הבידוד של הריבוזום פוליפפטידים המתהווה כרוכים<em> במבחנה</em> כדי לזהות אתרים השהה של תרגום לאורך ה-mRNA
Summary
טכניקה לזהות אתרים על הפסקה של תרגום ה-mRNA מתואר. הליך זה מבוסס על בידוד של פוליפפטידים המתהווה המצטברים על הריבוזומים במהלך בתרגום חוץ גופית של mRNA המטרה, ואחריו ניתוח בגודל של רשתות המתהווה באמצעות ג'ל אלקטרופורזה denaturing.
Abstract
קצב התארכות translational היא לא אחידה. mRNA מבנה משני, שימוש קודון ו-mRNA חלבונים הקשורים סילוף תנועת הריבוזום על הודעה של חוות דעת ראה 1. עם זאת, זה עתה מקובל כי השימוש קודון נרדף הוא הגורם העיקרי שאינם אחידים שיעורי התארכות של תרגום 1. קודונים נרדפים לא משמשים בתדירות זהה. ההטיה קיימת בשימוש קודונים נרדף כמה קודונים בשימוש בתדירות גבוהה יותר מאחרים 2. קודון ההטיה היא אורגניזם כמו גם רקמה ספציפית 2,3. יתר על כן, תדירות השימוש קודון עומד ביחס ישר ריכוזי tRNAs מאותו מקור 4. לפיכך, קודון שימוש תכוף יהיה רב יותר של tRNAs המתאימים, אשר נוסף מצביע על כך קודון תכופים יתורגם מהר יותר מאשר 1 נדירים. כך, אזורים על mRNA המועשר קודונים נדירים (אתרי להשהות פוטנציאליים) יהיה בדרך כלל להאט את תנועת הריבוזום על מסהGE ולגרום הצטברות של פפטידים המתהווה של גדלים בהתאמה 5-8. אתרים אלה יכולים להשהות השפעה תפקודית על ביטוי החלבון, יציבות ה-mRNA ו קיפול חלבונים לבדיקה לראות 9. אכן, הוכח כי הקלה של אתרי להשהות כאלה יכולים לשנות את תנועת הריבוזום על ה-mRNA, ובהמשך עשוי להשפיע על היעילות של קיפול (in vivo) שיתוף translational חלבון 1,7,10,11. כדי להבין את התהליך של קיפול חלבונים in vivo, בתא, כי הוא יחד בסופו של דבר לתהליך של סינתזה של חלבון זה חיוני כדי לקבל תובנות מקיפות אל ההשפעה של השימוש בתוכן / tRNA קודון על תנועת ריבוזומים לאורך ה-mRNA במהלך התארכות translational .
כאן אנו מתארים טכניקה פשוטה, שניתן להשתמש בהם כדי לאתר הגדולות להשהות תרגום אתרי ה-mRNA ניתן לתרגם בתא ללא מערכות שונות 6-8. הליך זה מבוסס על בידוד של המתהווה פוליפפטידים accumulating על הריבוזומים במהלך בתרגום חוץ גופית של mRNA המטרה. הרציונל הוא כי בתדירות נמוכה קודונים, עלייה בזמן מגוריו של תוצאות ריבוזומים בכמות מוגברת של פפטידים המתהווה של בגדלים המתאימים. ב-mRNA חוץ גופית עיבד משמש במבחנה תגובות של תרגום בנוכחות חומצות אמינו שכותרתו רדיואקטיבית כדי לאפשר זיהוי של רשתות המתהווה. כדי לבודד את הריבוזום מתחמי קשורות פוליפפטיד המתהווה התגובה התרגום שכבות על גבי פתרון גליצרול 30% ואחריו צנטריפוגה. פוליפפטידים המתהווה ב polysomal גלולה מטופלים נוספים עם ribonuclease והחליט על ידי SDS. טכניקה זו יכולה לשמש פוטנציאל של חלבון כל ומאפשר ניתוח של תנועת הריבוזום לאורך ה-mRNA לבין זיהוי האתרים להשהות הגדולות. בנוסף, פרוטוקול זה ניתן להתאים ללמוד גורמים ותנאים שיכולים לשנות תנועת הריבוזום ובכך באופן פוטנציאלי יכול גם לשנות את הדואר פונקציה / קונפורמציה של החלבון.
Protocol
Discussion
לקבלת תוצאות לשחזור, איכות ריכוז המרכיבים המשמשים ב שעתוק במבחנה תרגום התגובות הן קריטיות. במחקר הנוכחי השתמשנו ערכות זמינים מסחרית ותמציות המספקים נתונים לשחזור ביותר, אם מטופל בזהירות. עם זאת, תרגום, המוסמכות תמציות ניתן להכין מתא הבחירה של האדם, במידת הצ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה על ידי תוכנית מדע האדם Frontier מענק RGP0024.
Materials
| Name of reagent/ Kit | Company | Catalogue number |
| MEGAscript T7 High yield Transcription Kit | Ambion | AM1333 |
| Ribonuclease Inhibitor | Invitrogen | 15518012 |
| Trans [35S]-Label | MP Biomedicals | 0151006 |
| Ribonuclease-A | Invitrogen | 12091 |
| Rabbit Reticulocyte Lysate System, Nuclease Treated | Promega | L4960 |
| E. coli S30 Extract System for Linear Templates | Promega | L1030 |
| Centrifugation | Beckman Coulter | Optima TLX Ultracentrifuge |
| Storage phosphor autoradiography | GE Healthcare | Typhoon 9410 variable mode imager |
| Software for nascent polypeptide analysis | GE Healthcare | Image Quant TL, v2005 |
References
- Komar, A. A. A pause for thought along the co-translational folding pathway. Trends Biochem. Sci. 34, 16-24 (2009).
- Sharp, P. M., Cowe, E., Higgins, D. G., Shields, D. C. Codon usage patterns in Escherichia coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Drosophila melanogaster and Homo sapiens; a review of the considerable within-species diversity. Nucleic Acids Res. 16, 8207-8210 (1988).
- Dittmar, K. A., Goodenbour, J. M., Pan, T. Tissue-specific differences in human transfer RNA expression. PLoS Genet. 2, e221 (2006).
- Ikemura, T. Codon usage and tRNA content in unicellular and multicellular organisms. Mol. Biol. Evol. 2, 13-34 (1985).
- Wolin, S. L., Walter, P. Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA. EMBO J. 7, 3559-3569 (1998).
- Krasheninnikov, I. A., Komar, A. A., Adzhubei, I. A. Nonuniform size distribution of nascent globin peptides, evidence for pause localization sites, and a cotranslational protein-folding model. J. Protein Chem. 10, 445-454 (1991).
- Komar, A. A., Lesnik, T., Reiss, C. Synonymous codon substitutions affect ribosome traffic and protein folding during in vitro translation. FEBS Lett. 462, 387-391 (1999).
- Komar, A. A., Jaenicke, R. Kinetics of translation of γ B crystallin and its circularly permutated variant in an in vitro cell-free system: possible relations to codon distribution and protein folding. FEBS Lett. 376, 195-198 (1995).
- Jha, S., Komar, A. A. Birth, life and death of nascent polypeptide chains. Biotechnol. J. 6, 623-640 (2011).
- Thanaraj, T. A., Argos, P. Ribosome-mediated translational pause and protein domain organization. Protein Sci. 5, 1594-1612 (1996).
- Kimchi-Sarfaty, C., Oh, J. M., Kim, I. W., Sauna, Z. E. A “silent” polymorphism in the MDR1 gene changes substrate specificity. Science. 315, 525-528 (2007).
- Schägger, H., von Jagow, G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).
- Shirole, N., Balasubramanian, S., Yanofsky, C., Cruz-Vera, L. Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses. J. Vis. Exp. (48), e2498 (2011).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R. S., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324, 218-223 (2009).
