Summary
Eine Technik zur translationalen Pause Sites auf mRNA zu identifizieren beschrieben wird. Dieses Verfahren beruht auf der Trennung entstehenden Polypeptide ansammeln auf Ribosomen während der in vitro Translation einer Ziel-mRNA, durch die Größe Analyse der naszierenden Ketten mit Hilfe eines denaturierenden Gelelektrophorese gefolgt basiert.
Abstract
Die Geschwindigkeit der Translationselongation ungleichmäßig ist. Sekundärstruktur der mRNA, mRNA-Codon-Nutzung und assoziierten Proteinen kann Ribosom Bewegung auf die Meldung zur Prüfung zu verändern siehe 1. Allerdings ist es nun weitgehend akzeptiert, dass ein Synonym Codonverwendung die primäre Ursache für ungleichmäßige Translationselongation Sätze 1 ist. Synonyme Codons sind nicht mit gleicher Frequenz verwendet. Eine Vorspannung besteht in der Verwendung von synonymen Codons mit Codons einigen häufiger als andere 2 verwendet. Codon-Bias ist Organismus als auch gewebespezifische 2,3. Darüber hinaus ist die Frequenz der Codonverwendung direkt proportional zu den Konzentrationen von verwandten tRNAs 4. Somit wird ein häufigsten verwendeten Codons höhere Vielzahl von entsprechenden tRNAs, die impliziert, dass ein häufiges Codon schneller als einem seltenen wird man übersetzt werden. So werden die Regionen auf mRNA in seltenen Codons (potentiellen Pause Sites) angereichert in der Regel langsamer Bewegung auf dem Ribosom MessaGE und Ursache entstehende Anhäufung von Peptiden der jeweiligen Größen 5-8. Diese Pause Standorte können funktionelle Auswirkungen auf die Protein-Expression haben, finden die mRNA-Stabilität und Faltung von Proteinen für die Überprüfung 9. Tatsächlich wurde gezeigt, dass eine Senkung der solche Pause-Seiten können Ribosom Bewegung auf mRNA verändern und anschließend kann die Effizienz der Co-translationale (in vivo) Proteinfaltung 1,7,10,11 beeinflussen. Um den Prozess der Proteinfaltung in vivo zu verstehen, in der Zelle, die letztlich auf den Prozess der Protein-Synthese ist es wichtig, umfassende Einblicke in die Auswirkungen der Codon-Nutzung / tRNA-Inhalte auf die Bewegung entlang der Ribosomen-mRNA gewinnen während Translationselongation gekoppelt .
Hier beschreiben wir eine einfache Technik, die zur großen Pause Übersetzung Standorte für eine bestimmte mRNA in verschiedenen zellfreien Systemen 6-8 übersetzt zu lokalisieren. Dieses Verfahren beruht auf der Trennung entstehenden Polypeptide accumulati Basisng an Ribosomen während der in vitro Translation eines Target-mRNA. Der Grund ist, dass bei niedrigen Frequenzen Codons, die Erhöhung der Verweilzeit der Ribosomen führt zu einer erhöhten Mengen von naszierendem Peptide der entsprechenden Größe. In-vitro-transkribierte mRNA wurde in vitro Translations-Reaktionen in Gegenwart von radioaktiv markierten Aminosäuren die Detektion der naszierenden Ketten zu ermöglichen. Um Ribosom gebundenen Komplexe entstehenden Polypeptid zu isolieren die Übersetzung Reaktion auf von 30% Glycerin-Lösung geschichtet, gefolgt von Zentrifugation. Nascent Polypeptide in polysomaler Pellets werden weiter mit Ribonuklease A behandelt und durch SDS-PAGE. Diese Technik kann für jedes Protein potentiell verwendet werden und ermöglicht die Analyse der Bewegung entlang Ribosom-mRNA und der Nachweis der größten Pause Seiten. Zusätzlich kann dieses Protokoll angepasst, um Faktoren und Bedingungen, die Ribosomen-Bewegung zu verändern und damit potentiell auch verändern th studieren werdene-Funktion / Konformation des Proteins.
Protocol
1. DNA-Schablone Herstellung und in vitro Transkription
- Das Gen von Interesse unter T7 und / oder zB SP6-Transkriptions-Promotor kloniert.
- Für in-vitro-Transkription der Matrizen-DNA mit einem geeigneten Restriktionsenzym-Schnittstellen stromabwärts des Stop-Codon ORF und / oder mRNA 3'-Ende linearisiert. Man braucht, um eine vollständige Linearisierung der Plasmid-DNA durch Ausführen des Restriktionsverdau Produkt auf Agarose-Gelelektrophorese überprüft.
- Das linearisierte Plasmid wird für die in vitro-Transkriptions-Reaktion verwendet. Verschiedene Konzentrationen der Ziel-DNA getestet, um eine optimale DNA-Konzentration für die in vitro Transkription erforderlich zu identifizieren. Im Allgemeinen mit MEGAscript Hohe Ambions Ertrag Transcription Kit (Ambion / Life Technologies, Grand Island, NY), ergibt 1 pg DNA linearisiert 40-60 pg mRNA. In-vitro-Transkription wird nach Herstellerangaben (Ambion / Life Technologies, Grand Islan getand, NY).
- Nach in vitro Transkription wird die mRNA durch Lithiumchlorid Niederschläge nach Herstellerangaben (Ambion die MEGAscript High Yield Transcription Kit) gereinigt.
- mRNA-Integrität wird weiterhin durch Elektrophorese auf Acrylamid oder Agarosegelen überprüft.
2. In vitro Zell Freie Übersetzung
Für in vitro Translation mit R abbit R eticulocyte Lysat, RRL (Promega, Madison, WI) die folgenden Schritte aus:
- Es werden 100 ul in vitro Translation Reaktion nach Herstellerangaben. Kurz gesagt, in Nuclease freies Wasser hinzufügen, 2 ul Aminosäurenmischung minus Methionin (1 mM), 10 Einheiten RNase-Inhibitor (Invitrogen / Life Technologies, Grand Island, NY), 20 uCi von radioaktivem [35 S]-Methionin (MP Biomedicals, Solon, OH), 70 ul Kaninchen-Retikulozytenlysat (Promega, Madison, WI).
- Inkubieren the Reaktion bei 30 ° C für 5 min auf die warme Reaktion Übersetzung voreingestellt. In 2 ug der mRNA an das Translations-Reaktion und Inkubieren bei 30 ° C für 5 min.
- Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie die Übersetzung Reaktion auf Eis.
3. Isolierung der entstehenden Polypeptide in vitro Translationsreaktion
- Um entstehenden Polypeptid gebunden an Ribosomen (Polysomen) zu isolieren, wird die Übersetzung Reaktion auf von 4,5 ml 30% Glycerin in 10 mM Tris-HCl-Puffer pH 7,6 geschichtet, enthaltend 100 mM KCl, 10 mM MgCl 2 und zentrifugiert bei 100.000 × g in einem TLA-110-Rotor (Beckman Coulter, Inc., Brea, CA) für 1 Stunde bei 4 ° C
- Der Überstand wird weiter vorsichtig entfernt.
- Die Polysomen Pellet, das entstehende Polypeptide ist in einem kleinen Volumen (10-15 ul) von 1 mM Tris-HCl-Puffer pH 7,6, resuspendiert, das 0,5 mg / ml Ribonuklease A (Invitrogen / Life Technologies, Grand Island, NY), und inkubiert 30 min bei 37 ° C Umdie Hydrolyse der Peptidyl-tRNA-Ester-Bindung zu erhöhen, wird NaOH auf eine Endkonzentration von 10 mM zugegeben und die Inkubation für weitere 30 min fortgesetzt.
In-vitro-Translation Reaktion zusammengebaut ohne mRNA und durchgeführt unter den gleichen Bedingungen (gefolgt von der Isolierung der entstehenden Peptide wie es beschrieben wurde) würde als große Kontrolle dienen. Die Behandlung der Übersetzung Reaktion (en) mit Puromycin vor den Extrakt einer Dichtegradientenzentrifugation kann als zusätzliche Kontrolle zu dienen.
4. Die Lösung der entstehenden Polypeptid auf Tris-Tricin SDS-PAGE
- Die isolierten naszierenden Polypeptiden werden aufgelöst und analysiert auf Tris-Tricin SDS-PAGE. Bitte beachten Sie, dass die Menge des Materials auf dem Gel wird abhängig von der Effizienz der Markierung von Proteinen, Protein-Effizienz auf Übersetzung des viele andere Parameter geladen. Die Menge des geladenen Materials sollte empirisch eingestellt werden, um die BES erlaubent-Visualisierung und Trennung einzelner naszierenden Polypeptidketten.
- Nach der Elektrophorese Gele fixiert sind, trocknet mit Vakuum-Gel Färber und einer Autoradiographie unterzogen. Die Verteilung der entstehenden Polypeptide werden beobachtet, wenn Phosphoimaging.
5. Repräsentative Ergebnisse
Rinder-gamma-B Crystallin wurde in Kaninchen-Retikulozytenlysat übersetzt und in E. coli S30-Extrakt Systems (Promega, Madison, WI), gefolgt von der Isolierung des naszierenden Polypeptidketten. Abbildung 1 zeigt die Schritte bei der Isolierung von Ribosomen gebundenen naszierenden Ketten beteiligt. In der vorliegenden Studie war das Ziel zu überprüfen, ob die Änderung der Umgebung der Übersetzung bedeutet Repertoire von tRNAs (bekanntlich wesentlich verschiedenen in Säugetierzellen (RRL) und prokaryotischen (E. coli)-Systeme aufgrund von Unterschieden in Codon Vorspannung zwischen der Organismen) kann verändern Ribosom Bewegung entlang mRNA bewirken und die Verteilung der Übersetzung Pause Sites.Altered Ribosom Bewegung sollte auf Veränderungen in der Verteilung der Größen der entstehenden Polypeptide akkumulieren während der Übersetzung sowie deren relative Intensitäten führen. Relative Intensitäten der Banden spiegeln die Dauer der Pause. Die entstehenden Polypeptide wurden isoliert und gelöst auf 16,5% T, 6% C Tris-Tricin SDS-PAGE (Abbildung 2). Gamma-B Crystallin ist ein 20 kDa Protein. Die Beobachtung des entstehenden Polypeptide von nicht identischen Längen und Intensitäten in RRL und E. coli-Systemen zeigt, dass die Bewegung entlang der Ribosomen-mRNA in diesen zwei Systeme unterschiedliche Übersetzung Kinetik folgt. Zum Beispiel beobachten wir eine prominente Bande von 17,7 kDa in E. coli-Lysat und nicht in RRL-System, was darauf hindeutet, dass es eine zusätzliche translatorische Pause-Stelle im 3'-Ende der mRNA Bereich (Codierung C-terminale Region von Gamma B Crystallin), wenn es in E. übersetzt coli-System. Wir weisen darauf hin, dass Gamma-B Crystallin Häfen Tandem-Arg-Codons (AGG 153 und AGA 154), die häufigsten sind in Säugetier-Systeme, sondern sind dafür bekannt, extrem selten und langsam übersetzt in E. coli. Ein Roman entstehenden Peptid, der sich in E. coli-System (~ 17,7 kDa Abbildung 2.2) wird wahrscheinlich durch Ribosomen-Pause bei diesen seltenen Codons Tandem verursacht. Bitte beachten Sie, dass keine Bänder in der Abwesenheit von mRNA (Abbildung 2.3) beobachtet werden kann und dass Puromycin Behandlung löscht die meisten der naszierenden Ketten von Polysomen (Abb. 2.3). Eine längere Behandlung mit Puromycin (> 15 min) entfernt alle naszierenden Ketten (Daten nicht gezeigt). Dies bestätigt, dass die beobachteten Polypeptidprodukte Ribosom assoziierten naszierenden Ketten, anstatt mRNPs cosedimenting mit Polysomen sind.
Wie oben erwähnt, ist Codon Bias Organismus als auch gewebespezifisch. Der Vertreter hier beschriebenen Beispiel zeigt deutlich, dass die Änderung der Umgebung der Übersetzung heißt Repertoire von tRNAs / CodonBias kann zu veränderten Bewegung des Ribosoms an der mRNA entlang führen. Offensichtlich kann diese einfache Technik ermöglichen nicht nur die Identifizierung der translationalen Pause Standorten entlang mRNA, sondern erlaubt auch eine schnelle Vergleich der Übersetzung Pause Standorten zwischen verschiedenen Systemen.
Abbildung 1. Schematische Erläuterung der Schritte zu isolieren Ribosom gebundenen naszierenden Polypeptide beteiligt sind. Rinder-gamma-B Crystallin ORF-Sequenz (528 Basenpaare) wurde stromabwärts des T7-Promotors kloniert in pBSKS +. Für in-vitro-Transkription der Matrizen-DNA wurde durch Behandlung mit EcoRI linearisiert. Linearisierte Template wurde für in vitro-Transkription verwendet. T7-Promotor in der DNA-Vorlage wird durch T7-RNA-Polymerase, die die stromabwärtigen Gamma-B Crystallin Gen transkribiert erkannt. mRNA wird unter Verwendung Lithiumchlorid Fällungsverfahren. Die gereinigte mRNA ist für in vitro-Translation verwendet. FolgendeInkubation Übersetzung Reaktion auf von 30% Glycerin-Lösung geschichtet und zentrifugiert für 1 Stunde bei 4 ° C bei 100.000 × g für Ribosom gebundenen naszierenden Polypeptide zu isolieren.
Abbildung 2. Isolierung von Rinder-gamma-B Crystallin naszierenden Polypeptiden in Kaninchen-Retikulozyten-Lysat (RRL) und E. übersetzt coli-Lysat. 2 pg mRNA wurde in 100 ul Reaktion mit RRL oder E. gemischt coli S30 Extract System (Promega, Madison, WI) nach Anleitung des Herstellers mit 20 Ci [35 S]-Methionin und bei 30 ° C für 5 min. Nach der Inkubation die Translationsreaktion wurde oben auf 4,5 ml 30% Glycerin in 10 mM Tris-HCl-Puffer pH 7,6 geschichtet, enthaltend 100 mM KCl, 10 mM MgCl 2 und zentrifugiert, für 1 Stunde bei 4 ° C und 100.000 × g in ein TLA-110 Rotor (Beckman Coulter, Inc., Brea, CA). Die isolierte polyribosome Pellet war resuspended in 20 ul von 1 mM Tris-HCl pH 7,6, enthaltend 0,5 mg / ml Ribonuklease A (Invitrogen / Life Technologies, Grand Island, NY) durch Behandlung mit NaOH (wie im Protokoll beschrieben) gefolgt. Nascent Polypeptide wurden auf 16,5% T, 6% C Tris-Tricin SDS-PAGE-Gel aufgetrennt. Das Gel wurde getrocknet und mit für die Autoradiographie. Nach der Belichtung wurde das Gel gescannt mit GE Healthcare Typhoon Imaging Scanner. Abbildung 2.1 zeigt das Gel mit naszierenden Polypeptiden isoliert und gelöst nach der Übersetzung Reaktionen in zwei verschiedenen Systemen (RRL und E. coli) durchgeführt. Abbildung 2.2 Das Gel wurde von Image Quant TL analysiert ., v2005 Software und hier als Beispiel zu zeigen, dass das Molekulargewicht und die Intensität der entstehenden Polypeptide, der sich in beiden Systemen problemlos analysiert werden können und im Vergleich benutzt Abbildung 2.3 zeigt zwei Gruppen von Steuerelementen: naszierenden Polypeptide isoliert und auf SDS-PAGE aufgelöst nach der Übersetzung Reaktionen wurden montiertohne Zugabe von mRNA und / oder nach der Übersetzung Reaktionen wurden mit Puromycin (5 min, Endkonzentration. 1 mM) behandelt, bevor die Umsetzung einer Zentrifugation unterworfen wurde.
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Discussion
Für reproduzierbare Ergebnisse, Qualität und Konzentration der Komponenten für die in vitro Transkription und Translation-Reaktionen verwendet kritisch sind. In der aktuellen Studie haben wir kommerziell verfügbaren Kits und Extrakte, die in hohem Maße reproduzierbar Daten zu liefern, bei sorgfältiger Behandlung eingesetzt. Jedoch kann die Übersetzung-zuständigen Extrakte aus der Zelle des eigenen Wahl hergestellt werden, wenn nötig. Qualität der mRNA kann die Translation beeinflussen, so ist es von größter Bedeutung, um die Integrität von mRNAs vor der Verwendung in in vitro-Translation zu testen.
Ferner weist die Dauer der in vitro Translation Reaktion für jedes einzelne Protein optimiert werden. Dies ist ein entscheidender Schritt zur Isolierung von naszierenden Polypeptiden. Erweiterte Inkubation führt zur Synthese des Proteins vollständiger Länge und die Freisetzung von der Mehrzahl der entstehenden Polypeptide aus den Ribosomen. Die Inkubationszeit kann durch Ausführen der in vitro Translation optimiert werden rTELLUNGNAHMEN mit unterschiedlichen Zeitpunkten. Sobald der minimale Zeitaufwand für die Übersetzung des gesamten Proteins erforderlich ist gegründet, ist nächste Schritt, um eine weitere Reihe von Experimenten rund um diese Zeitspanne zu tun und Identifizierung der Inkubationszeit, wo die meisten der entstehenden Polypeptide würde noch an das Ribosom (s gebunden sein ) (dh die Übertragung der Initiierung und Beendigung Verfahren wäre immer noch im Gleichgewicht). Die Übersetzung Reaktion kann auch durch Zusatz von Antibiotika, die Verhaftung Translationselongation (zB Cycloheximid) gestoppt werden. Es ist offensichtlich, dass diese experimentellen Systems könnte Auflösung und Analyse der wichtigsten Pause Stellen entlang mRNA und dem Auflösungsvermögen des Gel-System verwendet werden würde einen großen Einfluss auf die Qualität der Ergebnisse haben. Tricin-Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese um die Trennung von Proteinen im Bereich von 1 bis 100 kDa ist hervorragend für die Verwendung in diesen Arten von Experimenten 12 empfohlen. Es sollte angemerkt werden, dass diese Strategiekann auch auf die Analyse der Lage der Pause Seiten während der Protein-Expression in vivo (in Zellen) angepasst werden. Im letzteren Fall sollten insgesamt Polysomen Anteil von metabolisch markierten Zellen zunächst isoliert werden. Polysomen Übersetzen spezifischen mRNA von Interesse sollte dann durch Immunpräzipitation mit Anti-(Protein von Interesse) spezifische Antikörper und Analyse der markierten naszierenden Ketten zu tun, wie beschrieben isoliert werden. Es ist bevorzugt, Antikörper gegen N-terminalen Region des Proteins von Interesse gerichtet zu verwenden. Falls erforderlich, kann das interessierende Protein mit zB FLAG-Peptid markiert werden, um eine effiziente nach unten. Ein alternatives Protokoll auf selektive Isolierung des Übersetzens Ribosomen an ein Biotin-markierter mRNA bezogen wurde auch kürzlich 13 beschrieb. Es sei darauf hingewiesen, dass zur genaueren Bestimmung der Übersetzung Pause Seiten, insbesondere für große Proteine kann Micrococcus-Nuclease-Schutz-Assay 5 verwenden werden. Eine Modifikation ter später Assay, der auf dem tiefen Sequenzierung der Ribosomen-geschützten mRNA-Fragmente basiert und ermöglicht Untersuchung von Protein translatorische Dynamik auf der Genom-weite Ebene wurde auch 14 beschrieben.
Die einfache und sehr anpassungsfähig Technik in diesem Beitrag beschrieben kann zur Bewegung entlang der Ribosomen-mRNA zu folgen, zu identifizieren Übersetzung Pause Websites und auch Test-Faktoren und Bedingungen, die Bewegung während des Ribosoms Translationselongation kann zu verändern. Es kann möglicherweise zur Optimierung der co-translationalen Proteinfaltung in heterologen System (en) werden durch Einstellen der korrekten Positionen der großen Übersetzung Pause Seiten unter Verwendung synonymen Codon-Substitutionen verwendet.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom Human Frontier Science Program RGP0024 Zuschuss finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEGAscript T7 High yield Transcription Kit | Ambion | AM1333 | |
| Ribonuclease Inhibitor | Invitrogen | 15518012 | |
| Trans [35S]-Label | MP Biomedicals | 0151006 | |
| Ribonuclease-A | Invitrogen | 12091 | |
| Rabbit Reticulocyte Lysate System, Nuclease Treated | Promega | L4960 | |
| E. coli S30 Extract System for Linear Templates | Promega | L1030 | |
| Centrifugation | Beckman Coulter | Optima TLX Ultracentrifuge | |
| Storage phosphor autoradiography | GE Healthcare | Typhoon 9410 variable mode imager | |
| Software for nascent polypeptide analysis | GE Healthcare | Image Quant TL, v2005 |
References
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