Hierin wird Verfahren im Caffrey Membrane Strukturelle und Funktionelle Biology Group zu ernten und Kryo-cool Membranprotein Kristalle in Lipid kubische und Schwamm Phasen für den Einsatz in der Struktur-Bestimmung mit makromolekularen Röntgenkristallographie gewachsen implementiert beschrieben.
Ein wichtiger Weg zum Verständnis, wie Proteine bei einer mechanistischen Ebene funktionieren, ist die Struktur des Zielproteins zur Verfügung zu haben, idealerweise mit atomarer Auflösung. Gegenwärtig gibt es nur einen Weg, solche Informationen zu erfassen, um integrale Membranproteine (Abbildung 1), und die Komplexe bilden sie aufgebracht wird, und diese Methode ist makromolekularen Röntgenkristallographie (MX). Tun MX Beugungsqualität Kristalle nötig sind, im Fall von Membranproteinen, nicht leicht zu bilden. Ein Verfahren zur Kristallisation von Membranproteinen, die die Verwendung von lipidischen Mesophasen, speziell die kubischen Phasen 1-5 und Schwamm, beinhaltet hat erhebliche Aufmerksamkeit der späten Aufgrund der Erfolge in der G-Protein-gekoppelten Rezeptor-Feld 6-21 gehabt hat gewonnen ( www . mpdb.tcd.ie ). Jedoch ist das Verfahren, fortan als die in Meso-oder Lipid-kubischen Phase-Verfahren bezeichnet, kommt mit seiner eigenen technischenHerausforderungen. Diese ergeben sich zum Teil aufgrund der im Allgemeinen viskosen und klebrigen Natur der lipidischen Mesophase bei dem die Kristalle, die oft Mikrokristalle, wachsen. Manipulation Kristallen wird schwierig als Ergebnis und besonders so bei der Ernte 22,23. Probleme ergeben sich auch bei dem Schritt, das Ernten der verlangt, dass die Glas-Sandwich-Platten, in der die Kristalle wachsen (Abbildung 2) 24,25 geöffnet werden, um den Mesophasen-Bolus freizulegen vorangeht, und die Kristalle darin zum Ernten, Kryo-Kühlung und späteren X Röntgenbeugung Datensammlung.
Die kubischen und Schwamm Mesophase-Varianten (Abbildung 3), von der Kristalle gewonnen werden muss tief verschieden Rheologien 4,26. Die kubische Phase ist zähflüssig und klebrig ähnlich einem dicken Zahnpasta. Im Gegensatz dazu ist der Schwamm Phase mehr Flüssigkeit mit ausgeprägter Neigung zur Strömungsrichtung. Dementsprechend werden verschiedene Ansätze für die Öffnung der Kristallisation Brunnen containing Kristalle wachsen in der kubischen und der Schwamm-Phase werden als tatsächlich verschiedene Methoden zur Gewinnung von Kristallen aus den beiden Mesophase Typen erforderlich bezeichnet. Protokolle für genau das zu tun verfeinert worden sind und in der Membrane Strukturelle und Funktionelle Biologie (MS & FB)-Gruppe implementiert und werden im Detail in diesem JoVE Artikel (Abbildung 4) beschrieben. Beispiele sind Situationen, in denen Kristalle erfolgreich geerntet und Kryo-abgekühlt gegeben. Wir bieten auch Beispiele von Fällen, in denen Probleme auftreten sollten, die die unwiederbringlichen Verlust von Kristallen und beschreiben, wie diese Probleme vermieden werden können. In diesem Artikel wird der Betrachter mit Schritt-für-Schritt-Anleitungen für die Öffnung der Glas-Sandwich Kristallisation Brunnen, für die Ernte und für Kryo-Kühlung Kristalle von Membranproteinen wächst in kubischer und Schwamm Phasen vorgesehen.
In diesem Video Artikels wir demonstriert, wie Kristalle in einer lipidischen Mesophase wachsen geerntet und in Vorbereitung für die Verwendung in Beugung Datenerhebung und letztlich zur Strukturbestimmung Kryo-abgekühlt. Die Hosting-Mesophase kann der viskosen und klebrigen kubischen Phase oder mehr Flüssigkeit Schwamm-Phase 4 sein. Wie die Glas-Sandwich-Platten sind geöffnet und wie die Kristalle sehr viel geerntet hängt Mesophase Typ. Es ist daher wichtig zu wissen, welche der beiden ein mit sich vor der Zeit. Die Identität des Hosting-Lipid-und Fällungsmittel verwendet werden, sind in diesem Zusammenhang wichtig, und die physische Erscheinung der Mesophase Bolus bei der Kristallisation auch verwendet werden, um sie auseinander zu werden (Abbildung 3). Ernte von beiden Mesophase Typen wurde in diesem Artikel dargestellt.
Harvesting kleine Kristalle aus einer Lipid-Mesophase in Glas-Sandwich-Platten ist ein mühsamer Prozess, der Zeit, Geschicklichkeit, exper benötigtience, Geduld und eine ruhige Hand. Es ist wichtig, beiseite stellen eine angemessene Menge an Zeit für die Ernte und die Einrichtung des Labors, so dass alle Versorgungsgüter und Ausrüstungsgegenstände zur Hand sind im Voraus. Eine zweite Person, die bei der Ernte zu helfen ist nicht unbedingt erforderlich, wird aber empfohlen. Diese Person kann mit der Lieferung vormarkierten Platten auf den einzelnen zu tun, die Ernte sowie Platzierung Kryo-gekühlten montiert Schleifen mit geernteten Kristalle in den Speicher Puck helfen. Der Assistent kann auch eine wichtige unterstützende Rolle bei der Dokumentation von Beobachtungen über die Kristalle während der Ernte das könnte entscheidend sein bei der Beugung der Datenerhebung gemacht. In Abwesenheit eines Helfers konnte ein sprachgesteuertes Audio-Aufzeichnungsvorrichtung, die Vorteile für die Dokumentation verwendet werden.
Nach dem Protokoll in diesem Artikel beschrieben wird Ihnen helfen, den Viewer und läuft mit Kristall Ernte. Es ist jedoch wichtig zu erkennen, dass das Verfahren nicht einfach und daß practice wird vor dem Start in die Ernte wertvolle Membranprotein Kristalle benötigt. Es wird daher Testplatten mit Kristallen von Proteinen, die nicht besonders wertvoll sind mit ersten experimentiert werden empfohlen. Dadurch wird die neophyte wertvolle Erfahrung Schneiden von Glas bereitzustellen, Entfernen Glasscherben, Anheben des Abdeckglases von über der Mesophase, unter Verwendung der polarisierenden Funktion auf dem Mikroskop, um Kristalle zu sehen und sie während des Erntens zu verfolgen, und schließlich die Handhabung der verschiedenen Arten von Mesophasen und Ernte von ihnen. Die Textur der Mesophase, und durch Erweiterung der Leichtigkeit, mit welcher sich Kristalle geerntet werden können, ändert sich mit der Zeit während der Kristallisation. Es ist daher wichtig zu üben Ernte mit weniger wertvolle Kristalle, sondern mit denen, die unter den gleichen Bedingungen wie die weitere wertvollsten gewachsen. Es ist möglich, Kristalle von Lysozym und Thaumatin durch die in meso-oder lipidische kubischen Phase Methode 28 wachsen und diese sollten consid werdenEred mittels gewinnt sich mit den Materialien und dem Verfahren. Man sollte auch bedenken das Arbeiten mit Protein-freie Mesophase erste seiner Launen zu lernen.
Die Verfahren nachgewiesen hier wurden alle bei einer komfortablen 20 ° C oder ungefähr getan. Es ist möglich, Kristalle durch die im meso Verfahren wachsen bei niedrigeren Temperaturen. Somit kann Monoolein als Hosting Lipid in einer metastabilen Phase Zustand bei 4 ° C 1,2,29,30 verwendet werden. Eine Alternative besteht darin, die rational entworfen 7,9 MAG für Tieftemperaturkristallisation 31 verwenden. Wir tun niedrigen Temperaturen crysallogenesis routinemäßig mit bestimmten Membranprotein Ziele. In diesem Fall wird das Kristallwachstum und die Ernte in einem begehbaren in 4 ° C Kühlschrank getan. Arbeiten unter solchen Bedingungen hat ihre eigenen Herausforderungen nicht zuletzt von denen die Notwendigkeit für einen warmen und bequeme Kleidung ist.
Der nächste Schritt im gesamten Prozess der Strukturaufklärung mit makromolekularen crystallography ist Beugungsdaten auf Kristalle geerntet und Snap-gekühlt in diesem Artikel gezeigt sammeln. In meso-grown-Kristallen sind in der Regel klein. Allerdings hat nützlich Beugung Datensammlung gewesen mit Kristallen mit einer maximalen Abmessung von 20 um 9 möglich. Zu diesem Zweck wird micro-beam Synchrotron-Strahlung und ist der Mittelpunkt eines separaten JoVE Artikel dieser Serie 32,33.
The authors have nothing to disclose.
Es gibt viele, trugen zu dieser Arbeit und die meisten sind aus dem Caffrey Membrane Strukturelle und Funktionelle Biology Group, beide in Vergangenheit und Gegenwart Mitglieder. An alle, und vor allem Jingquan Tan und Joseph Lyons, erweitern wir unseren herzlichen Dank und Anerkennung. Diese Arbeit wurde zum Teil durch Zuschüsse aus Science Foundation Ireland (07/IN.1/B1836), den National Institutes of Health (GM75915, P50GM073210 und U54GM094599) und FP7 COST und Marie Curie Actions (CM0902 und PIEF-GA-2009 unterstützt -235.612).
Name of reagent | Company | Catalogue number | Components |
Curved tweezers | Sigma | F4142 | Tool |
Disposable pipette tips | Gilson | Various | Disposable |
Foam dewar | Spearlab | FD-500 | Tool |
Glass and metal waste containers | Daniels Healthcare | DD479OL | Tool |
Harvesting loops | MiTeGen | Various | Tool |
Harvesting microscope | Nikon | SMZ1500 | Tool |
Lab notebook | Various | NA | Tool |
Magnetic push button sample loading wand | Hampton Research/Molecular Dimensions | HR4-729/MD7-411 | Tool |
Original Puck (for use with ALS-style robots only) | Crystal Positioning Systems | CP-111-035 | Tool |
Pipetting devices | Gilson | Various | Tool |
Precipitant solutions | Various | Various | Reagent |
Puck Bent Cryo-Tong | Crystal Positioning Systems | CP-111-030 | Tool |
Puck Shelved Shipping Cane (original ALS-style) with hooked handle and locking rod | Crystal Positioning Systems | CP-111-029 | Tool |
Purified water | Millipore | Reagent | |
Safety goggles | Various | NA | Tool |
Sample Pin Bases – Magnetic (non-copper) | Crystal Positioning Systems | CP-111-015 | Tool |
Shipping dewar | Taylor-wharton | CX100 | Tool |
Tissues | NA | NA | Disposable |
Tungsten-carbide glass cutter (TCT Scriber) | Silverline Tools (Yeovil, UK) | 633657 | Tool |