MRNA üzerindeki translasyonel duraklama siteleri tanımlamak için bir teknik tarif edilmiştir. Bu prosedür bir denatüre jel elektroforez ile olgunlaşmamış zincirlerinin boyutu analizi ve ardından bir hedef mRNA in vitro için, içerisinde sırasında ribozom üzerinde biriken olgunlaşmamış polipeptidlerin izolasyonu dayanmaktadır.
Translasyonel uzama oranı non-üniform. ikincil yapı, kodon kullanım mRNA ve 1 görmek ilişkili proteinlerin inceleme için mesaj üzerinde ribozom hareketini değiştirebilir mRNA'ya. Ancak, günümüzde yaygın eşanlamlı kodon kullanımı düzgün olmayan translasyonal uzama oranları 1 birincil nedeni olduğu kabul edilmektedir. Eşanlamlıdır kodonlar aynı frekansı ile kullanılmaz. Bir önyargı diğerleri 2 daha sık kullanılan bazı kodonlar ile eşanlamlı kodon kullanımı var. Kodon önyargı organizma gibi 2,3 spesifik bir dokudur. Dahası, kodon kullanımına sıklığı soydaş tRNAs 4 konsantrasyonları ile doğrudan orantılıdır. Böylece, sık kullanılan bir kodon daha sık bir kodon hızlı bir seyrek bir daha tercüme edilecektir ima ilgili tRNAs yüksek sayıda sahip olacak. Böylece, nadir kodonlar (potansiyel duraklama siteleri) zenginleştirilmiş mRNA üzerindeki bölgelerde kural olarak Messa üzerinde ribozom hareketi yavaşlatacakilgili boyutları 5-8 doğmakta peptidlerin ge ve neden birikimi. Bu duraklama siteler protein ekspresyonu fonksiyonel etkisi olabilir, mRNA stabilitesi ve inceleme için protein katlanması 9'a bakın. Gerçekten de, bu tür duraklama siteleri hafifletilmesi mRNA üzerinde ribozom hareketi değiştirebilir ve daha sonra co-translasyon (in vivo) protein katlama 1,7,10,11 etkinliğini etkileyebilir olduğu gösterilmiştir. Sonuçta o translasyonel uzama sırasında mRNA boyunca ribozomların hareketine kodon kullanım / tRNA içerik etkisi içine kapsamlı bilgiler edinmek için gerekli olan protein sentezinin sürecine birleşen hücre, in vivo protein katlanması süreci anlamak için .
Burada çeşitli hücre içermeyen sistemlerde 6-8 tercüme belirli bir mRNA için büyük çevirisi duraklama yerleri bulmak için kullanılabilecek basit bir teknik açıklar. Bu prosedür, olgunlaşmamış polipeptidlerin accumulati izolasyonu dayanmaktadırbir hedef mRNA in vitro çeviri sırasında ribozomlar üzerinde ng. Mantığı düşük frekanslı kodonlar az, karşılık gelen boyutlarda olgunlaşmamış peptid artan miktarlarda ribozom sonuçların kalma süresi de artar. In vitro transkripsiyonu mRNA olarak radyoaktif olarak etiketlenmiş amino asitlerin varlığında in vitro translasyon reaksiyonlar için kullanılan olmasıdır doğmakta olan zincirlerinin algılanmasına izin vermek için. Ribozom bağlı olgunlaşmamış bir polipeptid kompleksleri izole etmek için, reaksiyon için santrifüjleme ardından% 30 gliserol çözeltisi üstüne katmanlı edilir. Polysomal pelet yılında Doğan polipeptidlerin daha ribonükleaz A ile tedavi edilen ve SDS PAGE ile çözümlenir. Bu teknik potansiyel olarak herhangi bir protein için kullanılan ve ribozom mRNA boyunca hareket ve büyük duraklama sitelerin tespiti analizi sağlar edilebilir. Ayrıca, bu protokol ribozom hareketi değiştirebilir ve böylece potansiyel olarak da inci değiştirebilir faktörleri ve koşulları incelemek için adapte edilebilire fonksiyon / proteinin konformasyon.
In vitro transkripsiyonu ve translasyon reaksiyonlarda kullanılan bileşenlerin tekrarlanabilir sonuçlar, kalite ve konsantrasyonu için kritiktir. Mevcut çalışmada dikkatli kullanılırsa, yüksek oranda tekrarlanabilir veri sağlamak ticari kitler ve özleri kullanmışlardır. Gerekirse Bununla birlikte, çeviri-yetkin özler, birinin tercih edilen hücre ile hazırlanabilir. MRNA Kalite çeviri etkileyebilir, bu nedenle in vitro çeviri sırasında kullanmadan önce mRNA'ların b?…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma İnsan Frontier Bilim Programı hibe RGP0024 tarafından finanse edildi.
Name of reagent/ Kit | Company | Catalogue number |
MEGAscript T7 High yield Transcription Kit | Ambion | AM1333 |
Ribonuclease Inhibitor | Invitrogen | 15518012 |
Trans [35S]-Label | MP Biomedicals | 0151006 |
Ribonuclease-A | Invitrogen | 12091 |
Rabbit Reticulocyte Lysate System, Nuclease Treated | Promega | L4960 |
E. coli S30 Extract System for Linear Templates | Promega | L1030 |
Centrifugation | Beckman Coulter | Optima TLX Ultracentrifuge |
Storage phosphor autoradiography | GE Healthcare | Typhoon 9410 variable mode imager |
Software for nascent polypeptide analysis | GE Healthcare | Image Quant TL, v2005 |