核糖体束缚新生多肽的分离<em>在体外</em>确定沿mRNA的翻译暂停网站
Summary
描述的一种技术，以确定mRNA的翻译暂停网站。本程序是基于对新生多肽在体外培养的靶mRNA的翻译，其次是使用变性凝胶电泳新生链的大小分析核糖体积累的隔离。
Abstract
翻译伸长率非均匀。 mRNA的二级结构，密码子的使用和mRNA的相关蛋白可能会改变核糖体的运动上的信息进行审查，见1。然而，它现在被广泛接受的同义密码子使用的非均匀平移伸长率的主要原因。同义密码子使用相同的频率。比其他2更频繁使用一些密码子的同义密码子的使用存在的偏见。密码子偏性是有机体以及组织特异性2,3。此外，密码子的使用频率是4同源tRNA的浓度成正比。因此，经常使用的密码子，将有相应的tRNA高出许多，这进一步意味着，频繁的密码子将被翻译速度比不经常。因此，将减缓地区稀有密码子（潜在暂停网站）丰富的mRNA作为一项规则上的信息核糖体运动GE和事业积累的新生肽5-8各自的大小。这些暂停的网站可以有功能的蛋白表达的影响， 审查的 mRNA稳定性和蛋白质折叠9。事实上，它表明，扶贫等暂停网站，可以改变的mRNA上的核糖体运动和随后可能会影响效率的翻译共同体内蛋白质折叠1,7,10,11。为了了解在体内的蛋白质折叠的过程中，在细胞中，蛋白质的合成过程，它必须获得全面的见解，在翻译延伸到沿mRNA的核糖体运动的影响密码子使用/ tRNA的内容最终加上。
在这里，我们描述一个简单的方法可以用来定位主要翻译为一个给定的mRNA翻译各种无细胞系统6-8暂停网站。这个程序是基于隔离accumulati新生多肽在体外的靶mRNA的翻译过程中核糖体纳克。理由是，在低频率的密码子，增加停留时间的增加相应大小的新生肽的核糖体结果。 在体外转录的mRNA存在放射性标记的氨基酸在体外翻译反应让新生链的检测。以孤立核糖体结合的新生多肽复合物的翻译反应顶端30％的甘油溶液离心分层。 polysomal颗粒新生多肽进一步用核糖核酸酶A和SDS-PAGE解决。这种技术可能可以被用于任何蛋白质，并允许沿mRNA的核糖体运动和检测的主要暂停网站分析。此外，该协议可以适应学习的因素和条件，可以改变核糖体的运动，从而可能还可以改变日é功能/蛋白质的构象。
Protocol
Discussion
对于重复性的结果， 体外转录和翻译反应中使用的组件的质量和浓度是关键。在目前的研究中，我们已经使用市售的包和提取物，提供高度可重复性的数据，如果小心处理。然而，翻译能力的提取物可准备从细胞的选择，如果需要的话。质量可以影响mRNA的翻译，所以它是最重要的测试之前使用它在体外翻译的mRNA的完整性。
此外， 在体外翻译反应的时间?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是由人类前沿科学计划授予RGP0024。
Materials
| Name of reagent/ Kit | Company | Catalogue number |
| MEGAscript T7 High yield Transcription Kit | Ambion | AM1333 |
| Ribonuclease Inhibitor | Invitrogen | 15518012 |
| Trans [35S]-Label | MP Biomedicals | 0151006 |
| Ribonuclease-A | Invitrogen | 12091 |
| Rabbit Reticulocyte Lysate System, Nuclease Treated | Promega | L4960 |
| E. coli S30 Extract System for Linear Templates | Promega | L1030 |
| Centrifugation | Beckman Coulter | Optima TLX Ultracentrifuge |
| Storage phosphor autoradiography | GE Healthcare | Typhoon 9410 variable mode imager |
| Software for nascent polypeptide analysis | GE Healthcare | Image Quant TL, v2005 |
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