Her er beskrevet rutiner er implementert i Caffrey Membran strukturelle og funksjonelle biologi, for å høste og Cryo-cool membran protein krystaller vokst i lipidic kubikk og svamp faser for bruk i strukturbestemmelse hjelp macromolecular røntgenkrystallografi.
En viktig vei til hvordan proteiner fungere på en mekanistisk nivået er å ha strukturen av målproteinet tilgjengelig, ideelt på atom oppløsning. For tiden er det bare en måte å fange opp slik informasjon som brukes til integrerte membran proteiner (Figur 1), og de komplekser de danner, og at metoden er makromolekylær røntgenkrystallografi (MX). Å gjøre MX diffraksjon kvalitet krystaller for som, i tilfelle av membran proteiner, ikke danner lett. En metode for utkrystalliserer membran proteiner som innebærer bruk av lipidic mesophases, spesielt de kubikk og svamp faser 1-5, har fått betydelig oppmerksomhet i det siste på grunn av suksesser den har hatt i G protein-koblet reseptor feltet 6-21 ( www . mpdb.tcd.ie ). Imidlertid metoden, heretter referert til som i meso eller lipidic kubiske fase metoden, kommer med sin egen tekniskeutfordringer. Disse oppstår, delvis grunnet generelt viskøs og klebrig natur lipidic mesofase hvor krystaller, som ofte er mikro-krystaller, vokse. Manipulere krystallene blir vanskelig som et resultat, og spesielt så ved innhøstingen 22,23. Problemer oppstår også ved trinnet som går forut høsting som krever at glass sandwich-platene der krystallene vokser (figur 2) 24,25 åpnes for å eksponere mesofase bolus, og krystallene deri, for høsting, Cryo-kjøling og eventuell X -ray diffraksjon datainnsamling.
De kubikk og svamp mesofase varianter (figur 3) som krystaller må høstes har dypt forskjellige rheologies 4,26. Den kubiske fase er viskøs og klebrig beslektet til en tykk tannkrem. Derimot, er svamp fasen mer væske med en tydelig tendens til å flyte. Følgelig ulike tilnærminger for å åpne krystallisering brønner containing krystaller vokser i den kubiske og svampen fasen kalles for som faktisk forskjellige metoder kreves for høsting krystaller fra de to mesofase typer. Protokoller for å gjøre nettopp det har blitt raffinert og implementert i membranen strukturelle og funksjonelle Biologi (MS & FB) Gruppe, og er beskrevet i detalj i denne Jove artikkelen (figur 4). Det gis eksempler på situasjoner der krystaller er vellykket høstes og Cryo-avkjølt. Vi også gi eksempler på saker hvor det oppstå problemer som fører til uopprettelig tap av krystaller og beskrive hvordan disse problemene kan unngås. I denne artikkelen Viewer er utstyrt med steg-for-trinn-instruksjoner for å åpne glass sandwich-krystallisering brønner, for høsting og for Cryo-kjøling krystaller av membran proteiner som vokser i kubikk og i svamp faser.
I denne videoen artikkelen viste vi hvordan krystaller vokst i en lipidic mesofase er høstet og Cryo-avkjølt i forberedelse til bruk i diffraksjon datainnsamling og til slutt for strukturbestemmelse. Hosting mesofase kan være viskøs og klebrig kubiske fase eller mer flytende svamp fase 4. Hvordan glass sandwich-platene er åpnet og hvordan krystaller er høstet svært mye avhenger mesofase type. Det er derfor viktig å vite hvilke av de to til en arbeider med på forhånd. Identiteten av hosting lipid og fellingsmidlet brukes er viktig i denne sammenheng, og det fysiske utseendet av mesofase bolus i krystallisering brønnen kan brukes til å skille dem fra hverandre (figur 3). Høsting fra begge mesofase typene ble illustrert i denne artikkelen.
Høsting små krystaller fra en lipidic mesofase i glass sandwich-plater er en møysommelig prosess som krever tid, ferdigheter, kompetanseience, tålmodighet og en stødig hånd. Det er viktig å sette av en passende mengde tid for høsting og å sette opp laboratoriet slik at alle forsyninger og utstyr er for hånden på forhånd. En annen person til å hjelpe til med innhøstingen er ikke viktig, men anbefales. Denne personen kan hjelpe med å levere pre-merkede platene til den enkelte gjør innhøsting samt å plassere Cryo-avkjølte montert looper med høstes krystaller i lagringsposisjon pucken. Assistenten kan også spille en viktig støtte rolle i å dokumentere observasjoner om krystaller gjort under høsting som kan vise seg avgjørende i løpet diffraksjon datainnsamling. I fravær av en assistent, kan en stemme-aktivert lydopptaksfunksjonen enheten med fordel brukes for dokumentasjon.
Etter protokollen beskrevet i denne artikkelen vil bidra til å få Viewer opp og kjører med krystall høsting. Imidlertid er det viktig å forstå at prosessen er ikke enkelt, og at practice er nødvendig før du starter i høsting verdifulle membran protein krystaller. Det anbefales derfor at test plater med krystaller av proteiner som ikke er særlig verdifulle bli eksperimentert med første. Dette vil gi neophyte med verdifull erfaring i å kutte glass, fjerning av glasskår, løfte opp coverglass fra over mesofase, ved hjelp av polariserende funksjonen på mikroskop for å se krystaller og for å spore dem under høsting, og til slutt håndterer ulike typer mesophases og høsting fra dem. Teksturen i mesofase, og i forlengelsen av den enkle som krystaller kan høstes, forandrer seg med tiden under krystallisering. Det er derfor viktig å øve høsting med mindre verdifulle krystaller men med de som har vokst under de samme betingelser som de mer verdifulle de. Det er mulig å dyrke krystaller av lysozym og thaumatin ved in meso eller lipidic kubiske fase metode 28 og disse bør vurderesavfallsbeholder med måte å få kjennskap til materialer og metode. Man bør også vurdere å arbeide med protein-fri mesofase første til å lære av sine påfunn.
Prosedyrene Her demonstreres var alle gjøres på en komfortabel 20 ° C eller deromkring. Det er mulig å dyrke krystaller ved in meso metoden ved lavere temperaturer. Således kan monoolein som hosting lipid i en metastabil fase tilstand brukes ved 4 ° C 1,2,29,30. Et alternativ er å bruke rasjonelt utformet 7,9 MAG for lav temperatur krystallisering 31. Vi gjør lav temperatur crysallogenesis rutinemessig med visse membran protein mål. I dette tilfellet, blir krystallvekst og høsting gjort i en walk-in 4 ° C kjøleskap. Arbeider under slike forhold har sine egne utfordringer ikke minst som er behovet for varme og komfortable antrekk.
Det neste trinnet i den totale prosessen med strukturbestemmelse hjelp makromolekylære krystalltallography er å samle diffraksjon data på krystaller høstet og snap-avkjølt som demonstrert i denne artikkelen. I meso-vokst krystaller er vanligvis små. Imidlertid har nyttige diffraksjon datainnsamling vært mulig med krystaller som har en maksimal dimensjon på 20 um 9. For dette formålet, er mikro-bjelke synkrotron X-stråling brukes og er fokus for en egen Jove artikkel i denne serien 32,33.
The authors have nothing to disclose.
Det er mange som har bidratt til dette arbeidet, og de fleste er fra Caffrey Membran strukturelle og funksjonelle biologi Group, både tidligere og nåværende medlemmer. For alle, og spesielt til Jingquan Tan og Joseph Lyons, vi utvider våre varmeste takk og takknemlighet. Dette arbeidet ble støttet delvis av tilskudd fra Science Foundation Irland (07/IN.1/B1836), National Institutes of Health (GM75915, P50GM073210 og U54GM094599), og FP7 COST og Marie Curie Actions (CM0902 og PIEF-GA-2009 -235612).
Name of reagent | Company | Catalogue number | Components |
Curved tweezers | Sigma | F4142 | Tool |
Disposable pipette tips | Gilson | Various | Disposable |
Foam dewar | Spearlab | FD-500 | Tool |
Glass and metal waste containers | Daniels Healthcare | DD479OL | Tool |
Harvesting loops | MiTeGen | Various | Tool |
Harvesting microscope | Nikon | SMZ1500 | Tool |
Lab notebook | Various | NA | Tool |
Magnetic push button sample loading wand | Hampton Research/Molecular Dimensions | HR4-729/MD7-411 | Tool |
Original Puck (for use with ALS-style robots only) | Crystal Positioning Systems | CP-111-035 | Tool |
Pipetting devices | Gilson | Various | Tool |
Precipitant solutions | Various | Various | Reagent |
Puck Bent Cryo-Tong | Crystal Positioning Systems | CP-111-030 | Tool |
Puck Shelved Shipping Cane (original ALS-style) with hooked handle and locking rod | Crystal Positioning Systems | CP-111-029 | Tool |
Purified water | Millipore | Reagent | |
Safety goggles | Various | NA | Tool |
Sample Pin Bases – Magnetic (non-copper) | Crystal Positioning Systems | CP-111-015 | Tool |
Shipping dewar | Taylor-wharton | CX100 | Tool |
Tissues | NA | NA | Disposable |
Tungsten-carbide glass cutter (TCT Scriber) | Silverline Tools (Yeovil, UK) | 633657 | Tool |