Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Функциональной визуализации бурого жира у мышей с ФДГ micro-PET/CT

doi: 10.3791/4060 Published: November 23, 2012

Summary

Метод функциональной визуализации мыши коричневой жировой ткани (BAT) описан в котором холодно-стимулированного поглощения 18F-фтордезоксиглюкозы (ФДГ) в НДТ является неинвазивным оценку со стандартизированным протоколом micro-PET/CT. Этот метод является надежным и чувствительным, чтобы обнаружить различия в BAT деятельности на мышах.

Abstract

Браун жировой ткани (BAT) отличается от белой жировой ткани (WAT) ее дискретным расположением и красно-коричневый цвет из-за богатой васкуляризации и высокую плотность митохондрий. BAT играет важную роль в энергетических затрат и не дрожать термогенеза у новорожденных млекопитающих, а также взрослые 1. BAT-опосредованной термогенез высоко регулируется симпатической нервной системы, преимущественно через β адренергических рецепторов, 2, 3. Недавние исследования показали, что BAT деятельности в человеческом взрослых отрицательно коррелирует с индексом массы тела (ИМТ) и другие параметры, диабетическая 4-6. BAT, таким образом, был предложен в качестве потенциальной мишенью для терапии anti-obesity/anti-diabetes упором на модуляции энергетического баланса 6-8. Хотя несколько холодных задача на основе позитронной эмиссионной томографии (ПЭТ) методы, установленные для обнаружения человека BAT 9-13, по существу, отсутствует стандартизированный протокол для работы с изображениями и quantification НИМ в небольших моделях животных, таких как мыши. Здесь мы опишем надежные ПЭТ / КТ изображений методом функциональной оценки BAT у мышей. Короче говоря, взрослый C57BL/6J мышей были холодные лечение в условиях голодания на продолжительность 4 часа, прежде чем они получили одну дозу 18 F-фтордезоксиглюкозы (ФДГ). Мышей остался в холодном еще на один час после инъекции ФДГ, а затем отсканированы с небольшим животным выделенных micro-PET/CT системы. Полученные изображения ПЭТ были совместно зарегистрированы в КТ-изображений для анатомических ссылки и анализировали на поглощение ФДГ в межлопаточной области BAT представить BAT деятельности. Этот стандартизированный холодной обработки и визуализации протокола было подтверждено путем тестирования деятельностью BAT во время фармакологических вмешательств, например, подавленное BAT активации лечение β-адренорецепторов пропранололом 14, 15, или расширенной активации BAT по β3 агонист BRL37344 16. Метод де-описанными здесь может быть применен для выявления наркотиков / соединений, которые модулируют активность BAT, или чтобы идентифицировать гены / путями, которые участвуют в BAT развития и регулирования в различных доклинические и фундаментальных исследований.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Подготовка животных и Лечение холодом

  1. Найдите и осмотрите 4 ° C холодную комнату, которая была одобрена для размещения лабораторных мышей.
  2. Предварительное охлаждение клеток для животных на ночь в холодной комнате. Клетки собирают без корма и подстилки, но с бутылкой воды.
  3. Утром в день эксперимента, место мышей по одному в каждой из предварительно охлажденных клетках каждые 30 мин. Каждый по отдельности клетке мыши должен оставаться в холодном помещении в течение почти 4 часа, прежде чем он транспортируется в лабораторию изображений. Убедитесь, что мыши поста, но с доступом к воде.
  4. В 4 ч после холодного транспорта лечение одного животного в то время, каждые 30 минут до изображениями Lab. Это может быть достигнуто путем заполнения контейнера пенополистирола со льдом и размещение предварительно охлажденные жилья клетки в верхней части льда внутри коробки. Свободно установите крышку на коробку из пенопласта.

2. Установка Micro-PET/CT изображений Workflow

  1. CT Приобретение: для компьютерной томографии всего тела, установить ток 500 мкА, напряжение на 80kV, время экспозиции при 200 мс и 240 шагов на 240 ° вращение. Для детектор рентгеновского излучения, выберите разрешение в "малом увеличении системе" с 78 мм осевое поле изображения и одиночный режим кровать. Выберите "реального времени реконструкции" с помощью "Общие Cone-Beam реконструкции" метод так, что хост-компьютер переговоры свыделенном реальном времени компьютерной реконструкции (Cobra), чтобы инициировать задачу.
  2. ПЭТ выбросов Приобретение: Set 600 секунд (10 минут) для "фиксированное время сканирования" в "приобрести по времени" вариант. Выберите F-18 как "исследование изотопов» и использовать 350-650 кэВ, как "уровень энергии".
  3. ПЭТ выбросов Гистограмма: Set "динамический кадр", как "черная" для обработки данных как один кадр в течение всего срока для достижения статического сканирования. Выберите "3D", как гистограмма типа и выберите "нет разброса коррекции".
  4. ПЭТ реконструкции: Используйте 2D заказанные Максимизация Subset Ожидание (OSEM2D), как реконструкция алгоритма.

3. Инъекции FDG

  1. Заказать клинических пакет из 18 F-ФДГ (10 мКи) из регионального поставщика для своего прибытия в лабораторию визуализации ~ 30 минут до запланированного первой инъекции. Следите безопасности института процедур для получения и обследовать пакет, содержащий радиоактивный материиLs (RAM).
  2. С защитой, предоставляемой L-блок столешницы щит, аликвоты ФДГ и сделать разведение стерилизованной физиологическим раствором. Разбавленной концентрации активности ФДГ должны быть доступны на 200-300 μCi/100 улица для каждой инъекции. Нарисуйте решение ФДГ в 1 мл шприц с 26G 1/2 дюйма иглы, и измерения радиоактивности всего шприц с дозой калибратора.
  3. Inject животное, которое просто переносится из холодного помещения (см. Шаг 1,4) с 100 мкл раствора ФДГ через внутрибрюшинно (IP) маршруту. Запись времени впрыска. Измерьте остаток радиоактивности шприц снова с дозой калибратора.
  4. Положить животное обратно в клетку холодную внутри холодильника пенополистирола поддерживается со льдом. Инкубируйте животных в холодном (~ 4 ° C) в течение 1 часа для поглощения FDG.
  5. Рассчитать впрыском деятельности ФДГ для каждой мыши по следующей формуле:
    Введенный деятельности (мкКи) = активность в шприце перед инъекцией- Деятельность в шприце после инъекции

4. Micro-PET/CT изображений

  1. Визуализации micro-PET/CT начинается через 1 час после введения ФДГ или 5 часов после холодной обработки. Положите животное в камеру вводного наркоза с 3% Isoflurane в кислороде.
  2. После анестезии индуцируется, животное перемещается на микро-CT гранул (животное кровать) с его голова покоилась в маске конус лица, которые непрерывно поставляет Isoflurane (2%) при расходе 2 л / мин. Электрическая грелка (Биовет, m2m изображений корпорация) находится под животным для поддержания температуры тела.
  3. Вставьте животного к входу в М.М. сканер, активировать "лазер" значок на панели инструментов, а также использовать сенсорную панель управления для перемещения кровати так, чтобы грудь животного на пересечении горизонтальных и вертикальных линий лазера. В "Лазерная Выравнивание" окне выберите "Первый тип сканирования", как КТ, и "PET приобретения включена в рабочий процесс", как Optioн.
  4. Откройте "Scout View" окно и приобрести разведчик вид рентгеновского снимка. Используйте IAW регулировать положение животного кровать так, чтобы центр поля зрения CT расположена в центре корпуса мыши (печень). Повторите этот шаг, если это необходимо.
  5. Начало "рабочий процесс", созданный в шаге 2. При варианты всплывают, выберите соответствующий 3D ПЭТ-КТ матрицы преобразования файлов, которые будут использоваться в КТ реконструкция, и выберите недавно созданный файл для нормализации ПЭТ реконструкции без ослабления коррекции. IAW затем начнет КТ и ПЭТ последовательно, как запрограммировано.
  6. После того, как весь рабочий процесс завершен, которое может занять 20-25 минут, кратко оценить качество приобретенных КТ и ПЭТ изображения с ASIPro В.М., микро-PET программного обеспечения для анализа совместно с установленной IAW. Архив визуализации данных на устройство хранения данных или передачи данных через сеть на пост станцию ​​анализа изображений (см. Шаг 5) для дальнейшего анализа.
  7. Releaсебе животное из системы визуализации и поместите его в чистую клетку корпуса с нормальной пищи и воды для ее восстановления при комнатной температуре. Системы готовы к следующему животных в очереди. Обратите внимание, заботу и обработки пост-изображений животных должны соблюдать правила института о "обработка лабораторных животных, которым вводили RAM". Также отметим, что использованные иглы / шприцы, впитывающие прокладки, перчатки, и все постельные принадлежности и фекалии должны рассматриваться как радиоактивные отходы, и обрабатывается в соответствии с институтом соответствующие правила утилизации отходов RAM распоряжении.

5. После анализа изображений

  1. Открытые исследования Inveon рабочем месте (IRW) программное обеспечение (Siemens) и вручную импортировать как КТ и ПЭТ наборов данных. Co-регистр КТ и ПЭТ изображений в "Регистрация" окна с помощью инструментов "Общий анализ" функции, и под "Обзор" окна убедитесь, что идеальное соответствие между КТ и ПЭТ фотографий во всех 3-х измерениях.
  2. От «области интереса (ROI) Количественная окна", с ссылками осуществляется совместно зарегистрированных КТ-изображений, определить BAT в межлопаточной области шеи, наиболее распространенных холодно-индуцируемых BAT у взрослых мышей, и рисовать объем процентных (ВОИ) НИМ над ПЭТ набор данных. Выберите "Voxel Intensity" как "Количественное Type" и запишите среднее радиоактивности в VOI как Бк / мл. Калибровочный коэффициент, который преобразует имп / сек Бк / мл была ранее создана путем сканирования призрак с известной радиоактивностью.
  3. ФДГ поглощения в BAT количественно как процент введенной дозы на грамм ткани (% ID / г) с распадом коррекции. Вводят внутривенно в дозе является результатом Шаг 3,5, однако, преобразуется в Беккерель (Бк) блок (1 мкКи = 37000 Бк), мы предполагаем, что 1 мл ткани равна 1 гр.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Пример micro-PET/CT изображений мышь BAT показано на рисунке 1. Хотя КТ предоставляет анатомической информации, изображений ПЭТ кодирует распределении и количестве 18 F-ФДГ поглощения по всему телу. Эти визуализации данных может рассматриваться отдельно (1А и 1В), плавленый (1C), или продемонстрировать с помощью функции 3D, такие как максимальная проекция интенсивности (MIP, 1D). С помощью инструмента 3D-визуализации, объем интерес (ВОИ), здесь межлопаточной области BAT (показаны стрелками на рисунке 1), обращается за ПЭТ-изображения и общее сигналов в VOI могут быть преобразованы в% ID / г, что составляет процент введенной дозы (% ID) на грамм ткани. У мышей продемонстрировали, FDG поглощения в BAT составляет 19% ID / г. Для того, чтобы проверить, если это холодное индукции и визуализации протокола достаточно чувствителен для обнаружения измененных деятельностью BAT, в любом случае до-регулирование или вниз-регулирование, мы использовали βадреноблокатор пропранолол, чтобы подавить BAT активации 15, и β3 агонист BRL37344 для повышения BAT индукции 16, соответственно. Эти фармакологические меры были применены в холодное время лечения и точнее, на 30 мин до введения ФДГ. ПЭТ / КТ (рис. 2A) и анализа (рис. 2В) показало, что пропранолол лечения значительно уменьшается поглощение ФДГ в BAT, в то время как BRL37344 заметно подняло поглощения, по сравнению с управления транспортным средством.

Рисунок 1
Рисунок 1. Micro-PET/CT изображений НДТ мыши после 5 часов холодным обращением. (A) корональной части изображения КТ. (B) корональных разделе ПЭТ-изображений совместно зарегистрированы с КТ «А». (C) плавленого ПЭТ / КТ изображений результатом наложения "A" и "B". (D) Максимальная интенсивность projectiна (MIP) презентации плавленого ПЭТ / КТ изображений. Желтые стрелки: область, соответствующая межлопаточной бурой жировой ткани.

Рисунок 2
Рисунок 2. Micro-PET/CT демонстрации BAT Изменение активности адренорецепторов наркотиков. (А) 18 F-ФДГ ПЭТ / КТ мышей, получавших различные препараты. а) PBS (контроль). б) Пропранолол (β антагониста, 5mg/kg, IP). Обратите внимание заметное снижение поглощения FDG в BAT области. в) BRL37344 (β3 агонист, 5mg/kg, IP). Обратите внимание значительное увеличение накопления ФДГ в BAT. Желтые стрелки: область, соответствующая межлопаточной бурой жировой ткани. (B) Количественный анализ поглощения FDG в BAT. Значения% ID / г (процент введенной дозы на грамм ткани) представлены (среднее ± SD). п = 10 для PBS группа, п = 5 для пропранолол и BRL37344 групп. * Р <0,05; **р <0,005 по сравнению с PBS группы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

В этом исследовании micro-PET/CT-based метод визуализации был разработан для обнаружения BAT деятельности у взрослых мышей, которые просто требуют лечения простуды и одной инъекции коммерчески доступные 18 F-ФДГ. Вся процедура может быть сделано в течение одного дня после обработки и визуализации последовательности, которая начинается каждые 30 минут, пока все животные лечатся и образ. В условиях эксперимента изложены в общей сложности 10 мышей (или 2 группы по 5 мышей) могут быть проверены в тот же день с помощью единой системы визуализации. Ограничение этого типа пропускная способность может быть снят, если 2 или более животных могут быть проверены одновременно по специально разработанной животных постели, как это было ранее сообщал 17. Для завершения исследования мы опираемся на использование комбинированной системы визуализации micro-PET/CT которая использует подробные анатомические информацию, представленную CT. Тем не менее, автономные микро-ПЭТ также в состоянии выполнить задачу, когда 57 Cо передаче сканирования добавляется в рабочий процесс до F18 приобретения данных о выбросах. 57 Данные Co передачи может быть использовано для ослабления коррекции при реконструкции изображений ПЭТ, а также может быть реконструирована для анатомической локализации.

Важным шагом этого протокола заключается в оптимизации длительности холодной обработки (например, 5 часов в данном исследовании). Короче продолжительность или ликвидации холода может привести к активности близок к фону и этот метод может быть нечувствительным к любым вниз регулирования BAT (пол-эффект). В отличие от удлиненного холодового воздействия (например, на ночь, или 24 часа) может максимально индукции и метод может стать насыщенным маскирует любые различия в до-регулирование BAT (эффект потолка). Оптимизированных условиях, описанных в этом протоколе были проверены через пропранолол подавления и β3 агонист BRL37344 тесты стимуляции (рис. 2

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Авторы хотели бы поблагодарить Лаура Диаз, Кевин Филлипс, Вилла А. Сюэ, и король С. Ли за их полезные комментарии и техническую поддержку в разработке этого метода.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Micro-PET/CT Imaging System Siemens Medical Solutions USA, Inc. Inveon Dedicated PET System and Inveon Multimodality CT/SPECT System (docked)
Propranolol Sigma P0884
BRL 37344 Sigma B169
18F-FDG Cyclotope Inc.
C57BL/6J Male Mice Jackson Laboratory 000664 3-4 months old

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cypess, A. M., Kahn, C. R. The role and importance of brown adipose tissue in energy homeostasis. Curr. Opin. Pediatr. 22, 478-484 (2010).
  2. Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiol. Rev. 84, 277-359 (2004).
  3. Collins, S., Surwit, R. S. The beta-adrenergic receptors and the control of adipose tissue metabolism and thermogenesis. Recent Prog. Horm. Res. 56, 309-328 (2001).
  4. Ouellet, V., et al. Outdoor temperature, age, sex, body mass index, and diabetic status determine the prevalence, mass, and glucose-uptake activity of 18F-FDG-detected BAT in humans. J. Clin. Endocrinol. Metab. 96, 1115-1125 (2011).
  5. Cypess, A. M. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. N. Engl. J. Med. 360, 1509-1517 (2009).
  6. Fruhbeck, G., Becerril, S., Sainz, N., Garrastachu, P., Garcia-Velloso, M. J. BAT: a new target for human obesity. Trends Pharmacol. Sci. 30, 387-396 (2009).
  7. Cypess, A. M., Kahn, C. R. Brown fat as a therapy for obesity and diabetes. Curr. Opin. Endocrinol. Diabetes Obes. 17, 143-149 (2010).
  8. Virtanen, K. A., et al. Functional brown adipose tissue in healthy adults. N. Engl. J. Med. 360, 1518-1525 (2009).
  9. van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in healthy men. N. Engl. J. Med. 360, 1500-1508 (2009).
  10. Cohade, C., Mourtzikos, K. A., Wahl, R. L. "USA-Fat": prevalence is related to ambient outdoor temperature-evaluation with 18F-FDG PET/CT. J. Nucl. Med. 44, 1267-1270 (2003).
  11. Garcia, C. A. Reduction of brown fat 2-deoxy-2-[F-18]fluoro-D-glucose uptake by controlling environmental temperature prior to positron emission tomography scan. Mol. Imaging Biol. 8, 24-29 (2006).
  12. Saito, M. High incidence of metabolically active brown adipose tissue in healthy adult humans: effects of cold exposure and adiposity. Diabetes. 58, 1526-1531 (2009).
  13. Agrawal, A., Nair, N., Baghel, N. S. A novel approach for reduction of brown fat uptake on FDG PET. Br. J. Radiol. 82, 626-631 (2009).
  14. Soderlund, V., Larsson, S. A., Jacobsson, H. Reduction of FDG uptake in brown adipose tissue in clinical patients by a single dose of propranolol. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. 34, 1018-1022 (2007).
  15. Zhao, J., Cannon, B., Nedergaard, J. Thermogenesis is beta3- but not beta1-adrenergically mediated in rat brown fat cells, even after cold acclimation. Am. J. Physiol. 275, 2002-2011 (1998).
  16. Rowland, D. J., Garbow, J. R., Laforest, R., Snyder, A. Z. Registration of [18F]FDG microPET and small-animal MRI. Nucl. Med. Biol. 32, 567-5672 (2005).
Функциональной визуализации бурого жира у мышей с ФДГ micro-PET/CT
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, X., Minze, L. J., Shi, Z. Z. Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT. J. Vis. Exp. (69), e4060, doi:10.3791/4060 (2012).More

Wang, X., Minze, L. J., Shi, Z. Z. Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT. J. Vis. Exp. (69), e4060, doi:10.3791/4060 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter