metas determinadas proteínas de membrana. Neste caso, o crescimento dos cristais e a colheita é feita de uma cabina de refrigerador C 4 °. Trabalhando sob tais condições tem seus próprios desafios não menos do que é a necessidade de roupas quentes e confortáveis.
O passo seguinte no processo global de determinação da estrutura cristalina através macromolecularestallography é coletar dados de difração em cristais colhidos e snap-resfriado, como demonstrado neste artigo. No meso-grown cristais são geralmente pequenas. No entanto, a recolha de dados úteis de difracção tem sido possível com os cristais possuindo uma dimensão máxima de 20 um 9. Para este efeito, micro-feixe síncrotron radiação X é usado e é o foco de um artigo separado JoVE nesta série 32,33.
The authors have nothing to disclose.
Há muitas pessoas que contribuíram para este trabalho e são mais da membrana Caffrey Estrutural e Funcional Grupo Biologia, ambos membros passados e presentes. Para todos, e especialmente para Jingquan Tan e Lyon José, nós estendemos nossos mais sinceros agradecimentos e apreciação. Este trabalho foi financiado em parte por doações da Fundação Ciência da Irlanda (07/IN.1/B1836), os Institutos Nacionais de Saúde (GM75915, P50GM073210 e U54GM094599), e do 7 COST e Acções Marie Curie (CM0902 e PIEF-GA-2009 -235612).
Name of reagent | Company | Catalogue number | Components |
Curved tweezers | Sigma | F4142 | Tool |
Disposable pipette tips | Gilson | Various | Disposable |
Foam dewar | Spearlab | FD-500 | Tool |
Glass and metal waste containers | Daniels Healthcare | DD479OL | Tool |
Harvesting loops | MiTeGen | Various | Tool |
Harvesting microscope | Nikon | SMZ1500 | Tool |
Lab notebook | Various | NA | Tool |
Magnetic push button sample loading wand | Hampton Research/Molecular Dimensions | HR4-729/MD7-411 | Tool |
Original Puck (for use with ALS-style robots only) | Crystal Positioning Systems | CP-111-035 | Tool |
Pipetting devices | Gilson | Various | Tool |
Precipitant solutions | Various | Various | Reagent |
Puck Bent Cryo-Tong | Crystal Positioning Systems | CP-111-030 | Tool |
Puck Shelved Shipping Cane (original ALS-style) with hooked handle and locking rod | Crystal Positioning Systems | CP-111-029 | Tool |
Purified water | Millipore | Reagent | |
Safety goggles | Various | NA | Tool |
Sample Pin Bases – Magnetic (non-copper) | Crystal Positioning Systems | CP-111-015 | Tool |
Shipping dewar | Taylor-wharton | CX100 | Tool |
Tissues | NA | NA | Disposable |
Tungsten-carbide glass cutter (TCT Scriber) | Silverline Tools (Yeovil, UK) | 633657 | Tool |