Summary
Un método de transferencia de genes en embriones de pollo en las etapas posteriores de incubación (de más de Hamburger y Hamilton etapa (HH) 22) se describe. Este método supera las desventajas de
Abstract
El embrión de pollo constituye un modelo excelente para estudiar la función génica y regulación durante el desarrollo embrionario. En la electroporación in ovo es un poderoso método para sobre-expresan genes exógenos o hacia abajo de regular los genes endógenos en vivo en 1 embriones de pollo. Las diferentes estructuras, tales como genes de ADN plásmidos que codifican 2-4, pequeños ARN de interferencia (siRNA), plásmidos 5, pequeña síntesis de ARN oligos 6, y los oligonucleótidos antisentido morpholino 7 puede ser fácilmente transfectadas en embriones de pollo por electroporación. Sin embargo, la aplicación de la electroporación in ovo en el se limita a los embriones en las fases iniciales de incubación (menor que en el estadio HH20 - de acuerdo a Hamburgo y Hamilton) 8 y hay algunas desventajas para su aplicación en los embriones en etapas posteriores (mayor que en el estadio HH22 - aproximadamente 3,5 días de desarrollo). Por ejemplo, la membrana vitelina en etapas posteriores es USUaliado pegado a la membrana debe y abrir una ventana en la cáscara provoca la ruptura de los vasos, lo que resulta en la muerte de los embriones; los embriones más viejos están cubiertos por los buques vitelino y alantoideo, donde es difícil acceder y manipular los embriones; los embriones más viejos se mueven vigorosamente y es difícil de controlar la orientación a través de una ventana relativamente pequeña en la cáscara.
En este protocolo se demuestra un método de electroporación in ovo ex de transferencia de genes en embriones de pollo en las etapas finales (más que en el estadio HH22). Para la electroporación in ovo ex, los embriones se cultivaron en placas de Petri de 9 y el vitelino y los vasos alantoideo se extendió ampliamente. Bajo estas condiciones, los embriones de pollo mayores son fácilmente accesibles y manipulado. Por lo tanto, este método supera las desventajas de electroporación in ovo en aplicar a los embriones de pollo mayores. Usando este método, los plásmidos pueden ser fácilmente transfectadas en diferentes partesde los embriones de pollo mayores 10-12.
Protocol
1. Ex ovo Cultura
- Frescos los huevos fertilizados se colocan a su lado mucho tiempo en una incubadora de tiro forzado (BSS160, Ehret, Alemania) a 37,5 ° C con 60% de humedad para la incubación. Los huevos almacenados a 12 ° C durante más de una semana no debe ser utilizado.
- Después de la incubación durante 2,5 días (cerca de la etapa HH17), sacar los huevos y la etiqueta de la parte superior con un lápiz para indicar la dirección para la formación de grietas.
- Antes de craqueo, se vierte sobre 20 ml de agua destilada estéril en un plato limpio grande de Petri (diámetro de 145 mm; Greiner Bio-One GmbH, Alemania).
- Coloque otro plato pequeño estéril de Petri (diámetro de 94 mm; Greiner Bio-One GmbH) en la gran placa de Petri.
- Romper los huevos en la parte inferior contra un borde de metal afilado, abra con cuidado los huevos y transferir todo el contenido de cada huevo en la pequeña placa de Petri.
- Cubrir la gran placa de Petri con una tapa y ponerlo en otra incubadora (BINDER GmbH, Tuttlinge, Alemania)para el cultivo adicional a 37,5 ° C con una humedad del 60%. Después de la incubación para el número deseado de días, los embriones se pueden utilizar para la electroporación.
2. Preparación para la electroporación in ovo ex
- Tire de capilares de vidrio con un extractor de microelectrodos (PUL-100 Micropipeta extractor, World Precision Instruments, Berlín, Alemania), utilizando tubos de vidrio de 1,0 mm de diámetro (TW100F-4, World Precision Instruments) y romper la punta de los capilares de vidrio en un caso diámetro.
- Establecer los parámetros adecuados (es decir, diferentes voltajes de los distintos tejidos y el tamaño de los embriones) para la electroporación y conectar los electrodos a una electroporador (CUY21-Edit; Nepa Gene, Chiba, Japón) de acuerdo con los tejidos diana y el tamaño de los embriones.
- Preparar una solución plásmido que contiene plásmidos en vectores pCAGGS que codifican un gen diana, por ejemplo, cadherin7 (Cad7; pCAGGS-Cad7 con una concentración de 2,0 g / l) y un gen marcador,por ejemplo, proteína fluorescente verde (GFP; pCAGGS-GFP con una concentración de 0,25 mg / l). Publique Fast Green con una concentración final de 0,1% (Sigma) para etiquetar la solución del plásmido con el color verde.
- Cargar el capilar de vidrio con la solución del plásmido utilizando una pipeta de boca.
3. Transferencia de genes en Tectum óptico de pollo por electroporación in ovo ex
- Después de un cultivo in ovo ex, por ejemplo, por día de incubación (E) 6, los embriones de pollo se utilizan para la electroporación in ovo ex.
- Corte con cuidado las membranas vitelinas y el amnios sobre el techo óptico con unas pinzas finas y añadir 3 gotas de solución estéril de cloruro sódico al 0,9% en la superficie de la tectum.
- Se inyecta la solución del plásmido en la cavidad de la tectum por capilar de vidrio con la pipeta boca.
- Coloque los electrodos con una aguja de tungsteno cátodo y un ánodo placa rectángulo (CUY 661-3x7, Nepa Gene) al lado del tectum, yinmediatamente aplicar impulsos eléctricos (seis pulsos, 25 V, 60 ms de longitud, 100 intervalos de pulso ms en cada caso) producidos por la electroporador al tectum.
- Cubrir la gran placa de Petri con la tapa y devolverlo en el incubador. Después de incubar durante días apropiados (por ejemplo, 2 o 3 días después de la electroporación), el tectum se recogen y se fija por inmunotinción (Figura 1) y la detección biológica.
4. Los resultados representativos
Sobreexpresión con éxito de las proteínas exógenas de Cad7 y GFP mediante electroporación in ovo ex se muestra en la Figura 1 como un ejemplo. Cuando Cad7 junto con el plásmido GFP plásmido se electroporated en el tectum en E6, dos o tres días después de la electroporación los embriones fueron recolectados y fijados. En E8, la proteína GFP se expresa fuertemente en el tectum en todo el montaje de imágenes (Figura 1A-C). Además, en las secciones de la tectum en E9,Proteína GFP (verde en la Figura 1D) y Cad7 proteínas (rojo en la figura 1E) se coexpresan (amarillo en la figura 1F), lo que sugiere que la electroporación in ovo ex es un método exitoso para la transferencia de genes en los embriones de pollo mayores en vivo.
Figura 1. Cuando la codificación plásmidos GFP y Cad7 se cotransfectaron en el tectum pollo en E6, dos o tres días después de la electroporación in ovo ex, proteína GFP (verde) está fuertemente expresado como se muestra en las imágenes wholemount (CA) a E8. En las secciones de la tectum en E9, proteína GFP (verde en D) y Cad7 proteína (rojo en E) se coexpresan (amarillo en F). BF, la imagen de campo claro. Barra de escala: 200 m en A con el AC; 100 micras en D para DF.
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Discussion
Este protocolo proporciona una guía para la transferencia de genes en embriones de pollo mayores (por ejemplo, en el techo óptico en E6) mediante electroporación in ovo ex. Este método se extiende el uso de electroporación para embriones de pollo mayores y puede ser fácilmente aplicado a muchos laboratorios para estudiar la función génica in vivo en etapas posteriores. Los embriones de E4 a menos E7 puede ser satisfactoriamente electroporación por este método y los embriones electroporated puede ser la supervivencia hasta E15 11. Además del cerebro, este método puede también ser utilizado para la transferencia de genes en el sistema de pollo extremidad 11.
Se debe prestar especial atención a la electroporación in ovo ex. Por ejemplo, con el fin de obtener una alta supervivencia de los embriones por cultivo in ovo ex, huevos utilizados deben ser frescos y se almacena a menos de una semana a 12 ° C; las pequeñas placas de Petri debe ser estéril y huevo agrietamiento realiza en torno a e2.5. Para la electroporación in ovo ex, eltamaño y la colocación de los electrodos deben estar correctamente elegido de acuerdo a la etapa y la parte específica de los embriones. Cuando dos plásmidos se cotransfectaron, los plásmidos inyectados debe estar en una relación apropiada de la concentración (por ejemplo, 1:8 entre el gen GFP marcador y el gen específico) con el fin de estar seguro de que las células GFP marcados son casi coexpresan el gen diana.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por una beca de la Fundación Alemana de Investigación (DFG; LU1455/1-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Electroporator | Nepa Gene, Japan | CUY21-Edit | |
| Electrodes | Nepa Gene, Japan | CUY661-3x7 | |
| Egg incubator | Ehret, Germany | BSS160 | |
| Embryo incubator | BINDER GmbH, Germany | ||
| Fluorescent microscope | Keyence, Deutschland GmbH | BZ-8000 | |
| Petri dish | Greiner Bio-One GmbH, Germany | ||
| Micr–lectrode puller | World Precision Instruments, Germany | PUL-100 |
References
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