Summary
Vi presenterar en variation av QUICK (Quantitative Immunoprecipitation kombination med Knockdown) strategi som infördes tidigare att skilja mellan sanna och falska protein-protein interaktioner. Vår strategi bygger på
Abstract
Protein-proteininteraktioner är grundläggande för många biologiska processer i cellen. Därför spelar deras karakterisering en viktig roll i aktuell forskning och en uppsjö av metoder för sin undersökning finns 1. Protein-proteininteraktioner är ofta mycket dynamiska och kan bero på subcellulär lokalisering, post-translationella modifieringar och den lokala proteinet miljön 2. Därför bör de undersökas i sin naturliga miljö, där samtidig immunoprecipitation metoder är den metod som föredras 3. Samutfälld interaktion partners identifieras antingen genom immunoblotting i en målinriktad strategi, eller med masspektrometri (LC-MS/MS) i en oriktade sätt. Den senare strategin ofta påverkas negativt av ett stort antal falska positiva upptäckter, härrör huvudsakligen från den höga känsligheten hos moderna masspektrometrar som tryggt upptäcka spår av ospecifikt utfällande proteiner. En recent strategi för att övervinna detta problem är baserad på tanken att reducerade mängder av specifika interaktionspartner kommer samfällning med ett givet målprotein vars cellulär koncentration reduceras med RNAi, medan mängderna av ospecifikt utfällande proteiner bör vara opåverkad. Detta tillvägagångssätt, som kallas QUICK för kvantitativ Immunoprecipitation kombination med Knockdown 4, använder stabila isotopen Märkning av aminosyror i cellkultur (SILAC) 5 och MS att kvantifiera mängden protein immunfälldes från vildtyp och knock-down stammar. Proteiner som finns i ett förhållande av 1:1 kan betraktas som föroreningar, de anrikas i fällningar från vildtypen som specifika interaktion partner målproteinet. Även innovativa bär QUICK vissa begränsningar: för det första, är SILAC kostsamma och begränsade till organismer som helst är auxotrofa för arginin och / eller lysin. Dessutom, när tunga arginin matas, arginin-till-prolin interomvandling leder additional massa skiftar för varje prolin i en peptid och något späder tung med ljus arginin, vilket gör kvantifiering mer tråkiga och mindre exakt 5,6. Det andra, kräver snabb att antikroppar titreras så att de inte blir mättad med målprotein i extrakt från knock-down mutanter.
Här presenterar vi ett modifierat QUICK protokoll som övervinner de ovan nämnda begränsningarna i Quick genom att ersätta SILAC för 15 N metabolisk märkning och genom att ersätta RNAi-medierad knock-down för affinitet modulering av protein-protein interaktioner. Vi visar tillämpningen av detta protokoll att använda encelliga grönalger Chlamydomonas reinhardtii som modell organism och kloroplasten HSP70B förkläde som målprotein 7 (Figur 1). HSP70s är kända för att interagera med specifika co-chaperoner och substrat endast i ADP staten 8. Vi utnyttjar den här egenskapen som ett sätt att kontrollera de särskildainteraktion HSP70B med dess nukleotid utbyte faktor CGE1 9.
Protocol
1. Antikropp Adsorption
- Väg ut 120 mg protein A-Sepharose i en 15-ml koniskt rör (Falcon). Som 15 mg protein A sefaros behövs för varje immunfällning (IP) detta belopp är tillräckligt för 8 IP-adresser. Tillsätt 5 ml 0,1 M fosfatbuffert (pH 7,4) och låt den Protein A Sepharose svälla under 30 min vid 4 ° C.
(Observera att alla steg från denna punkt på måste utföras med handskar för att undvika kontaminering med keratin och på is för att undvika proteinnedbrytning / komplex dissociation.)
- Centrifugera i 60 sekunder vid 1.000 x g och 4 ° C för att pelletera den svällda Protein A Sepharose. Ta försiktigt bort supernatanten och återsuspendera pärlorna i 5 ml 0,1 M fosfatbuffert (pH 7,4). Upprepa detta steg tre gånger för att tvätta pärlorna ordentligt.
- Efter det sista centrifugeringssteget, avlägsna supernatanten och lämnar ungefär 0,5 ml fosfatbuffert. Lägg 0,9 ml 0,5 M fosfatbuffert (pH 7,4), 400il affinitetsrenade primära antikroppar (50 | il per IP) mot målproteinet (här HSP70B), och 16 pl antikroppar mot en kontroll-protein (här CF1β). Fyll upp med DDH 2 O till en total volym av 5 ml.
(Observera att affinitetsrenade antikroppar bör användas för att minska föroreningen av ospecifika IgG, som stör nano-LC-MS-analys - för ett protokoll se Willmund m.fl. (2005) 10 CF1β fälls ut som en belastning kontroll och valdes.. eftersom det är riklig och, efter cellys, närvarande i lösliga och membranfraktioner. Alternativt kan nivåer av kontaminerande proteiner kan användas för att normalisera för ojämn belastning.)
- Tillåt Protein A Sepharose-pärlor att adsorbera IgG under en 1-h inkubation vid 25 ° C på ett rör vals (CAT RM5W, 36 varv per minut).
- Centrifugera i 60 sekunder vid 1.000 x g och 4 ° C för att pelletera Protein A Sepharose pärlor. Ta försiktigt bort supernatanten och resuspend pärlorna i 5 ml 0,1 M natriumboratbuffert (pH 9,0). Upprepa detta steg tre gånger att grundligt ta bort aminer som skulle släcka tvärbindningsmedlet.
- Väg ut 25,9 mg färsk, fast dimethylpimelimidate och återsuspendera den i 5 ml 0,1 M natriumboratbuffert (pH 9,0) för att erhålla en slutlig koncentration av 20 mM. Tillsätt denna lösning till den Protein A Sepharose pärlor.
- Tillåt IgG att tvärbinda till protein A under 30 minuter vid 25 ° C på ett rör vals.
- Centrifugera i 60 sekunder vid 1.000 x g och 4 ° C för att pelletera pärlorna. Ta försiktigt bort supernatanten och återsuspendera pärlorna i 5 ml 1 M Tris-HCl (pH 7,5) för att släcka fri tvärbindningsmedel. Upprepa detta steg en gång och inkubera under 2 timmar vid 25 ° C eller 12-24 h vid 4 ° C på ett rör vals.
- Valfritt: Om Protein A Sepharose pärlor kopplade till IgG inte direkt används för IP, förvaring för upp till en vecka är möjlig. För detta, centrifugera i 60 sekunder vid 1000 x g och 4 ° C för pelletering av pärlorna, försiktigt bort supernatant och återsuspendera pärlorna i 5 ml 0,1 M fosfatbuffert (pH 7,5) innehållande 0,02% natriumazid och förvara vid 4 ° C tills vidare användning.
2. Cellys, tvärbindning och Provberedning
- Grow två Chlamydomonas kulturer i medium innehållande 7,5 mM 14 NH 4 Cl eller 15 NH 4 Cl som kvävekälla till en densitet av ~ 5 x 10 6 celler / ml. Celler behöver passera minst tio generationer för fullständig märkning. Här odlades celler photomixotrophically i TAP-medium 11 på en roterande skakapparat vid 25 ° C under kontinuerlig bestrålning med vitt ljus (30 μE m -2 s -1).
- Överföra två alikvoter vardera 14 N-och 15 N-märkta celler till fyra GSA rör och celler skörd av en 4-minuters centrifugering vid 4.000 x g och 4 ° C (Cellantalet skördades för varje alikvot beror på den cellulära koncentrationen av målet protein och måste avgöras empirically i förväg för att säkerställa att tillräcklig målprotein fälls. En bra utgångspunkt är 10 9 celler per alikvot, dvs 200 ml av en kultur med 5 x 10 6 celler / ml.)
För tvärbindning endast ifall protein-komplex kommer att tvärbindas före IP celler måste tvättas för att avlägsna aminer närvarande i mediet. För detta, återsuspendera celler i 40 ml i förväg kyld KH-buffert (20 mM HEPES-KOH (pH 7,2), 80 mM KCl) och överföra dem till 50-ml Falcon-rör. Centrifugera i 60 sekunder vid 1.000 x g och 4 ° C. Upprepa detta steg en gång. - Återsuspendera cellerna i 2 ml lysbuffert (20 mM HEPES-KOH (pH 7,2), 1 mM MgClj 2, 10 mM KCl, 154 mM NaCl) förkyld till 4 ° C och överföra dem till 15-ml Falcon-rör. Samla kvarvarande celler i GSA-rör med en ytterligare 1 ml lyseringsbuffert vardera. Tillsätt 50 | il 25 x proteasinhibitor och 12,5 pl 1 M MgClj 2 (till en slutlig koncentration av 3,5 mM) till varje alikvot.
- Tillsätt 150il lyseringsbuffert, 12,5 pl 1 M ATP, 833 ^ il 270 mM kreatinfosfat och 7 pl 5 ug / ul kreatinfosfokinas (den slutliga koncentrationen är 2,5 mM ATP, 45 mM kreatinfosfat, och 7 pg / ml kreatinfosfokinas) till en av alikvoterna innehållande 14 N-och 15 N-märkta celler (dessa är + ATP alikvoter).
- Lägg 930 pl lyseringsbuffert och 70 pl 1 U / ^ il apyras till de andra alikvoter innehållande 14 N-och 15 N-märkta celler (dessa är-ATP alikvoter).
- Inkubera under 2 minuter vid 25 ° C på ett rör rullen att etablera ATP-uttömma och ATP-fylld tillstånd. Om tvärbindningssteget utelämnas, lägga till ytterligare 1 ml lyseringsbuffert.
För tvärbindning endast ifall de undersökta protein-proteininteraktioner är övergående är det tillrådligt att fånga dem genom ett tvärbindande steg. För detta, tillsätt 500 pl 20 mM ditio-bis (succinimidylpropionat) (DSP) löst i DMSO (slutlig koncentration är 2 mM) till earje rör direkt före sonikering. - Sonikera fyra gånger 20 sekunder på is för att bryta celler med 20-sek pauser mellan för kylning. (Vi använder Bandelin Sonoplus HD2070 med en KE76 tips på utgång styrning av 75% och kapacitet på 60%. De nödvändiga inställningarna för andra maskiner / apparater / tips måste fastställas i förväg för att säkerställa fullständig cellys och undvika spill. )
För tvärbindning endast tillåta protein-komplex för att tvärbinda genom inkubering under 1 timme vid 4 ° C på ett rör vals. Efter tvärbindning, komplettera varje rör med 500 pl 1 M glycin och inkubera på ett rör vals för ytterligare 15 min vid 4 ° C för att släcka fri tvärbindningsmedel. - Förbered fyra 6-ml sackaros kuddar (20 mM HEPES-KOH (pH 7,2), 0,6 M sackaros) i SW41 Ti tunnväggig rör (Beckman Coulter Artikelnr: 344.059), låg försiktigt hela ~ 5,5 ml cellysat på sackaros kuddar (balans med lyseringsbuffert) och centrifugera i 30 minuter vid 200.000 x g och 4 ° C i en SW41 Ti rotor.
- Överför den övre delen av gradienten innehåller lösliga proteinkomplexen i fyra 15-ml Falcon-rör (undvika att överföra delar av sackaroskudde), tillsätt 350 pl 10% Triton X-100 till en slutlig koncentration av 0,5% till var och en av dem, blanda noggrant och lägga Lysbuffert till en total volym av 7 ml vardera.
(Överföring 70 | il av varje lösligt cellextrakt till färska 1,5-ml koniska rör (Eppendorf-rör) och tillsätt 70 pl 2 x SDS-provbuffert (4% SDS, 125 Tris-HCl (pH 6,8) mM, 20% glycerol, 10 % 2-merkaptoetanol) till vardera för SDS-PAGE och immunoblot analys.) - Kassera sackaros kuddar och resuspendera membran pellets i 3 ml lysbuffert vardera. Tillsätt till varje 1 ml 10% Triton X-100 till en slutlig koncentration av 2%, sonikera på is för att lösa pellets och lägga lyseringsbuffert till en total volym av 5 ml vardera.
- Förbered ytterligare fyra 6-ml sackaros kuddar i SW41 Ti tunnväggiga rör, låg ~ 5 ml av solubiliserade membran från steg 2,10 försiktigt på sackaroskuddar, och centrifugera i 30 minuter vid 200.000 x g och 4 ° C i en SW41 Ti-rotor.
- Överför den övre delen av gradienten innehåller komplexen membranprotein i fyra 15-ml Falcon-rör och tillsätt lyseringsbuffert (innehållande 2% Triton X-100) till en slutlig volym av 7 ml vardera. (Överföring 70 | il av varje lösligt cellextrakt till färskt Eppendorf-rör och lägga 70 pl 2 x SDS-prov i varje för SDS-PAGE och analys immunoblot.)
3. Immunutfällning
- Pellets protein A Sepharose-pärlor som innehåller kopplade antikroppar (från steg 1,8 eller 1,9) med en 60-sek centrifugering vid 1.000 xg och 4 ° C, försiktigt bort supernatanten och återsuspendera pärlorna i 4 ml lyseringsbuffert. Upprepa detta steg två gånger till jämvikt pärlor i lyseringsbuffert.
- Fyll upp till 8 ml med lyseringsbuffert och överför 1 ml av suspensionen till vardera av de åtta 15-ml Falcon-rör innehållande lösliga eller membran proteinkomplex från ATP-fylld och ATP-bryter 14 15 N-märkta celler (från steg 2,9 och 2,12).
- Inkubera under 2 timmar vid 4 ° C på ett rör rullen att komplex utfällning protein.
- Pelletera pärlorna genom en 60-sek centrifugering vid 1.000 x g och 4 ° C och kasta supernatanterna. Lämna en liten volym av vätska på toppen av pärlorna för att underlätta överföringen.
- Överför pärlorna från varje Falcon-rör till 1,5-ml koniska rör (Eppendorf-rör). Att samla alla kvarvarande kulor i Falcon-rör, lägga till ytterligare 0,8 buffert ml Lysis innehållande 0,1% Triton till varje, virvel försiktigt, centrifugera i 60 sekunder vid 1000 x g och 4 ° C och överför bufferten med kvarvarande kulor till Eppendorf-rör. Rör utbyte är nödvändig för att förhindra föroreningar från proteiner som ansluter sig till plast väggar.
- Pellets pärlorna med en 15-sek centrifugering vid 16.100 xg och 4 ° C, försiktigt bort supernatanterna och återsuspendera pärlor i 1,3 ml lysbuffert innehållande 0,1% Triton. Upprepa detta steg två gånger med lys buffer innehåller Triton och två gånger med lysbuffert saknar Triton att tvätta pärlorna. Lämna en liten volym av vätska på toppen av pärlorna för att underlätta överföringen.
- Återigen överför pärlorna till färska 1,5-ml Eppendorf-rör för att avlägsna proteiner som vidhäftar till plastväggarna. Tvätta de gamla rören med 1 ml lyseringsbuffert saknar Triton och överföra alla återstående pärlor till nya rör.
- Centrifugera i 15 sekunder vid 16.100 xg och 4 ° C, avlägsna supernatanterna först med en vanlig pipett sedan försiktigt bort återstående supernatanten helt med en 50-ul Hamilton spruta.
4. Provberedning för nano-LC-MS/MS
- Tillsätt 100 | il nyberedd Elueringsbuffert (8 M karbamid, 25 mM NH 4 HCO 3) till varje rör, använd 100 pl Elueringsbuffert att tvätta bort pärlorna klibbar till Hamilton-sprutan och inkubera under 10 min i en Thermomixer vid 800 rpm och 65 ° C, och under ytterligare 20 min vid 30 ° C. (En mycket mer kompletteluering av bundna proteiner uppnås genom eluering med 2% SDS och efterföljande utfällning med 80% aceton.)
- Centrifugera i 15 sekunder vid 16.100 x g och 25 ° C. Överför supernatanter till nya rör med en 50-pl Hamilton-spruta.
- Tillsätt 50 | il Elueringsbuffert till pärlorna, använd 50 pl Elueringsbuffert att tvätta bort pärlorna klibbar till Hamilton spruta och upprepa inkubation och centrifugering steg 4,1 och 4,2, respektive. Poolen respektive eluat.
(Överföring 30 pl av eluaten till färska Eppendorf-rör, tillsätt 30 | il 2 x SDS-provbuffert till varje för SDS-PAGE och immunoblot analys.) - Kombinera det eluerade fällningar från + /-ATP-behandlade, 14 N-och 15 N-märkt lösliga proteiner och membranproteiner enligt följande:
120 pl 15 N / + ATP och 120 ul 14 N /-ATP
120 pl 14 N / + ATP och 120 ul 15 N /-ATP
120 ul 15 N / + ATP och 120 ul 14 N /-ATP <br /> 120 ul 14 N / + ATP och 120 ul 15 N /-ATP - Lägg 1,5 pl nyframställd 1 M DTT till en slutlig koncentration av 6,5 mM till var och en av de fyra kombinationerna att reducera disulfidbindningar (inklusive de i tvärbindningsmedlet) och inkubera under 30 minuter vid 25 ° C.
- Lägg 10,5 pl nyframställd 0,6 M jodacetamid till en slutlig koncentration av 25 mM för att carboxymethylate de reducerade tioler och inkubera under 20 minuter vid 25 ° C i mörker.
- Lägg 256 pl 40 mM NH 4 HCO 3 och 4 pl Lys-C (0,1 pg / pl), rör tätning med parafilm, och inkubera under minst 16 timmar över natten på en rotation hjul vid 37 ° C.
- Lägg 470 pl 20 mM NH 4 HCO 3, 10 | il 100% acetonitril (till en slutlig koncentration av 1%) och 8 pl pärlor trypsin, och inkubera på en rotation hjul under minst 16 timmar vid 37 ° C.
- Centrifugera i 5 minuter vid 16.100 xg och 4 ° C och överför supernatanter färskt 2-ml Eppendorf tubes. Tvätta de gamla rören med 50 pl 20 mM NH 4 HCO 3, 0,5% ättiksyra, och poolen med första supernatanter.
- För avsaltning, förbereda hemlagad C 18-StageTips genom att skära ut två skivor från Empore C 18 material med en spruta nål och placera dem i en 200-fil pipettspets. På detta sätt förbereder fyra 200-il tips. Stansa hål i locken på fyra 2-ml Eppendorf-rör och tips Infoga.
- Förutsättning C 18-StageTips med 50 pl Lösning B (80% acetonitril, 0,5% ättiksyra). Centrifugera under 3 min vid 800 g och 25 ° C.
- Jämvikta C 18-StageTips med 100 pl Lösning A (0,5% ättiksyra, 2% acetonitril). Centrifugera under 3 min vid 800 g och 25 ° C. Upprepa detta steg en gång.
- Fyll 100 il av supernatanterna från de tryptiska digereringar (4,9) på C 18-StageTips och centrifugera under 3 min vid 800 g och 25 ° C. Upprepa detta steg tills hela supematantema tillämpaskolumnerna.
- Tvätta C 18-StageTips med 100 pl Lösning A. Centrifugera under 3 min vid 800 g och 25 ° C. Upprepa detta steg två gånger.
- Eluera tryptiska peptider in i en ny 1,5-ml Eppendorf-rör med 50 pl lösning B. Centrifugera under 3 min vid 800 g och 25 ° C. Upprepa detta steg en gång. Torra peptider till fullbordan i en Speed Vac.
- Tillval: tätning Eppendorf-rör med parafilm och förvara vid -80 ° C tills vidare användning.
- Återsuspendera de torkade peptider med 20 pl lösning A och inkubera under åtminstone 1 timme på is, avbruten av två 15-min inkubationer i en sonikator bad. Centrifugera i 20 minuter vid 16.100 x g och 4 ° C och supernatanten tillämpa för nano-LC-MS/MS.
5. Representativa resultat
Som visas föredömligt för 14 N-märkta cellextrakt i figur 2A är HSP70B och CGE1 nästan uteslutande lokaliserad till den lösliga fraktionen, oberoende av ATP-staten. IDäremot CF1β är lokaliserad till lösliga och membran-anrikat fraktioner som sonikering sax del av det från membran belägen-CF O, och därför fungerar som Lastkontroll för båda fraktioner. Såsom visas i figur 2B, har liknande mängder HSP70B utfälldes med anti-HSP70B antikroppar från 14 N-och 15 N-märkta lösliga extrakt, oberoende av ATP-staten. I motsats, hade endast liten HSP70B utfälles från membranfraktioner med något större mängder härrör från ATP-utarmade membranfraktioner jämfört med ATP fylld fraktioner därmed bekräftar tidigare resultat 9. Ingen CGE1 har samutfälldes med HSP70B i ATP-fylld lösliga eller membran fraktioner, medan stora mängder CGE1 gavs samtidigt ut med HSP70B från ATP utarmade-lösliga fraktioner, och lite från ATP-utarmade membranfraktioner.
Samspelet mellan CGE1 med HSP70B endast i ADP Staten är också iakttas iMS-analys: i fig 3, som är representativt MS1 spektra för HSP70B och CGE1 peptider från fällningar genereras med HSP70B antiserum från lösliga cellextrakt visas. I experimentet som visas i figur 3A, fällningar från blandningar av 14 N-märkta extrakt saknar ATP och 15 ^ N-märkt extrakt innehållande ATP. Medan den tunga och lätta märkt form av HSP70B peptiden detekterades med lika intensiteter, var endast ljuset märkt form av CGE1 peptiden (från-ATP extrakt) hittades. I figur 3B samma peptider från anti-HSP70B fällning som härrör från blandningar av ömsesidigt märkta lösliga cellextrakt visas. Därför denna gång endast den tunga märkt formen av CGE1 peptid (från-ATP extrakt) upptäcktes, medan detta var återigen fallet för både lätta och tunga märkta peptider HSP70B.
<strong> Figur 1. Experimentella arbetsflöde. Celler metaboliskt märkta med 14 N och 15 N för minst 10 generationer, skördas och levereras med eller utarmat från ATP. Efter protein cellys komplex kan eventuellt tvärbunden (X-länk) med DSP. Lyserade celler separeras sedan i löslig (Sol) och membran berikade (Pel) fraktioner. Målproteiner (här HSP70B) och en kontroll protein (här CF1β) är immunoutfälldes med specifika antikroppar kopplade till protein A Sepharose-pärlor (svart). Efter tvättning utfällda proteiner elueras och antingen direkt analyserades genom immunoblotting, eller respektive 14 N-och 15 N-märkta fraktionerna i + ATP och ATP-stater poolas, digereras och analyseras av nano-LC-MS/MS. I exemplet visade fallet här 15 N-märkt fraktionen utarmat från ATP. Följaktligen är förhållandet av intensiteter av tunga märkta (mörka färger) för att tända märkta (ljusa färger) peptider från kontroll-proteinet(CF1β) målproteinet (HSP70B) och ospecifikt bundna föroreningar bör vara cirka en, medan detta förhållande förväntas vara mycket hög för proteiner specifikt interagerar med målproteinet (CGE1). Klicka här för att se större bild .
Figur 2. En analys av ingången för HSP70B immunoutfällning. Totalt protein extraherades från lösligt (Sol) och membran anrikad (Pel) fraktioner antingen uttömda från ATP (-ATP) eller kompletteras med ATP och ett ATP regenererande system (+ ATP). 0,01% av proteinextrakt separerades på en 10% SDS-polyakrylamidgel, och nivåer av HSP70B och CGE1 protein i förhållande till Lastkontroll CF1β analyserades genom immunoblotting. B Analys av immunoprecipitat. HSP70B immunoutfälldes från 14 N-och15 N-märkt lösligt och membran-anrikad cellextrakten innehållande eller saknar ATP. Proteiner motsvarande 3,3% av det immunoprecipitat separerades på en 10% SDS-polyakrylamidgel och nivåer av HSP70B och CGE1 förhållande till Lastkontroll CF1β analyserades genom immunoblotting. Klicka här för att se större bild .
Figur 3. En representant masspektra för HSP70B och CGE1 peptider från anti-HSP70B immunfällningar utförs på blandade lösliga fraktioner (14 N-ATP / 15 N + ATP). Fullt MS-spektra av 14 N och 15 N märkta peptider, motsvarande-ATP och + ATP-stater, respektive från HSP70B och co-immunoutfällda CGE1 visas. Båda peptiderna triply debiteras innehåller HSP70B peptiden 22 kväveatomer, den CGE1 Peptid 19, vilket motsvarar en massförskjutning av 7,33 och 6,33 m / z, respektive. B-representant masspektra från det reciproka försöket (14 N + ATP / 15 N-ATP). Fullständig MS-spektra av samma 14 N och 15 N märkta peptider, här motsvarande + ATP och ATP stater, respektive från HSP70B och co-immunoutfällda CGE1 visas. Klicka här för att se större bild .
Discussion
Vi har nyligen infört två förbättringar QUICK tillvägagångssättet: en tvärbindande steg för att fånga övergående protein-protein interaktioner (QUICK-X) och en kontroll fällning att normalisera för ojämlika nederbörd effektivitetsvinster 6. Här presenterar vi ett protokoll som innehåller två fler förbättringar av Quick: för det första ersätter vi SILAC 5 för 15 N metabolisk märkning. Fördelarna är att 15 N metabolisk märkning är mycket billigare än SILAC, om 15 N tillhandahålles som enkel oorganiskt salt. Vidare, med 15 N metabolisk märkning SNABB kan tillämpas på organismer prototrofa för alla aminosyror, som de flesta växter, svampar och bakterier. Och slutligen, inte medför arginin till prolin omvandling inneboende SILAC 5,6 inte ett problem för kvantifiering av 15 N märkta peptider. Exempel på lämpliga verktyg för kvantitativ utvärdering av 15 N proteomik data MSQUANT 12 eller jagOMIQS 13.
Det andra introducerar vi affini modulering som ett medel för att specifikt reducera mängden av proteiner som interagerar med ett givet målprotein i ett prov mot en annan. Fördelarna med detta tillvägagångssätt är att det kringgår konstruktionen av knockdown mutanter, som för vissa modellsystem är svåra att generera eller inte kan genereras alls vid väsentliga målproteiner. Dessutom undviker man feltolkningar orsakade av differentiell proteinexpression potentiellt förekommer som ett svar av cellen till knackning-ner ett målprotein: om andra proteiner är nedreglerade samt och korsreagerar med antiserumet som används för immunoutfällning, skulle de tolkas som sanna interaktionspartner av målproteinet. Äntligen avskaffas affinitet modulering behovet av att hitta en lämplig antikropp till antigen förhållande.
Även om vi tillämpar vår protokoll till Chlamydomonas reinhardtii som modellorganism, Kan den lätt anpassas till någon annan organism som kan odlas i cellkultur och kan använda ammonium-eller nitrat som kvävekälla. Affinity modulering av proteinkomplex med ATP / ADP kan direkt tillämpas på andra kaperoner vars interaktion med substrat och proteiner kohort beror på ATP tillståndet, liksom de GroEL/HSP60/Cpn60 eller HSP90 eskortering system 14,15, eller till något annat system där bindningsaffiniteter moduleras av ATP. Affinity modulering bör också arbeta för fall där tillhörighet bland proteininteraktioner ändras genom specifika läkemedel, som radicicol eller geldanamycin i fallet med Hsp90 system 15.
En tydlig begränsning av vår protokollet är att den kräver affinitetsrenade antikroppar mot ett målprotein känd för att vara känslig för en särskild behandling / läkemedel som modulerar dess affinitet för partner proteiner. Därför är det ingen hög genomströmning metod.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi tackar Olivier Vallon för antiserum mot CF1β. Detta arbete stöddes av Max Planck-sällskapet och bidrag från Deutsche Forschungsgemeinschaft (Schr 617/5-1) och Bundesministerium für Bildung und Forschung (systembiologi Initiative FORSYS, projektledare GoFORSYS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ProteinA Sepharose | Sigma-Aldrich | P3391 | |
| DMP (Dimethyl pimelimidate) | Sigma-Aldrich | D8388 | Store desiccated at -20 °C, dissolve directly before use |
| Protease inhibitor (complete, EDTA-free) | Roche Applied Science | 11873580001 | |
| ATP (Adenosin-5'-triphosphat) | Carl Roth | K054 | |
| Creatine phosphate | Sigma-Aldrich | 27920 | |
| Creatine phosphokinase | Sigma-Aldrich | C7886 | |
| DSP Dithiobis [succinimidyl propionate] | Thermo Sientific | 22585 | Store desiccated at 4 °C |
| 15NH4Cl | Cambridge isotope laboratories, Andover, MA | NLM-467 | |
| Lys-C (Endoproteinase Lys-C) |
Roche Applied Science | 11047825001 | |
| Trypsin beads (Poroszyme Immobilized Trypsin) | Applied Biosystems | 2-3127-00 | Mix vigorously directly before use |
| Empore C18 47 mm Disk | Varian | 12145004 |
References
- Perrakis, A., Musacchio, A., Cusack, S., Petosa, C. Investigating a macromolecular complex: the toolkit of methods. J. Struct. Biol. 175, 106-112 (2011).
- Gavin, A. C., Maeda, K., Kuhner, S. Recent advances in charting protein-protein interaction: mass spectrometry-based approaches. Curr. Opin. Biotechnol. 22, 42-49 (2011).
- Markham, K., Bai, Y., Schmitt-Ulms, G. Co-immunoprecipitations revisited: an update on experimental concepts and their implementation for sensitive interactome investigations of endogenous proteins. Anal. Bioanal. Chem. 389, 461-473 (2007).
- Selbach, M., Mann, M. Protein interaction screening by quantitative immunoprecipitation combined with knockdown (QUICK. Nat Methods. 3, 981-983 (2006).
- Ong, S. E., Mann, M. A practical recipe for stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC). Nat Protoc. 1, 2650-2660 (2006).
- Heide, H. Application of quantitative immunoprecipitation combined with knockdown and cross-linking to Chlamydomonas reveals the presence of vesicle-inducing protein in plastids 1 in a common complex with chloroplast HSP90C. Proteomics. 9, 3079-3089 (2009).
- Nordhues, A., Miller, S. M., Muhlhaus, T., Schroda, M. New insights into the roles of molecular chaperones in Chlamydomonas and Volvox. International review of cell and molecular biology. 285, 75-113 (2010).
- Mayer, M. P., Bukau, B. Hsp70 chaperones: cellular functions and molecular mechanism. Cell Mol. Life Sci. 62, 670-684 (2005).
- Schroda, M., Vallon, O., Whitelegge, J. P., Beck, C. F., Wollman, F. A. The chloroplastic GrpE homolog of Chlamydomonas: two isoforms generated by differential splicing. The Plant Cell. 13, 2823-2839 (2001).
- Willmund, F., Schroda, M. HEAT SHOCK PROTEIN 90C is a bona fide Hsp90 that interacts with plastidic HSP70B in Chlamydomonas reinhardtii. Plant Physiol. 138, 2310-2322 (2005).
- Harris, E. H. The Chlamydomonas Sourcebook: Introduction to Chlamydomonas and Its Laboratory Use. , Elsevier, Academic Press. San Diego, CA. (2008).
- Mortensen, P. MSQuant, an open source platform for mass spectrometry-based quantitative proteomics. J. Proteome Res. 9, 393-403 (2010).
- M?hlhaus, T., Weiss, J., Hemme, D., Sommer, F., Schroda, M. Quantitative Shotgun Proteomics Using a Uniform 15N-Labeled Standard to Monitor Proteome Dynamics in Time Course Experiments Reveals New Insights into the Heat Stress Response of Chlamydomonas reinhardtii. Mol. Cell Proteomics. 10, (2011).
- Bukau, B., Horwich, A. L. The Hsp70 and Hsp60 chaperone machines. Cell. 92, 351-366 (1998).
- Wandinger, S. K., Richter, K., Buchner, J. The Hsp90 chaperone machinery. J. Biol. Chem. 283, 18473-18477 (2008).
