Häri beskrivs förfaranden som genomförs inom Caffrey Membrane strukturell och funktionell biologi koncernen att skörda och kryo-cool kristaller membranprotein odlas i lipidiska kubiska och svamp faser för användning i strukturbestämning med makromolekylär röntgenkristallografi.
En viktig väg för att förstå hur proteiner fungerar på en mekanistisk nivå är att ha strukturen av målproteinet finns, helst på atomär upplösning. För närvarande finns det bara ett sätt att fånga sådan information som tillämpas för integrala membranproteiner (figur 1), och komplexen som de bildar, och att metoden är makromolekylär röntgenkristallografi (MX). För att göra MX diffraktion kvalitet kristaller behövs, vilket i fallet med membranproteiner, bildar inte lätt. En metod för att kristallisera membranproteiner som innefattar användning av lipida mesofaser, särskilt de kubiska och svamp faser 1-5, har fått stor uppmärksamhet på senare tid på grund av de framgångar man haft i G-protein-kopplade receptorer fält 6-21 ( www . mpdb.tcd.ie ). Den metod, hädanefter kallad i meso eller lipidisk kubisk fas metoden kommer med sin egen tekniskautmaningar. Dessa uppkommer, delvis på grund av den allmänt viskösa och klibbiga natur lipidiska mesofas i vilken kristallerna, som ofta mikro-kristaller, växa. Manipulera kristaller blir svårt på grund och i synnerhet så under skörd 22,23. Problem uppstår också vid steget som föregår skörden som kräver att glaset sandwich plattor där kristallerna växer (Figur 2) 24,25 öppnas för att exponera mesofasen bolus och kristallerna däri, för skörd, kryo-kylning och eventuella X -diffraktion datainsamling.
Den kubiska och svamp mesofas varianter (Figur 3) som kristaller måste skördas ha djupgående olika reologier 4,26. Den kubiska fasen är viskös och klibbig besläktad med en tjock tandkräm. Däremot är svampen fasen mer vätska med en distinkt tendens att flyta. Följaktligen olika metoder för att öppna kristallisation brunnar containing kristaller växer i kubik och svampen fasen kallas så verkligen olika metoder krävs för att skörda kristaller från de två mesofas typer. Protokoll för just detta har förfinats och genomförts i membranet strukturell och funktionell biologi (MS & FB) koncernen och beskrivs i detalj i denna JUPITER artikeln (Figur 4). Exempel ges på situationer där kristaller framgångsrikt skördas och kryo-kylda. Vi erbjuder också exempel på fall där problem uppstår som leder till oersättlig förlust av kristaller och beskriva hur dessa problem kan undvikas. I denna artikel bildvisaren är försedd med steg-för-steg-instruktioner för att öppna glas brunnar sandwich kristallisation, för skörd och kryo-kylning kristaller av membranproteiner växer i kubisk och svamp faser.
I denna video artikeln vi visat hur kristaller odlas i en lipidisk mesofas skördas och kryo-kylda som förberedelse för användning i diffraktion datainsamling och slutligen för strukturbestämning. Den webbhotell mesofas kan vara viskösa och klibbiga kubiska fasen eller mer flytande svamp fas 4. Hur glaset sandwich plattorna öppnas och hur kristallerna skördas beror mycket på mesofas typ. Det är därför viktigt att veta vilken av de två man har att göra med i förväg. Den identitet värd lipid och fällningsmedel som används är viktiga i detta avseende, och den fysiska utseende mesofas bolus i kristallisationen väl kan användas för att skilja dem åt (Figur 3). Skörd från båda mesofas typerna illustrerades i denna artikel.
Skörd små kristaller från en lipidisk mesofas i plattor av glas sandwich är ett mödosamt process som kräver tid, skicklighet, expertisience, tålamod och en stadig hand. Det är viktigt att avsätta en lämplig tid för skörd och att inrätta laboratoriet så att alla förnödenheter och utrustning finns på plats i förväg. En andra person att hjälpa till med skörden är inte nödvändigt men rekommenderas. Denna person kan hjälpa till med att leverera i förväg markerade plattor till individen gör skörd samt placera kryo-kylda monterade slingor med skördade kristaller i lagring pucken. Assistenten kan också spela en viktig stödjande roll för att dokumentera synpunkter på kristallerna som gjorts under skörd som kan visa sig avgörande vid diffraktion datainsamling. I avsaknad av en assistent, skulle en röstaktiverad ljud-inspelningsenhet med fördel användas för dokumentation.
Efter det protokoll som beskrivs i denna artikel kommer att hjälpa att få Viewer igång med kristall skörd. Det är emellertid viktigt att inse att processen är inte okomplicerad och att practice behövs innan uppskjutning i skörd värdefulla kristaller membranprotein. Det rekommenderas därför att testa plattor med kristaller av proteiner som inte är särskilt värdefulla att experimenterat med först. Detta kommer att ge neofyten med värdefull erfarenhet inom skärande glas, ta bort glas skärvor, lyfta upp täckglas från över mesofasen med hjälp av polariserande funktionen på mikroskopet för att se kristaller och att spåra dem under skörd, och slutligen hantera olika typer av mesofaser och skörd av dem. Texturen av mesofas, och i förlängningen den lätthet med vilken kristaller kan skördas, kommer att förändras med tiden under kristallisation. Det är därför viktigt att öva skörd med mindre värdefulla kristaller men med dem som har vuxit under samma förhållanden som de mer värdefulla. Det är möjligt att odla kristaller av lysozym och taumatin av i meso eller lipidisk kubisk fas metod 28 och dessa bör beaktastas av sätt att få kännedom om material och metod. Man bör också överväga att arbeta med protein-fri mesofas först lära av sina nycker.
De förfaranden visade här var alla gjort på ett bekvämt 20 ° C eller däromkring. Det är möjligt att odla kristaller av den i meso metoden vid lägre temperaturer. Sålunda, kan monoolein som värd lipiden i ett metastabilt fastillstånd användas vid 4 ° C 1,2,29,30. Ett alternativ är att använda rationellt utformade 7,9 MAG för låg temperatur kristallisation 31. Vi låg temperatur crysallogenesis rutinmässigt med vissa mål membranprotein. I detta fall är kristalltillväxt och skörd sker i en walk-in 4 ° C kylskåp. Att arbeta under sådana förhållanden har sina egna utmaningar inte minst som är behovet av varma och bekväm klädsel.
Nästa steg i den övergripande processen för strukturbestämning med makromolekylära crystallography är att samla diffraktionsdata om kristaller skördas och snap-kyls såsom visas i den här artikeln. I meso-odlade kristaller är oftast små. Emellertid har användbar diffraktion datainsamling varit möjligt med kristaller med en maximal dimension av 20 pm 9. För detta ändamål är mikro-balk synkrotron röntgenstrålning används och är i fokus för en särskild JUPITER artikel i denna serie 32,33.
The authors have nothing to disclose.
Det finns många som har bidragit till detta arbete och de flesta är från Caffrey Membrane strukturell och funktionell biologi Group både tidigare och nuvarande medlemmar. Till alla, och särskilt Jingquan Tan och Joseph Lyons, förlänger vi vårt varma tack och uppskattning. Detta arbete stöddes delvis av anslag från vetenskapsrådet Irland (07/IN.1/B1836), National Institutes of Health (GM75915, P50GM073210 och U54GM094599) och FP7 COST och Marie Curie-åtgärder (CM0902 och PIEF-GA-2009 -235.612).
Name of reagent | Company | Catalogue number | Components |
Curved tweezers | Sigma | F4142 | Tool |
Disposable pipette tips | Gilson | Various | Disposable |
Foam dewar | Spearlab | FD-500 | Tool |
Glass and metal waste containers | Daniels Healthcare | DD479OL | Tool |
Harvesting loops | MiTeGen | Various | Tool |
Harvesting microscope | Nikon | SMZ1500 | Tool |
Lab notebook | Various | NA | Tool |
Magnetic push button sample loading wand | Hampton Research/Molecular Dimensions | HR4-729/MD7-411 | Tool |
Original Puck (for use with ALS-style robots only) | Crystal Positioning Systems | CP-111-035 | Tool |
Pipetting devices | Gilson | Various | Tool |
Precipitant solutions | Various | Various | Reagent |
Puck Bent Cryo-Tong | Crystal Positioning Systems | CP-111-030 | Tool |
Puck Shelved Shipping Cane (original ALS-style) with hooked handle and locking rod | Crystal Positioning Systems | CP-111-029 | Tool |
Purified water | Millipore | Reagent | |
Safety goggles | Various | NA | Tool |
Sample Pin Bases – Magnetic (non-copper) | Crystal Positioning Systems | CP-111-015 | Tool |
Shipping dewar | Taylor-wharton | CX100 | Tool |
Tissues | NA | NA | Disposable |
Tungsten-carbide glass cutter (TCT Scriber) | Silverline Tools (Yeovil, UK) | 633657 | Tool |