Summary
Biz doğru ve yanlış protein-protein etkileşimleri ayırmak için önce tanıtıldı HIZLI (Nakavt ile birlikte kantitatif immünopresipitasyon) yaklaşımın bir çeşitleme sunuyor. Bizim yaklaşıma dayanmaktadır
Abstract
Protein-protein etkileşimleri hücrede birçok biyolojik süreçleri için temel vardır. Bu nedenle, karakterizasyonu araştırmalarını 1 mevcut olduğu için yöntemler mevcut araştırma ve bir bolluk önemli bir rol oynar. Protein-protein etkileşimleri genellikle son derece dinamik ve hücre içi lokalizasyonu, translasyon sonrası modifikasyonlar ve yerel proteini çevreye 2 bağlı olabilir. Bu nedenle, co-immünopresipitasyon yaklaşımlar tercih 3 yöntemi olduğu için, doğal ortamda araştırılması gerekmektedir. Co-Çökelen etkileşim ortakları bir hedeflenmemiş bir şekilde hedefe yönelik bir yaklaşım içinde, ya da kütle spektrofotometresi (LC-MS/MS) ile immünoblot yoluyla tespit edilir. Bu ikinci strateji genellikle olumsuz özellikle güvenli bir unspecifically tetikleyici proteinlerin izlerini tespit çağdaş kütle spektrometre ve yüksek hassasiyet elde edilen sahte pozitif buluşları, çok sayıda tarafından etkilenir. Bir recenBu sorunun üstesinden gelmek için t yaklaşım fikrine dayanır unspecifically tetikleyici protein miktarları etkilenmemiş olması gerekir, belli etkileşim ortak düşük miktarda hücresel konsantrasyon RNAi ile azaltılır, belirli bir hedef proteini ile ortak bir çökelti kalmayacaktır. Bu yaklaşım, Nakavt 4 ile birlikte kantitatif immünopresipitasyon QUICK adlandırılan yabani tip ve knock-down suşları immunoprecipitated protein miktarları ölçmek için Kararlı İzotop Hücre kültüründe Amino asitlerin Etiketleme (SILAC) 5 ve MS kullanır. 1:1 oranında bulunan kirletici proteinler, hedef proteinin özel etkileşim ortağı olarak yabani tip çökelti içinde zenginleştirilmiş olan olarak kabul edilebilir. Yenilikçi, HIZLI bazı kısıtlamalar taşır rağmen: İlk, SILAC maliyet-yoğun ve ideal arjinin ve / veya lizin için okzotrofik olan organizmalar için sınırlıdır. Addit Bunun yanında, arginin, ağır besleme durumunda, arginin-to-prolin interconversion sonuçional kitlesel bir peptid her prolin için vardiya ve biraz miktar daha sıkıcı ve 5,6 daha az hassas hale ışık arginin, ağır sulandırır. İkincisi, HIZLI antikorlar onlar knock-down mutantlar özler hedef proteini ile doymuş hale gelmez böyle titre gerektirir.
Burada 15 N metabolik etiketleme için SILAC değiştirerek ve protein-protein etkileşimleri afinite modülasyonu için RNAi-aracılı knock-down değiştirerek HIZLI ve yukarıda belirtilen sınırlamaları aşan bir modifiye HIZLI protokol tanıtmak. Biz tek hücreli yeşil alg Chlamydomonas model organizma ve hedef protein 7 (Şekil 1) olarak kloroplast HSP70B eşlikçi olarak reinhardtii kullanarak bu protokolün uygulanabilirliğini göstermek. HSP70s özel ko-şaperonlar ve sadece ADP durum 8 yüzeyler ile etkileşim bilinmektedir. Bu özel kontrol etmek için bir araç olarak bu özellik faydalanmakonun nükleotid değişimi faktörü CGE1 9 ile HSP70B etkileşimi.
Protocol
1. Antikor Adsorpsiyon
- Protein, 15 ml konik tüpe (FALCON) içinde A Sepharose 120 mg tartılır. A Sepharose her bir immünopresipitasyon (IP) için gerekli olan 15 mg protein olarak bu miktar 8 IP için yeterlidir. 5 ml 0.1 M fosfat tampon maddesi (pH 7.4) eklenir ve protein 4 ° C'de 30 dakika süreyle A Sepharose kabarma izin
(Bu noktadan itibaren tüm adımları protein yıkımı karmaşık / ayrışma önlemek için keratin ve buz üzerinde kontaminasyonu önlemek için eldiven ile yapılması gerektiğini unutmayın.)
- 1.000 xg ve 4 pelet ° C şişmiş Protein A Sepharose az 60 saniye santrifüjleyin. Süpernatan dikkatle çıkartın ve 5 ml 0.1 M fosfat tampon maddesi (pH 7.4) içinde tekrar süspansiyon boncuklar. Iyice boncuk yıkamak için bu adımı üç kez tekrarlayın.
- Son santrifüj aşamasından sonra, fosfat tamponu yaklaşık 0.5 ml süpernatant kaldırmak ve bırakın. 0.9 ml 0.5 M fosfat tampon maddesi (pH 7.4), 400 eklemebenzeşme ul hedef protein (burada HSP70B) ve bir kontrol proteini (burada CF1β) karşı 16 ul karşı antikorlar (IP başına 50 ul) primer antikorlar saflaştırılmıştır. 5 ml'lik bir toplam hacme GKD 2 O ile doldurun.
(Afiniteyle saflaştırılmış antikorlar nano-LC-MS analizi engelleyebilir belirsiz IgG antikorları tarafından kirlenmeyi azaltmak için kullanılması gerektiğini unutmayın -.. Protokol CF1β bir yükleme kontrol olarak çöktürülür ve seçildi Willmund ark (2005) 10 görmek için o bol olduğu ve bu nedenle, hücre parçalama sonra, çözünür ve membran fraksiyonları da sunulmaktadır. Alternatif olarak, kirletici protein düzeyleri eşit olmayan yüklenmesi için normalize etmek için de kullanılabilir.)
- Bir tüp silindir (CAT RM5W, 36 rpm) 25 ° C sıcaklıkta 1 saat inkübasyonu sırasında Protein adsorbe IgG antikorları A Sepharose boncuk izin verin.
- 1.000 xg ve 4 pelet ° C Protein A Sepharose boncuklar az 60 saniye santrifüjleyin. Dikkatlice süpernatant ve r çıkarın5 ml 0.1 M sodyum borat tampon maddesi (pH 9.0) içinde boncuklar esuspend. Bu adım iyice çaprazbaglayıcı söndürebilir aminler kaldırmak için üç kez tekrarlayın.
- 25.9 mg tartılır, taze, katı dimethylpimelimidate ve 20 mM nihai konsantrasyon elde etmek için 5 ml 0.1 M sodyum borat tampon maddesi (pH 9.0) içinde tekrar süspansiyon haline getirin. Protein A Sepharose boncuklar bu çözüm ekleyin.
- IgG antikorları çapraz bağlantı için bir tüp silindir üzerinde 25 ° C'de 30 dakika için Protein A bekleyin.
- 1,000 x g'de ve 4 ° C'de pellet boncukları, 60 saniye için santrifüjleyin. Dikkatlice süpernatant kaldırmak ve 5 ml 1 M Tris-HCl (pH 7.5) serbest çapraz bağlayıcı gidermek için boncuk tekrar süspansiyon. Bir kere bu adımda tekrar edin ve 25 de 2 saat inkübe, 4 ° C ya da 12-24 ° C'de bir saat tüp silindiri üzerindeki.
- İsteğe bağlı: IgG antikorları ile birleştiğinde bir Sepharose boncuk doğrudan bir haftaya kadar IP depolama için kullanılmaz Protein mümkündür. Bunun için, 1.000 xg ve 4 de 60 saniye santrifüj ° C pelet boncuk, dikkatle supern çıkarın4 de% 0.02 sodyum azid ve depo ihtiva eden 5 ml 0.1 M fosfat tampon içinde tekrar süspansiyon ve atant boncuklar (pH 7.5) ° C kadar daha fazla kullanımı.
2. Hücre Lizis, Crosslinking ve Numune Hazırlama
- 7.5 mM ihtiva eden ortam içinde iki Chlamydomonas kültür büyümek 14 NH4CI veya 15 NH ~ 5 x 10 6 hücre / ml 'lik bir yoğunluğa azot kaynağı olarak 4 Cl. Hücreler tam etiketleme için en az on nesiller geçmesi gerekir. Burada hücreler beyaz ışık ile sürekli ışınlama (30 μE m -2 s -1) altında 25 bir rotatory çalkalayıcı ° C TAP orta 11 photomixotrophically yetiştirilmiştir.
- 4,000 x g'de ve 4 ° C'de (her bir kısım için hasat edilen hücre sayısı hedef hücre konsantrasyonuna bağlıdır bir 4-dakika santrifüjleme ile dört GSA tüpleri ve hücreler hasat iki kısım 14, her bir K-15 ve K-işaretli hücrelerin aktarma Protein ve e tespit edilmesi gerekmektedirmpirically sağlamak için önceden yeterli hedef protein çöktürülür. İyi bir başlangıç noktası tablet başına 10 9 hücrelerinin, yani, 5 x 10 6 hücre / ml olan bir kültürün 200 ml.)
Çapraz bağlama için yalnızca: protein kompleksleri önceden ip için, çapraz bağlı olacaktır durumunda, hücreler ortam içinde mevcut amin uzaklaştırmak için yıkanmasına gerek. Bunun için, tekrar süspansiyon 40 ml önceden soğutulmuş tampon KH hücreler (20 mM Hepes-KOH (pH 7.2), 80 mM KCl) ve 50 ml Falcon tüpleri aktarın. 1,000 x g'de ve 4 ° C sıcaklıkta 60 sn için santrifüje Bir kez bu adımı yineleyin. - 2 ml lizis tamponu içinde yeniden süspanse hücreler (20 mM Hepes-KOH (pH 7.2), 1 mM MgCl2, 10 mM KCI, 154 mM NaCl) 4 ile önceden ° C sıcaklığa soğutuldu ve 15 ml Falcon tüpleri aktarın. Ek 1 ml Lizis tampon her ile GSA tüpler kalan hücreleri toplamak. Her bir tablet için 50 ul 25 x proteaz inhibitörü ve 12.5 ul 1 M MgCl2 (3.5 mM, nihai konsantrasyon) ilave edilir.
- 150 ekleul lizis tamponu, 12.5 ul 1 M ATP, biri 833 ul 270 mM kreatin fosfat, 7 ul 5 mg / ml 'den kreatin fosfokinaz (nihai konsantrasyon ATP, 45 mM kreatin fosfat, ve 7 mg / mL kreatin fosfokinaz 2.5 mM) 14 ve 15 N-N-etiketli hücreler (bu + ATP alikotları olan) içeren alikotları.
- 14 ve 15 N-N-etiketli hücreler (bu-ATP çözeltisi kısmı olan) içeren bir başka alikot ile 930 ul lizis tamponu ve 70 ul, 1 U / ml 'apyrase ekleyin.
- ATP-tüketen ve ATP-dopdolu devletler kurmak için bir tüp silindir üzerinde 25 2 dk ° C'de inkübe edin. Çapraz bağlama aşaması atlanmıştır ise, lizis tamponu başka bir 1 ml eklenir.
Çapraz için sadece: araştırıldı protein-protein etkileşimleri geçicidir durumda bir çapraz adım onları yakalamak için tavsiye edilir. Bunun için, e DMSO içinde çözülmüş 500 ul 20 mM ditio-bis (sukkinimidil propiyonat) (DSP) (nihai konsantrasyon 2 mM) ekleyindoğrudan sonication önce ach tüpü. - Soğutma arasında 20 sn sonları ile hücreleri kırmak için buz üzerinde dört kez 20 sn sonikasyon. (Biz% 75 ve% 60 görev döngüsü çıkış kontrolü bir KE76 ucuyla Bandelin Sonoplus HD2070 kullanabilirsiniz. Diğer makineleri / cihazları / ipuçları için gerekli ayarları tam bir hücre lizis sağlamak ve dökülmesini önlemek için önceden tespit edilmesi gerekmektedir. )
Çapraz bağlama için yalnızca: 4, 1 saat boyunca kuluçkaya ° C'de bir tüp silindiri üzerindeki protein komplekslerinin çapraz-bağlantı sağlar. Crosslinking sonra ° C serbest çaprazbaglayıcı gidermek için 4 azından bir 15 dakika için bir tüp silindir üzerinde 500 ul 1 M glisin ve inkübe her tüp tamamlayabilir. - SW41 Ti İnce borular (Yok Beckman Coulter Ürün: 344059) dört 6-ml sükroz minderler (20 mM HEPES-KOH (pH 7.2), 0.6 M sukroz) hazırlayın, dikkatli yatıyordu tüm ~ sukroz üzerine hücre lizatları 5.5 ml minderler (Lizis tamponu ile denge) ve 30 200,000 xg'de dk ve 4 ° C SW41 Ti roto in için santrifüjr.
- Dört 15 ml Falcon tüpleri (sakaroz yastık parçaları aktarılmasını önlemek) içine çözünür protein kompleksleri içeren degrade üst aktarın, bunların her biri için% 0.5 bir nihai konsantrasyonu 350 ul% 10 Triton X-100 eklemek, dikkatlice karıştırın ve 7 ml her biri bir toplam hacme lizis tamponu ilave edin.
(Taze 1.5 ml bir konik boru (Eppendorf tüpleri) ve 70 ul 2 x SDS numune tamponu (% 4 SDS, 125 mM Tris-HCl (pH 6,8),% 20 gliserol, her biri 10 eklemek transfer çözünür hücre özütü 70 ul % 2-merkaptoetanol), SDS-PAGE ve immunoblot analizi için her biri için.) - Sakaroz yastıkları atılır ve 3 ml lizis tamponu içinde her bir zar pelet tekrar süspansiyon. % 2 bir nihai konsantrasyon için, her biri 1 ml% 10 Triton X-100 ile ekleme, granül çözmek için buz üzerinde sonikasyon, ve her biri 5 ml toplam hacmi ile lizis tamponu ilave edin.
- SW41 Ti İnce borular başka dört adet 6-ml sükroz minderler hazırlayın, adım 2.10 dan çözündüğünü membranların ~ 5 ml sükroz üzerine dikkatle yatıyordu200,000 x g'de ve 4 ° C'de bir SW41 Ti rotor içinde 30 dakika için yastıklar, ve santrifüj.
- Dört adet 15 ml Falcon tüpleri içine zar protein kompleksleri ihtiva eden gradyanı üst aktarın ve taze için her bir 7 ml değerindeki bir son hacim. (Transfer her bir çözünür hücre özütü 70 ul lizis tamponu (% 2 Triton X-100 içeren) ekleyin Eppendorf tüpleri ve SDS-PAGE ve immunoblot analizi için her biri için 70 ul 2 x SDS numune ekleyin.)
3. Immünopresipitasyon
- Pelet Protein, 60 saniye 1,000 x g'de santrifüj ve 4 ile birleştirilmiş antikorlar (adımlar 1.8 ya da 1.9 'dan) ihtiva eden bir Sepharose boncuklar ° C, dikkatli bir şekilde 4 mi lizis tamponu içinde tekrar süspansiyon ve süpernatant boncuk çıkarın. Lizis tampon boncuk dengelemek için iki kez bu adımı yineleyin.
- Lizis tampon ile 8 ml kadar doldurun ve 14 ATP-dopdolu ve ATP-tüketen çözülebilir veya membran protein kompleksleri içeren sekiz 15 ml Falcon tüpleri her süspansiyonu 1 ml aktarmak N-15 ve K-işaretli hücrelerin (adım 2.9 ve 2.12).
- Çökelti protein kompleksleri için bir tüp silindiri üzerinde 4 ° C de 2 saat inkübe edin.
- 1,000 x g'de ve 4, 60 saniye santrifüje edilerek pellet boncuk ° C ve süpernatan atılır. Transferini kolaylaştırmak için boncuk üstüne sıvı bir küçük hacimli bırakın.
- Her Falcon tüp 1.5-ml konik tüpler (Eppendorf tüpleri) için boncuk aktarın. Falcon tüpleri kalan tüm boncuk toplamak için, yavaşça her% 0,1 Triton içeren başka bir 0.8 ml Lizis tampon, vorteks, 1.000 xg ve 4 de 60 saniye santrifüj ° C ekleyin ve Eppendorf tüplere rezidüel boncuklar ile tampon aktarın. Tüp değiş tokuş plastik duvarlarına yapışan proteinler kontaminasyonu önlemek için gereklidir.
- Pelet 15 sn 16,100 x g'de santrifüj ve 4 tarafından boncuk ° C, dikkatli% 0.1 Triton içeren 1.3 ml Lizis tampon süpernatantlar ve tekrar süspansiyon boncuk kaldırmak. Lizis tampon ile iki kez bu adımı yineleyinTriton içeren fer ve iki Lizis tampon eksik Triton ile iyice boncuk yıkayın. Transferini kolaylaştırmak için boncuk üstüne sıvı bir küçük hacimli bırakın.
- Yine plastik duvarlarına yapışan proteinlerin kaldırmak için taze 1.5 ml Eppendorf tüpleri için boncuk aktarın. 1 ml Lizis tamponu eksik Triton ile eski tüpler yıkayın ve taze tüplerine kalan tüm boncuk aktarın.
- 16,100 g'de 15 saniye santrifüj ve 4 ° C, normal bir pipet ile ilk süpernatantlar kaldırın, sonra bir 50-ul Hamilton şırınga ile tamamen kalan süpernatant kaldırmak.
4. Nano-LC-MS/MS için Numune Hazırlama
- Her tüpe 100 ul taze hazırlanmış Elüsyon tampon (8 M üre, 25 mM NH 4 HCO 3) ekleme, 800 rpm'de bir termomikser 10 dk Hamilton şırınga ve inkübe yapışmasını boncuk yıkayın 100 ul Elüsyon tampon kullanmak ve 65 ° C, ve 30 başka bir 20 dakika için ° C. (A çok daha eksiksizilişkili proteinlerin elüsyon% 80 aseton ile% 2 SDS ve daha sonraki çökeltme ile elüsyon yapılarak elde edilir.)
- 16,100 x g ve 25 ° C sıcaklıkta 15 sn için santrifüje 50-ul Hamilton şırınga ile taze tüplere süpernatantlar aktarın.
- Boncuk 50 ul Elüsyon tamponunu ekleyin, Hamilton şırınga yapışmasını boncuk yıkayın ve sırasıyla, kuluçka ve santrifüj adımları 4.1 ve 4.2 tekrarlamak için 50 ul Elüsyon tampon kullanın. Ilgili elüsyonların Sandalye.
(Taze Eppendorf tüpleri Transfer elüsyonların 30 ul, 30 ul 2 SDS-PAGE ve immunoblotting analizler için her x SDS-numune tamponu ekleyin.) - Elüsyonlanan + /-ATP ile tedavi edilen ikinci çökelti bir araya geldiğinde, 14 ve 15 N-N-etiketli aşağıdaki gibi çözünür ve zar proteinleri:
120 ul 15 N / + ATP ve 120 ul 14 N /-ATP
120 ul 14 N / + ATP ve 120 ul 15 N /-ATP
120 ul 15 N / + ATP ve 120 ul 14 N /-ATP <br /> 120 ul 14 N / + ATP ve 120 ul 15 N /-ATP - Taze disülfid bağları (çapraz bağlayıcı de dahil olmak üzere) azaltmak ve 25 de 30 dakika inkübe edilir için dört kombinasyon her birine 6.5 mM, nihai konsantrasyon 1 M DTT hazırlanmış 1.5 ul ekle ° C.
- Taze azaltılmış tiyoller carboxymethylate ve karanlıkta, 25 ° C'de 20 dakika boyunca inkübe 25 mM bir son konsantrasyon 0.6 M iodoacetamide hazırlanmış 10.5 ul ekle.
- 256 ul 40 mM NH 4 HCO 3 ve 4 ul Lys-C (0.1 mikrogram / ul), parafilm ile mühür tüpler ve 37 bir rotasyon tekerlek gecede en az 16 saat süreyle inkübe ° C ekle
- 37, en az 16 saat boyunca bir dönme tekerlek üzerinde 470 ul 20 mM NH 4 HCO 3, 10 ul% 100 asetonitril (% 1 arasında bir nihai konsantrasyon) ve 8 ul tripsin boncuklar ve inkübe ekleme ° C.
- 5 16,100 xg'de dk ve 4 ° C, ve transfer süpernatantlar taze 2 ml Eppendorf küvet için santrifüjleyines. 50 ul 20 mM NH 4 HCO 3,% 0.5 asetik asit, ve ilk süpernatantlar havuz ile eski tüpler yıkayın.
- Tuzsuzlaştırma için bir şırınga ile Empore C 18 malzemeden iki diskler kesme ve 200-ul pipet yerleştirerek C 18-StageTips ev yapımı hazırlamak. Bu şekilde dört 200-ul ipuçları hazırlayın. Punch dört 2 ml Eppendorf tüpleri ve insert ipuçları kapaklarının içine delikler.
- Ön koşul 50 ul Çözelti B ile C-18 StageTips (% 80 asetonitril,% 0.5 asetik asit). 800 gr az 3 dakika ve 25 ° C'de santrifüj
- 100 ul Çözelti A (% 0.5 asetik asit,% 2 asetonitril) ile C-18 StageTips dengelemek. 800 gr az 3 dakika ve 25 ° C'de santrifüj Bir kez bu adımı yineleyin.
- 800 g az 3 dakika, 25 ° C ve 18 C-StageTips ve santrifüj üzerindeki triptik sindirimler (4.9) gelen süpernatanlar, 100 ul yük Tam süpernatan uygulanmıştır kadar bu işlemi tekrarlamaksütunlar.
- 800 g ve 25 ° C de 3 dakika için 100 ul çözelti A Santrifüj ile C-18 StageTips Yıkama Bu adımı iki kez tekrarlayın.
- 800 g az 3 dakika, 25 ° C ve 50 ul Çözelti B Santrifüj ile yeni bir 1.5 ml Eppendorf tüpüne triptik peptidlerin elute Bir kez bu adımı yineleyin. Vac hız tamamlanması için Kuru peptidler.
- İsteğe bağlı: Daha fazla kullanıma kadar -80 parafilm ve mağaza ° C ile mühür Eppendorf tüpleri.
- 20 ul Çözüm ile kurutulmuş peptidler yeniden süspanse edin, A ve bir sonikatör banyosunda iki 15 dakikalık inkubasyon ile kesintiye buz üzerinde en azından 1 saat için inkübe edilir. 16,100 xg, 4 ° C 'de 20 dakika boyunca santrifüje ve nano-LC-MS/MS supernatant geçerlidir.
5. Temsilcisi Sonuçlar
Şekil 2A'da 14 N-etiketli hücre özleri için örnek olarak gösterildiği gibi, HSP70B ve CGE1 hemen hemen sadece ATP durum bağımsız çözünür kesri, lokalizedir. Içindesonication membran bulunan CF o onu parçası makaslar, ve bu nedenle her iki fraksiyonu kontrol yükleme gibi hizmet olarak kontrast, CF1β, çözünür ve membran zenginleştirilmiş kesirler lokalize edilmektedir. Şekil 2B'de gösterildiği gibi, HSP70B benzer miktarlarda 14 N-ATP ve 15 durum bağımsız N-etiketli çözülebilir özler, gelen anti-HSP70B antikorları ile çöktürüldü. Buna karşın, yalnızca küçük HSP70B bundan önceki sonuçları 9 doğrulayan, ATP dolu fraksiyonlar ile karşılaştırıldığında biraz daha büyük miktarlarda ATP-azalmış zar fraksiyonları gelen membran fraksiyonları çöktürüldü. Resim CGE1 CGE1 büyük miktarlarda ATP-tükenmiş çözünür fraksiyonları HSP70B ile birlikte çökelen iken, ATP-dolu çözünür ya da zar fraksiyonları HSP70B ile birlikte çökelen, ve küçük ATP-azalmış zar fraksiyonları edildi.
Sadece ADP durumda HSP70B ile CGE1 etkileşimi de görülmektedirMS analizi: Şekil 3, temsili HSP70B ve MS1 spektrumları ve çözülebilir hücre ekstrelerinden HSP70B antiserumu ile oluşturulan çökeltilerin dan CGE1 peptidler de gösterilmiştir. Şekil 3A'da gösterildiği gibi bir deneyde, çökeltileri ATP ve 15 ATP içeren ekstreler N-etiketli eksik 14 N-etiketli özler karışımlarından edildi. HSP70B peptidin ağır ve hafif etiketli şeklinde eşit yoğunluklarda saptanırken, CGE1 peptid sadece hafif etiketli formu (itibaren-ATP ekstreler) bulundu. Şekil 3B de karşılıklı olarak etiketli çözülebilir hücre ekstreleri karışımlarından elde edilen anti-HSP70B çökeltiden aynı peptidler gösterilmiştir. Bu yine, hafif ve ağır etiketli peptid HSP70B her ikisi için de geçerli iken Buna göre, bu zaman sadece CGE1 peptit (itibaren-ATP özler) ve ağır etiketli formu tespit edildi.
<strong> Şekil 1.. Deneysel akışı. Hücreler metabolik, en az 10 nesiller için 14 N ve 15 N etiketli hasat ve birlikte verilen veya ATP tüketilmiştir. Hücre parçalama protein komplekslerinin sonra isteğe DSP ile (X-bağlantısı) çapraz bağlı olabilir. Parçalanan hücreler daha sonra eriyen ayrılmış (Sol) ve membran zenginleştirilmiş (Pel) fraksiyonları vardır. Hedef proteinler (burada HSP70B) ve bir kontrol proteini (burada CF1β) protein A Sepharose boncukları (siyah) bağlanmış özel antikorlar ile immunoprecipitated edilir. Yıkamadan sonra, çökelen protein elüt ile ya da direkt olarak analiz immunoblotting ile, ya da sırasıyla 14 N-ve 15 + ATP-ATP ve durumları, toplanmış sindirilmiş ve nano-LC-MS/MS ile analiz edilmiştir. Fraksiyonlar N-etiketli Örneğin durumunda 15 N etiketli fraksiyonu ATP tükenmiş burada gösterilir. Kontrol protein Buna göre, ışık ağır etiketli (koyu renkler) yoğunlukları oranı (açık renkler) etiketli peptidlerBu oran özellikle hedef protein (CGE1) ile etkileşim proteinler için çok yüksek olması bekleniyor ise (CF1β), hedef protein (HSP70B) ve non-spesifik bağlı kirletici, biri civarında olmalıdır. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 2. HSP70B immünopresipitasyon için giriş Bir Analizi. Toplam protein çözünür (Sol) ve membran zenginleştirilmiş (Pel) ya ATP (-ATP) tükenmiş veya ATP ve ATP yenilenme sistemi (+ ATP) ile desteklenmiş fraksiyonları elde edildi. Protein ekstreleri% 0.01 bir% 10 SDS-poliakrilamid jeli üzerinde ayrıldı ve HSP70B ve yükleme kontrol CF1β göre CGE1 protein seviyeleri ile immünoblot yoluyla analiz edilmiştir. Immunoprecipitates B Analizi. HSP70B 14 immunoprecipitated N-ve edildi15 çözünebilir N-etiketli ve membran zenginleştirilmiş hücre içeren veya ATP eksik özleri. Immunoprecipitates% 3.3 karşılık Proteinler kontrolü CF1β immunoblotting analiz edildi yükleme için% 10 SDS-poliakrilamid jel ve HSP70B düzeyleri ve CGE1 göreli üzerine ayrıldı. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 3,. Örnek A kütle spektrumu HSP70B ve anti-HSP70B dan CGE1 peptidler çözünür karışık fraksiyonlar (14 N-ATP / 15 N + ATP) üzerinde gerçekleştirildi immunoprecipitates. 14 N ile 15 N etiketli peptid,-ATP ve karşılık gelen Tam MS spektrumları + HSP70B ve co-immunoprecipitated CGE1 sırasıyla ATP devletler, gösterilir. Her iki peptid triply alınır, HSP70B peptid 22 azot atomları, CGE1 pept içeriride 19, karşılıklı deneme (14 N + ATP / 15 N-ATP) sırasıyla bir kitle 7.33 kayması ve 6.33 m / z. B Örnek kütle spektrumları karşılık. + ATP ve-ATP HSP70B ve co-immunoprecipitated CGE1 sırasıyla devletler, buraya gelen aynı 14 N ve 15 N etiketli peptidler, Tam MS spektrumları gösterilmiştir. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
Discussion
Geçici protein-protein etkileşimleri (QUICK-X) yakalamak için bir çapraz adım ve eşitsiz çöktürme verimleri 6 normalleştirmek için bir kontrol Yağış: Biz son zamanlarda HIZLI anlayışın iki iyileştirmeler girmiştik. Burada HIZLI iki fazla iyileştirmeler içeren bir protokol mevcut: birincisi, biz 15 N metabolik etiketleme için SILAC 5 değiştirin. Avantajları 15 N basit inorganik tuz olarak sağlandığı takdirde 15 N metabolik etiketleme, SILAC daha ucuz olmasıdır. Bundan başka, 15 N metabolik etiketleme ile HIZLI birçok bitki, mantar ve bakteri gibi, tüm amino asitler için organizmalar Prototrofik için uygulanabilir. Ve nihayet, SILAC 5,6 doğasında arginin-to-prolin interconversion 15 N etiketli peptidler ölçümü için bir sorun teşkil etmiyor. 15 N proteomik verilerin nicel değerlendirmesi için uygun araçlar için örnekler MSQUANT 12 veya ben vardırOMIQS 13.
İkinci olarak, özellikle bir karşı bir örnek olarak, belirli bir hedef proteinle etkileşime protein miktarını azaltmak için bir vasıta olarak yakınlık modülasyon tanıtmak. Bu yaklaşımın avantajı, bir model sistemlerini oluşturmak için zor olan ya da tüm proteinler, elzem hedef durumunda üretilen edilemez devirme mutant inşasında circumvents olduğunu vardır. Ayrıca, potansiyel bir hedef protein yikiyor için hücre bir tepki olarak ortaya çıkan diferansiyel protein ekspresyonu neden yanlış yorumlamaları önler: diğer proteinlerin yanı aşağı-regüle ve immünopresipitasyon için kullanılan antiserum ile çapraz reaksiyona, onlar yorumlanır hedef proteinin gerçek etkileşim ortakları olarak. Son olarak, afinite modülasyon uygun bir antikor-antijen ile-bulma oranı olan ihtiyacı ortadan kaldırmaktadır.
Biz model organizma olarak Chlamydomonas reinhardtii bizim protokol uygulanmasına rağmen, Kolayca hücre kültürü içinde yetiştirilen ve azot kaynağı olarak amonyum nitrat ya da kullanabilir edilebilir herhangi bir diğer organizma için adapte edilebilir. ATP / ADP protein komplekslerinin Affinity modülasyon doğrudan doğruya GroEL/HSP60/Cpn60 ya da HSP90 şaperon sistemleri 14,15 gibi olan etkileşimi ve kohort substrat proteinleri ile ATP durumuna göre değişir diğer şaperonlar uygulanabilir, ya da herhangi bir diğer sistem ile yer edilebilir bağlanma afiniteleri ATP tarafından modüle edilir. Afinite modülasyon aynı zamanda protein etkileşimi ile afiniteleri HSP90 sistemleri 15 söz konusu olduğunda radicicol veya geldanamycin gibi belirli ilaç ile değiştirilmiş olduğu durumlarda için çalışması gerekir.
Bizim protokol açık bir sınırlama gerektirir olmasıdır afiniteyle saflaştırılmış özel bir tedavi / ortağı proteinleri olan yakınlığından modüle ilaca duyarlı olduğu bilinen bir hedef proteine karşı antikorlar. Bu nedenle, herhangi bir yüksek hacimli bir yöntemdir.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Biz CF1β karşı antiserum için Olivier Vallon ederim. Bu çalışma Max Planck Topluluğu ve Deutsche Forschungsgemeinschaft (Schr 617/5-1) ve Bundesministerium für Bildung und Forschung (Sistem Biyolojisi Girişimi FORSYS, proje GoFORSYS) hibe tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ProteinA Sepharose | Sigma-Aldrich | P3391 | |
| DMP (Dimethyl pimelimidate) | Sigma-Aldrich | D8388 | Store desiccated at -20 °C, dissolve directly before use |
| Protease inhibitor (complete, EDTA-free) | Roche Applied Science | 11873580001 | |
| ATP (Adenosin-5'-triphosphat) | Carl Roth | K054 | |
| Creatine phosphate | Sigma-Aldrich | 27920 | |
| Creatine phosphokinase | Sigma-Aldrich | C7886 | |
| DSP Dithiobis [succinimidyl propionate] | Thermo Sientific | 22585 | Store desiccated at 4 °C |
| 15NH4Cl | Cambridge isotope laboratories, Andover, MA | NLM-467 | |
| Lys-C (Endoproteinase Lys-C) |
Roche Applied Science | 11047825001 | |
| Trypsin beads (Poroszyme Immobilized Trypsin) | Applied Biosystems | 2-3127-00 | Mix vigorously directly before use |
| Empore C18 47 mm Disk | Varian | 12145004 |
References
- Perrakis, A., Musacchio, A., Cusack, S., Petosa, C. Investigating a macromolecular complex: the toolkit of methods. J. Struct. Biol. 175, 106-112 (2011).
- Gavin, A. C., Maeda, K., Kuhner, S. Recent advances in charting protein-protein interaction: mass spectrometry-based approaches. Curr. Opin. Biotechnol. 22, 42-49 (2011).
- Markham, K., Bai, Y., Schmitt-Ulms, G. Co-immunoprecipitations revisited: an update on experimental concepts and their implementation for sensitive interactome investigations of endogenous proteins. Anal. Bioanal. Chem. 389, 461-473 (2007).
- Selbach, M., Mann, M. Protein interaction screening by quantitative immunoprecipitation combined with knockdown (QUICK. Nat Methods. 3, 981-983 (2006).
- Ong, S. E., Mann, M. A practical recipe for stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC). Nat Protoc. 1, 2650-2660 (2006).
- Heide, H. Application of quantitative immunoprecipitation combined with knockdown and cross-linking to Chlamydomonas reveals the presence of vesicle-inducing protein in plastids 1 in a common complex with chloroplast HSP90C. Proteomics. 9, 3079-3089 (2009).
- Nordhues, A., Miller, S. M., Muhlhaus, T., Schroda, M. New insights into the roles of molecular chaperones in Chlamydomonas and Volvox. International review of cell and molecular biology. 285, 75-113 (2010).
- Mayer, M. P., Bukau, B. Hsp70 chaperones: cellular functions and molecular mechanism. Cell Mol. Life Sci. 62, 670-684 (2005).
- Schroda, M., Vallon, O., Whitelegge, J. P., Beck, C. F., Wollman, F. A. The chloroplastic GrpE homolog of Chlamydomonas: two isoforms generated by differential splicing. The Plant Cell. 13, 2823-2839 (2001).
- Willmund, F., Schroda, M. HEAT SHOCK PROTEIN 90C is a bona fide Hsp90 that interacts with plastidic HSP70B in Chlamydomonas reinhardtii. Plant Physiol. 138, 2310-2322 (2005).
- Harris, E. H. The Chlamydomonas Sourcebook: Introduction to Chlamydomonas and Its Laboratory Use. , Elsevier, Academic Press. San Diego, CA. (2008).
- Mortensen, P. MSQuant, an open source platform for mass spectrometry-based quantitative proteomics. J. Proteome Res. 9, 393-403 (2010).
- M?hlhaus, T., Weiss, J., Hemme, D., Sommer, F., Schroda, M. Quantitative Shotgun Proteomics Using a Uniform 15N-Labeled Standard to Monitor Proteome Dynamics in Time Course Experiments Reveals New Insights into the Heat Stress Response of Chlamydomonas reinhardtii. Mol. Cell Proteomics. 10, (2011).
- Bukau, B., Horwich, A. L. The Hsp70 and Hsp60 chaperone machines. Cell. 92, 351-366 (1998).
- Wandinger, S. K., Richter, K., Buchner, J. The Hsp90 chaperone machinery. J. Biol. Chem. 283, 18473-18477 (2008).
