وصفت وهناك تقنية لتحديد المواقع وقفة متعدية على مرنا. ويستند هذا الإجراء على عزل البروتينية وليدة تراكم على ريبوسوم في المختبر خلال ترجمة لمرنا هدف، يليه تحليل حجم السلاسل الوليدة باستخدام هلام إستشراد يبدل طبيعة المكونات.
معدل استطالة متعدية هي غير موحدة. مرنا هيكل الثانوي، واستخدام كودون ومرنا البروتينات المرتبطة بها قد تغير حركة الريبوسوم على رسالة للمراجعة انظر 1. ومع ذلك، وانه الآن من المتفق عليه على نطاق واسع أن استخدام مرادف كودون هو السبب الرئيسي للمنظمات غير موحدة معدلات استطالة متعدية 1. لا تستخدم الكودونات المترادفة مع تردد متطابقة. والتحيز موجود في استخدام الكودونات المترادفة مع بعض الكودونات المستخدمة بشكل متكرر أكثر من غيرها 2. كودون التحيز هو كائن حي، وكذلك الأنسجة محددة 2،3. وعلاوة على ذلك، وتواتر استخدام كودون يتناسب طرديا مع تركيزات tRNAs وما شابه ذلك 4. وبالتالي، فإن كودون المستخدمة بشكل متكرر وارتفاع عدد وافر من tRNAs المقابلة، وهو ما يعني كذلك أن ترجم كودون متكررة بشكل أسرع من واحد نادر. وبالتالي، سيكون مرنا في المناطق ثراء في كودونات نادر (مواقع وقفة المحتملة) كقاعدة تبطئ حركة الريبوسوم في المساءجنرال الكتريك وسبب تراكم الببتيد الوليدة من أحجام كل منها 5-8. هذه المواقع يمكن أن يكون لها تأثير وقفة وظيفي على تعبير البروتين، واستقرار مرنا وقابلة للطي البروتين للمراجعة انظر 9. في الواقع، تبين أن التخفيف من هذه المواقع وقفة يمكن أن يغير حركة الريبوسوم على مرنا، وبعد ذلك قد يؤثر على كفاءة المشارك متعدية طي البروتين (في الحي) 1،7،10،11. لفهم عملية طي البروتين في الجسم الحي، في الخلية، ويقترن ذلك في نهاية المطاف إلى عملية تخليق البروتين من الضروري أن تحصل على معلومات شاملة عن تأثير استخدام محتوى / الحمض الريبي النووي النقال كودون على حركة ريبوسوم على طول مرنا أثناء استطالة متعدية .
نحن هنا وصف تقنية بسيطة والتي يمكن استخدامها لتحديد المواقع الرئيسية وقفة ترجمة لمرنا نظرا تترجم في نظم خالية من الخلايا المختلفة 6-8. ويستند هذا الإجراء على العزلة من accumulati البروتينية الوليدةنانوغرام في ريبوسوم خلال الترجمة في المختبر لمرنا الهدف. الأساس المنطقي هو أن في التردد المنخفض كودونات، الزيادة في وقت الإقامة للنتائج ريبوسوم في زيادة كميات الببتيدات الوليدة من أحجام المقابلة. في المختبر مرنا المحولة يستخدم لردود الفعل في المختبر متعدية في وجود الأحماض الأمينية المسمى بالإشعاع للسماح للكشف عن السلاسل الوليدة. من أجل عزل متجهة الوليدة الريبوسوم المجمعات ببتيد والطبقات رد فعل الترجمة على رأس حل الجلسرين بنسبة 30٪ تليها الطرد المركزي. يتم التعامل مع مزيد من البروتينية الوليدة في بيليه polysomal مع ريبونوكلياز ألف وحلها بواسطة SDS PAGE. ويمكن هذه التقنية المستخدمة المحتمل لأي بروتين ويسمح تحليل حركة الريبوسوم على طول مرنا والكشف عن مواقع وقفة كبيرة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تكييف هذا البروتوكول لدراسة العوامل والظروف التي يمكن أن تغير حركة الريبوسوم، وبالتالي يحتمل أن يغير أيضا عشره وظيفة / التشكل من البروتين.
من أجل تحقيق النتائج استنساخه، ونوعية وتركيز المكونات المستخدمة في النسخ المختبر، وردود الفعل ترجمة حاسمة. في الدراسة الحالية فقد استخدمنا مجموعات المتاحة تجاريا والمقتطفات التي تقدم بيانات استنساخه للغاية، إذا ما تم تناوله بعناية. ومع ذلك، يمكن أن تكون ?…
The authors have nothing to disclose.
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل الإنسان الحدود برنامج منح العلوم RGP0024.
Name of reagent/ Kit | Company | Catalogue number |
MEGAscript T7 High yield Transcription Kit | Ambion | AM1333 |
Ribonuclease Inhibitor | Invitrogen | 15518012 |
Trans [35S]-Label | MP Biomedicals | 0151006 |
Ribonuclease-A | Invitrogen | 12091 |
Rabbit Reticulocyte Lysate System, Nuclease Treated | Promega | L4960 |
E. coli S30 Extract System for Linear Templates | Promega | L1030 |
Centrifugation | Beckman Coulter | Optima TLX Ultracentrifuge |
Storage phosphor autoradiography | GE Healthcare | Typhoon 9410 variable mode imager |
Software for nascent polypeptide analysis | GE Healthcare | Image Quant TL, v2005 |