के साथ साथ Caffrey स्ट्रक्चरल और फसल और क्रायो शांत झिल्ली प्रोटीन संरचना macromolecular क्रि एक्स – रे का उपयोग कर निर्धारण में उपयोग के लिए lipidic घन और स्पंज चरणों में हो क्रिस्टल कार्यात्मक बायोलॉजी समूह झिल्ली में लागू प्रक्रियाओं का वर्णन है.
An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at atomic resolution. Presently, there is only one way to capture such information as applied to integral membrane proteins (Figure 1), and the complexes they form, and that method is macromolecular X-ray crystallography (MX). To do MX diffraction quality crystals are needed which, in the case of membrane proteins, do not form readily. A method for crystallizing membrane proteins that involves the use of lipidic mesophases, specifically the cubic and sponge phases1-5, has gained considerable attention of late due to the successes it has had in the G protein-coupled receptor field6-21 (www.mpdb.tcd.ie). However, the method, henceforth referred to as the in meso or lipidic cubic phase method, comes with its own technical challenges. These arise, in part, due to the generally viscous and sticky nature of the lipidic mesophase in which the crystals, which are often micro-crystals, grow. Manipulating crystals becomes difficult as a result and particularly so during harvesting22,23. Problems arise too at the step that precedes harvesting which requires that the glass sandwich plates in which the crystals grow (Figure 2)24,25 are opened to expose the mesophase bolus, and the crystals therein, for harvesting, cryo-cooling and eventual X-ray diffraction data collection.
The cubic and sponge mesophase variants (Figure 3) from which crystals must be harvested have profoundly different rheologies4,26. The cubic phase is viscous and sticky akin to a thick toothpaste. By contrast, the sponge phase is more fluid with a distinct tendency to flow. Accordingly, different approaches for opening crystallization wells containing crystals growing in the cubic and the sponge phase are called for as indeed different methods are required for harvesting crystals from the two mesophase types. Protocols for doing just that have been refined and implemented in the Membrane Structural and Functional Biology (MS&FB) Group, and are described in detail in this JoVE article (Figure 4). Examples are given of situations where crystals are successfully harvested and cryo-cooled. We also provide examples of cases where problems arise that lead to the irretrievable loss of crystals and describe how these problems can be avoided. In this article the Viewer is provided with step-by-step instructions for opening glass sandwich crystallization wells, for harvesting and for cryo-cooling crystals of membrane proteins growing in cubic and in sponge phases.
हम लेख में इस वीडियो का प्रदर्शन कैसे एक lipidic mesophase में हो क्रिस्टल और काटा क्रायो – विवर्तन डेटा संग्रह में उपयोग के लिए तैयार करने में और अंततः संरचना के निर्धारण के लिए ठंडा. होस्टिंग mesophase चिपचिपा और चिपचिपा घन चरण या अधिक तरल पदार्थ स्पंज 4 चरण हो सकता है. कैसे गिलास सैंडविच प्लेटें खोले जाते हैं और कैसे क्रिस्टल बहुत बहुत काटा जाता mesophase प्रकार पर निर्भर करता है. यह इसलिए महत्वपूर्ण है पता करने के लिए जो दो एक के साथ काम कर रहा है समय के आगे. होस्टिंग लिपिड और तेज़ की पहचान इस संबंध में महत्वपूर्ण हैं, और crystallization में mesophase सांस की शारीरिक उपस्थिति अच्छी तरह से करने के लिए उन्हें अलग बता इस्तेमाल किया जा सकता है (3 चित्रा). दोनों mesophase प्रकार से फसल काटने वाले इस लेख में सचित्र था.
ग्लास सैंडविच प्लेटों में एक lipidic mesophase से छोटे क्रिस्टल फसल काटने वाले एक श्रमसाध्य प्रक्रिया है कि समय, कौशल, अनुभव की आवश्यकता हैience धैर्य, और एक स्थिर हाथ. यह महत्वपूर्ण है कि एक तरफ एकत्रित करने के लिए समय का एक उचित मात्रा सेट और प्रयोगशाला को स्थापित करने के लिए इतना है कि सभी सामग्री और उपकरण अग्रिम में हाथ में हैं. कटाई के साथ सहायता के लिए एक दूसरे व्यक्ति के लिए आवश्यक नहीं है, लेकिन सिफारिश की है. उस व्यक्ति व्यक्तिगत कटाई कर रही पूर्व चिह्नित प्लेटों की आपूर्ति के रूप में के रूप में अच्छी तरह से भंडारण पक में काटा क्रिस्टल के साथ क्रायो कूल्ड घुड़सवार loops रखने के साथ मदद कर सकते हैं. सहायक भी कटाई कि विवर्तन डेटा संग्रह के दौरान महत्वपूर्ण साबित हो सकता है के दौरान बनाया क्रिस्टल पर टिप्पणियों का दस्तावेजीकरण में एक महत्वपूर्ण समर्थन भूमिका निभा सकते हैं. एक सहायक के अभाव में, एक आवाज सक्रिय ऑडियो रिकॉर्डिंग डिवाइस प्रलेखन के लिए लाभ के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
इस आलेख में वर्णित प्रोटोकॉल के बाद Viewer पाने के लिए और क्रिस्टल कटाई के साथ चल रहा है में मदद मिलेगी. हालांकि, यह महत्वपूर्ण है करने के लिए सराहना करते हैं कि इस प्रक्रिया को सरल और नहीं है कि प्राctice मूल्यवान झिल्ली प्रोटीन क्रिस्टल कटाई में शुरू करने से पहले की जरूरत है. इसलिए यह सिफारिश की है कि प्रोटीन है कि विशेष रूप से महत्वपूर्ण नहीं हैं के क्रिस्टल के साथ परीक्षण प्लेट 1 के साथ प्रयोग किया जा है. इस कांच को काटने में मूल्यवान अनुभव के साथ नौसिखिया प्रदान करेगा, गिलास shards को हटाने, ऊपर mesophase भर से coverglass उठाने, खुर्दबीन पर ध्रुवीकरण सुविधा का उपयोग करने के लिए क्रिस्टल देखते हैं और उन्हें कटाई के दौरान ट्रैक, और अंत में mesophases के विभिन्न प्रकार से निपटने और उन से कटाई. mesophase, और जिस आसानी के साथ क्रिस्टल काटा जा सकता है विस्तार, बनावट crystallization दौरान समय के साथ परिवर्तन करता है. यह इसलिए महत्वपूर्ण है कम मूल्यवान क्रिस्टल के साथ लेकिन उन कि अधिक मूल्यवान वाले के रूप में एक ही परिस्थितियों में हो गए हैं के साथ कटाई अभ्यास. यह संभव है meso या lipidic घन चरण 28 विधि में लाइसोजाइम और thaumatin के क्रिस्टल विकसित और इन माना किया जाना चाहिएसामग्री और विधि के साथ परिचित पाने के रास्ते से जुटी है. एक भी 1 प्रोटीन से मुक्त mesophase के साथ काम करने के लिए अपने अनियमितता के जानने पर विचार करना चाहिए.
यहाँ का प्रदर्शन प्रक्रियाओं के सभी एक आरामदायक 20 डिग्री सेल्सियस पर या आस किया गया. यह संभव है meso विधि में कम तापमान पर क्रिस्टल विकसित. इस प्रकार, एक metastable राज्य चरण में मेजबानी लिपिड के रूप monoolein 4 डिग्री सेल्सियस 1,2,29,30 पर इस्तेमाल किया जा सकता है. एक विकल्प के कम तापमान 31 crystallization के लिए तर्क से करने के लिए डिज़ाइन पत्रिका 7.9 का उपयोग करने के लिए है. हम कम तापमान crysallogenesis नियमित कुछ झिल्ली प्रोटीन लक्ष्य के साथ. इस मामले में, क्रिस्टल विकास और कटाई चलने में 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में किया जाता है. ऐसी परिस्थितियों में कार्य करना अपनी चुनौतियों का सामना है जो नहीं की कम से कम गर्म और आरामदायक पोशाक के लिए जरूरत है.
संरचना निर्धारण की समग्र प्रक्रिया में अगले कदम macromolecular crys का उपयोगtallography काटा और तस्वीर ठंडा के रूप में इस लेख में प्रदर्शन पर क्रिस्टल विवर्तन डेटा इकट्ठा meso-विकसित क्रिस्टल आम तौर पर छोटे. हालांकि, उपयोगी विवर्तन डेटा संग्रह 20 9 सुक्ष्ममापी की एक अधिकतम आयाम होने क्रिस्टल के साथ संभव है. इस प्रयोजन के लिए, सूक्ष्म किरण सिंक्रोटॉन एक्स – विकिरण का इस्तेमाल किया जाता है और इस श्रृंखला में 32,33 एक अलग जौव लेख का ध्यान केंद्रित है.
The authors have nothing to disclose.
वहाँ कई जो इस काम के लिए योगदान दिया है और सबसे Caffrey स्ट्रक्चरल झिल्ली और कार्यात्मक बायोलॉजी समूह, दोनों अतीत और वर्तमान सदस्यों से कर रहे हैं. सभी के लिए, और विशेष रूप से Jingquan टैन और यूसुफ Lyons, हम अपनी हार्दिक धन्यवाद और प्रशंसा का विस्तार. इस काम के हिस्से में विज्ञान फाउंडेशन (07/IN.1/B1836) आयरलैंड, स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (P50GM073210 GM75915, और U54GM094599), और FP7 लागत और मैरी क्यूरी प्रक्रिया (CM0902 और PIEF-GA-2009 से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया -235,612).
Name of reagent | Company | Catalogue number | Components |
Curved tweezers | Sigma | F4142 | Tool |
Disposable pipette tips | Gilson | Various | Disposable |
Foam dewar | Spearlab | FD-500 | Tool |
Glass and metal waste containers | Daniels Healthcare | DD479OL | Tool |
Harvesting loops | MiTeGen | Various | Tool |
Harvesting microscope | Nikon | SMZ1500 | Tool |
Lab notebook | Various | NA | Tool |
Magnetic push button sample loading wand | Hampton Research/Molecular Dimensions | HR4-729/MD7-411 | Tool |
Original Puck (for use with ALS-style robots only) | Crystal Positioning Systems | CP-111-035 | Tool |
Pipetting devices | Gilson | Various | Tool |
Precipitant solutions | Various | Various | Reagent |
Puck Bent Cryo-Tong | Crystal Positioning Systems | CP-111-030 | Tool |
Puck Shelved Shipping Cane (original ALS-style) with hooked handle and locking rod | Crystal Positioning Systems | CP-111-029 | Tool |
Purified water | Millipore | Reagent | |
Safety goggles | Various | NA | Tool |
Sample Pin Bases – Magnetic (non-copper) | Crystal Positioning Systems | CP-111-015 | Tool |
Shipping dewar | Taylor-wharton | CX100 | Tool |
Tissues | NA | NA | Disposable |
Tungsten-carbide glass cutter (TCT Scriber) | Silverline Tools (Yeovil, UK) | 633657 | Tool |